发酵工程微生物酶制剂生产工艺

微生物酶制剂生产工艺微生物工程生产实例简介一、简介1、定义酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质，酶制剂主要作用是催化食品加工过程中各种化学反应，改进食品加工方法。是一类从动物、植物、微生物中提取具有生物催化能力的蛋白质。微生物酶制剂就是从微生物中提取的蛋白质。近20年来，随着基因工程的渗入，使酶的定向改造成为可能，所以在固定化酶、固定化细胞和固定化原生质体发展的同时，酶分子修饰技术、酶的化学合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在积极地开展中，从而使酶工程更加显示出广阔而诱人的前景。

利用微生物生产生物酶制剂要比从植物瓜果、种子、动物组织中获得更容易。因为动、植物来源有限，且受季节、气候和地域的限制，而微生物不仅不受这些因素的影响，而且种类繁多、生长速度快、加工提纯容易、加工成本相对比较低，充分显示了微生物生产酶制剂的优越性。3、利用微生物提取酶制剂的意义及其优点微生物酶①微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全，几乎所有的酶都能从微生物中得到②微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量③微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的产酶高的菌株利用微生物产酶的优点是：一）酶发酵生产的类型二、微生物酶制剂的生产技术1)

固体培养法

固体培养是以麸皮或米糠为主要原料，另外添加谷糠、豆饼等为辅助原料。经过对原料发酵前处理，在一定的培养条件下微生物进行生长繁殖代谢产酶。固体培养法比液体培养法产酶量高。同时还具有原料简单、操作简便、酶提取容易、节省能源等优点。缺点是不便自动化和连续化作业，占地多、劳动强度大、生产周期长。

2)液体培养法液体培养法的优点是：占地少、生产量大、适合机械化作业、发酵条件容易控制、不易污染，还可大大减轻劳动强度。其培养方法有分批培养、流加培养和连续培养三种，其中前两种培养法广为应用，后者因污染和变异等关键性技术问题尚未解决，应用受到限制。3）固定化细胞发酵（70年代后期发展）将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。4）固定化原生质体发酵（80年代中期发展）原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。[原料][原始菌种][麸皮等原料]

↓↓饼粕等原料淀粉质原料试管斜面培养(活化)[配制培养基]

↓

↓

↓(灭菌)按不同原料净化、粉碎摇瓶等分级扩大培养作不同处