茶树生物技术-基因操作主要技术

基因操作主要技术如何从茶树中克隆某一个已知基因？❀如何分析某一茶树基因的结构？❀如何鉴定某一茶树基因的功能？❀（目的基因的获得）（生物信息学）（基因表达、调节等）一、核酸的提取与纯化如何从茶树中克隆某一个已知基因？❀

核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到后续实验的成败

实验要求：

1.质量高:完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求；

2.方法好：简便快速、安全、经济；

3.材料易得:茶树叶片、根、茎、愈伤组织、培养的细胞和细菌等。茶树细胞1核酸分离、纯化原则（1）

保持核酸分子一级结构的完整性

遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。（2）

分离核酸原则：

1）温度不要过高；

2）控制pH值范围(pH值5-9);3）保持一定离子强度;4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.

核酸完整性的保持：

1.避免过酸和过碱环境，pH在4-10之间

2.避免高温破坏，0-4

C进行；

3.简化步骤，缩短时间，减少破坏；

4.

防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。抑制DNA酶和RNA酶的活性，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。

(1)高速组织捣碎机捣碎

(2)玻璃匀浆器匀浆

(3)超声波处理法

(4)液氮研磨法

(5)化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）

(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）2.组织的破碎3.细胞的裂解CTAB提取缓冲液CTAB：十六烷基三甲基溴化铵。呈白色或浅黄色结晶体至粉末状，有刺激气味，易溶于异丙醇，可溶于水,震荡时产生大量泡沫，能与阳离子、非离子、两性表面活性剂有良好的配位性。具有优良的渗透、柔化、乳化、抗静电、生物降解性及杀菌等性能。CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml（PH8.0）核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。

茶叶中还要注意茶多糖和茶多酚的氧化产物。4.核蛋白的解聚、变性蛋白的去除酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重增大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。水相有机相

（1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。（2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意5.核酸的浓缩

沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。核酸沉淀的盐类及浓度盐贮存液浓度（mol/L)终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8

当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。为了除去共沉淀的盐，如Li+常用70%-75%的乙醇。6.核酸的洗涤7.核酸的沉淀和溶解乙醇优点：

对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：

需要量大，一般要求低温操作。8、核酸的鉴定紫外分光光度法测DNA和RNA的含量和纯度

前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。

结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml。A：测DNA：

纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。

测定结果分析B：测RNA

纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。

1.凝胶电泳法：根据电泳条带的数目、位置和形状判定

RNA分子可以通过荧光强度积分来判定有无降解。

2.其它方法：逆转录法、核酸杂交、芯片检测等。

核酸完整性鉴定：DNA电泳图RNA电泳图9.核酸的保存(1)对DNA

①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA

①RNA样品溶于醋酸钠溶液或焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液中，-70℃保存。②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;

组织的破碎细胞的裂解核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸的浓缩核酸的洗涤核酸的鉴定核酸的保存核酸的分离与纯化的步骤：总结除去蛋白质、多糖、脂类等大分子物质；除去非目的核酸组分除去实验溶液和试剂二、PCR技术聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项在体外合成放大DNA的技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。221983年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖1.PCR技术的发明Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：1.变性(denaturation)

：： 高温使双链DNA解离形成单链 （94℃，30s）2.退火(annealling)： 低温下，引物与模板DNA互补区结 合（55℃，30s）3.延伸(extension)： 中温延伸。DNA聚合酶催化以引物 为起始点的DNA链 延伸反应 （70～72℃，30～60s）。2.PCR技术的基本原理加热变性复性复温PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸1.双链DNA变性（一）PCR的反应过程2.引物与模板DNA退火3.引物延伸DNA合成4.第二轮循环的变性5.第二轮循环的引物延伸DNA合成PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。长产物片段短产物片段PCR扩增产物进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。

“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3反应初期，目的DNA片段呈指数形式增加；随着目的DNA的积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期（25个循环）。PCR扩增反应体系模板DNA--扩增起始底物--影响扩增的特异性和产量引物

--寡核苷酸片段--决定PCR扩增的特异性和长度要求：特异性好（特别是3’端与模板配对）

长度适宜（一般以15bp～30bp为宜）碱基组成分布尽可能随机引物自身或两条引物间无互补结构聚合酶

--耐热DNA聚合酶--活性依赖金属离子作用：有5’-3’链延伸活性（合成方向5’-3’

）有5’-3’外切酶活性无3’-5’外切酶活性（错配率2.1×10-4）

dNTP

--合成DNA的原料变性—通过加热，使双链DNA模板解离成为单链变性温度：由模板DNA双链的G+C含量决定

变性时间：由模板DNA分子的长度来决定退火—温度下降，引物与模板互补碱基结合成双链

温度计算：Tm=4×（G+C）+2（A+T)

温度设置：通常比溶解温度低3-5度延伸—适当温度，DNA聚合酶催化合成新的DNA链

最适温度：72-78℃（TaqDNA聚合酶）

合成速率：2000bp/min

PCR扩增反应过程特异性强引物引物

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。PCR反应的特点39PCR反应的特点灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(mg=10-6)水平简便、快速：PCR反应一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。目的：扩增产生特异长度的单链DNA。

方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究

PCR的类型（1）不对称PCR

高浓度引物低浓度引物N个循环后

用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

未知序列未知序列已知序列（2）反向PCR已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反转录PCR（reversetranscriptionPCR）是一种从RNA反转录扩增cDNA的方法。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA；再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。（3）RT-PCR逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增

锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增。（4）锚定PCRcDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC三、琼脂糖凝胶电泳原理：电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动三、琼脂糖凝胶电泳DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系可依据DNA分子的大小使其分离琼脂糖凝胶中DNA的观察溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下红色荧光利用琼脂糖凝胶电泳如何检测PCR扩增产物？电泳仪电泳槽缓冲液琼脂糖凝胶槽梳子移液器溴酚蓝主要实验器材电泳槽结构凝胶槽操作步骤：琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：倒胶，加梳子样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相1.溶胶2.准备胶槽3.凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml4.铺胶5.凝胶凝固后取出梳子6.加缓冲液7.准备样品8.点样9.电泳注意观察溴酚蓝染液的迁移紫外灯下观察电泳结果10.照相M1234PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpPCR产物的琼脂糖凝胶电泳图如何分析某一茶树基因的结构？❀如何从茶树中克隆某一个已知基因？√茶树中已克隆的功能性基因或mRNA（1）美国国家生物技术信息中心（NCBI）主持的GenBank（

/）世界上三大基因序列数据库：

（3）日本的国家遗传学研究所（NIG）主持的日本DNA数据库DDBJ

（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）

（2）欧洲生物信息学研究所（EBI）主持的EMBL数据库

（http://www.ebi.ac.uk/embl/）GQ229032知道基因的登录号，如何查找该基因的序列信息编码蛋白的氨基酸序列知道基因的序列，如何与数据库中其他基因比对Nucleotideblast输入一段核酸序列atgcccgatttccgt……Camelliasinensis核苷酸序列、氨基酸序列的组成成分及理化性质分析氨基酸序列的比对分析跨膜结构域的预测和分析疏水性/亲水性的预测和分析二级结构的预测和分析功能域的预测和分析已知基因其他方面的生物信息学分析CsICE1的同源比对分析与其他植物的ICE1类蛋白非常相似，与葡萄、苹果、桉树的相似度均为78%，蓖麻77%，毛果杨75%与比对的木本科植物共享SLSTFKSN和SKANS两段保守基序C端保守区域2碱性螺旋-环-螺旋DNA结合域82CsICE1的进化树分析CsICE1与杨树、蓖麻、苹果、大豆和葡萄的ICE1类蛋白分为组Ⅰ组Ⅱ则包括了拟南芥在内的禾本植物组Ⅱ和包括单子叶植物的组M都与CsICE1的亲缘性较远。283CsCBF1的同源比对分析赖氨酸谷氨酸CsCBF1具有CBF类蛋白的保守AP2DNA结合域，和CBF的标志序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR284CsCBF1的进化树分析CsCBF1与苹果、桦树、甘薯、烟草等的CBF同系物分为组ⅰ单子叶植物组M则与前三组有着更远的进化关系拟南芥中的三个CBF基因和油菜的CBF被单独分为一个组（组ⅲ）CsCBF1与组ⅱ（菊花、碧桃、陆地棉、橡胶树和蓖麻）的亲缘性较远285CsICE1和CsCBF1结构分析CsICE1共1964nt，编码蛋白质共518aa，分子量为56.8kDaORF：1557nt3’UTR：407nt共1210nt，编码蛋白质共259aa，分子量为28.3kDaCsCBF1ORF：780nt2如何分析某一茶树基因的结构？如何从茶树中克隆某一个已知基因？√√如何鉴定某一茶树基因的功能？❀基因的定量和检测基因的表达情况四、半定量PCR（RT-PCR）五、实时荧光定量PCR四、半定量PCR（RT-PCR）逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增2n（n：循环数）琼脂糖凝胶电泳（EB染色）GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶。该酶基因为管家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，故被广泛用作抽提totalRNA，poly(A)+RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。常用的内参有，ACTB（β-actin、β-肌动蛋白）、GAPDH或18S等。目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差。22263034五、实时荧光定量PCRrealtime-PCR实时荧光定量PCR与常规PCR的差别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析三个关键词：实时，定量，荧光PCR分四个阶段如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。定量原理

确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量荧光化学SYBRGreen1

TaqManTaqManSYBRGreenI工作原理

SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未结合SYBRGreen1dye变性:无荧光信号SYBRGreenI应用范围起始模板浓度定量融解曲线分析可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体基因型分析SYBRGreenI优点SYBRGreenI缺点由于实时荧光定量PCR是建立在模板初始浓度与CT关系的基础上，因此为了保证样本具有准确可重复的实验结果，条件优化就显得非常重要。优化的实时荧光定量PCR结果有以下特点：线性的标准曲线（R2>0.980）高扩增效率（90%~110%）（1）标准曲线：

将样品的cDNA模板稀释成一系列浓度梯度进行PCR反应，用模板稀释倍数的log值对每个稀释样品的CT值作图，两者呈递减的线性关系。标准曲线的R2值显示实验数据满足衰减的线性程度，即数据的线性程度。线性用来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。标准曲线如图3-1所示，三个基因的标准曲线都呈递减的线性关系，并且R2值都满足大于0.98的要求，扩增效率都在90%~110%的范围之内，说明优化的PCR条件和体系复合实验要求，重复性好，可以使用2-ΔΔCT方法来计算CsICE1和CsCBF1受到冷诱导后的相对表达量。GAPDH扩增效率

E=101.3%R2=0.985CsICE1扩增效率E=97.2%R2=0.991CsCBF1扩增效率

E=106.2%R2=0.986图3-1三个基因的实时荧光定量PCR标准曲线可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性（即DNA熔解），荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次倒数与温度作图，在扩增产物的熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链碱基对分离50%的温度），用这个特征峰可以将特异产物与其他产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解。（2）熔解曲线：CsICE1和CsCBF1的实时荧光定量PCR熔解曲线只有一个特征峰，说明两个基因的引物特异性好，PCR反应中没有产生引物二聚体等非特异性产物低温诱导条件下CsICE1与CsCBF1的表达分析3实验材料：龙井43和舒茶早两个茶树品种，每个品种都选取一棵成年茶树上的若干健壮枝条，清水培养。其中一部分放置于20℃作为常温对照，另外一部分放于4℃光照培养箱，分别于3h、6h、12h、24h、36h和48h后取嫩叶。材料处理：实时荧光定量PCR分析半定量RT-PCR分析低温诱导条件下CsICE1与CsCBF1的表达分析3CsCBF1在常温对照中几乎检测不到表达量，受到冷诱导后其表达量迅速提高，并在4℃处理6h时达到最高值（比对照提高了138倍），之后转录水平逐渐下降并维持在一定的水平。CsICE1的转录水平在低温处理前后变化不大，只有在4℃处理3h时增加了约3倍。

2-ΔΔCT如何鉴定某一茶树基因的功能？❀六、基因的原核表达七、融合蛋白的纯化八、蛋白质与DNA相互作用的功能研究六、基因的原核表达1.目的基因克隆载体的构建2.目的基因表达载体的构建3.目的基因产物（蛋白）的诱导表达4.目的基因表达产物的检测基因蛋白质GGCGAATTCATGGATTCGAGCAAGAAAAAT1.目的基因克隆载体的构建CsCBF1开放阅读框780bp引物EcoRⅠ转录起始密码CGGAAGCTTGGCTTAAATTGAGAAGCTCCAGAGF：R：HindⅢGGCGAATTCTTCGAACGGPCR扩增TT感受态E.coliDH5αCsCBF1780bpCsICE11557bp扩增培养质粒提抽2.目的基因表达载体的构建TTT载体表达载体（1）双酶切：pET-32aEcoRⅠHindⅢEcoRⅠ和HindⅢ表达载体Trx-tag：硫氧还蛋白标签是个融合标签，有利于蛋白可溶性表达。

His-tag：是纯化标签，能与Ni柱亲和层析，便于表达蛋白纯化，2个His-tag分别设计在N,C端、自己通过选择酶切位点选择其中的一个就可以。

S-tag：是用于做westernblotting分子杂交鉴定的，能与Anti-S-tag产生抗原抗体反应。CsCBF1

PCRDNA产物纯化/胶回收

酶切质粒DNA/基因组DNA提取琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶电泳单一条带的回收纯化--DNA产物纯化或者凝胶回收

产物有多个条带，需要把不同条带分开回收纯化--凝胶回收（2）胶回收：CsCBF1切胶示意图实验操作流程图DNA凝胶回收试剂盒凝胶纯化结果示意图（3）连接表达载体：pET-32aT4连接酶，16℃过夜（4）转化表达菌株：感受态E.coliRosetta(DE3)plysSLB液体培养基37℃，震荡培养1.5h（5）菌落PCR鉴定：AmprLB液体培养基表达宿主菌细胞4His-CsCBF1融合蛋白CsCBF1表达载体PET-32aEcoRIHind

IIIIPTG诱导Rosetta(DE3)plysS表达菌株：3.目的蛋白的诱导表达诱导原核表达的原理E.Coli

Rosetta(DE3)plysS：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体。lacI是E.Coli乳糖操纵子的调节基因，产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，阻止外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。操纵子：启动子、操纵基因结构基因结构基因：编码

-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）硫半乳糖苷乙酰转移酶（A）的基因。调节基因：可以编码表达阻遏蛋白乳糖+阻遏蛋白：改变阻遏蛋白的形状。乳糖操纵子为什么在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大？目的基因受噬菌体T7启动子强转录及翻译信号控制表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导充分诱导:

几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白,数小时后达细胞总蛋白的50%以上非诱导条件下:

可使目的基因完全处于沉默状态而不转录

转化表达宿主菌

诱导优化表达目的蛋白

1.转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株1.确定是否有目的蛋白表达2.确定表达时间和温度的最佳条件3.分析蛋白溶解性和活性4.SDS,Western印迹等确定目的蛋白目的蛋白的诱导表达步骤目的蛋白的诱导表达步骤挑取单菌落摇菌，扩大培养IPTG离心，收集菌体聚丙酰胺凝胶电泳（SDS）检测1.确定是否有目的蛋白表达聚丙酰胺凝胶电泳（SDS）电泳槽制胶架电极架梳子1.将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。2.在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。3.将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。4.取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。5.将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。6.如图所示将电极架往下压（约1~2mm），使底面完全接触。7.关上底座开关。8.放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。SDS基本原理概述SDS技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDS—肽链复合体（雪茄状），从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电），并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合PAGE技术（根据分子的形状、电荷、分子量综合差异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白质或测定定蛋白质分子量的实验技术。十二烷基硫酸钠(SDS)性质与作用

CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+

蛋白质肽链--

----SDS变性SDS作用方式去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。SDS以烃链与蛋白质多肽链侧链结合。

蛋白质变性0.1-1%SDS0.1M2-巯基乙醇SDSSDS的性质与作用聚丙烯酰胺凝胶性质聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的。聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小形状。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。凝胶的制备：凝胶由分离胶和浓缩胶组成：上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。分离胶浓缩胶过硫酸铵-TEMED（四甲基乙二胺）的作用过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，故一定要新鲜，10%过硫酸铵必须现用现配，4℃冰箱贮存不超过48小时。

在丙烯酰胺和双丙烯酰胺的溶液中放入过硫酸铵，其产生出游离氧原子使丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。在具有自由基团体系时，它们才会聚合。PAG聚合过程图XYZ+SDSPAGESDSXYZ-+-结果受分子量大小、电荷、形状的影响结果只与分子量大小有关-+PAGE和SDS的比较缓冲液系统在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统，pH8.3；上样缓冲液用的也是Tris－HCL缓冲系统，pH6.8，但里面加有甘油、溴酚蓝、DTT或巯基乙醇。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL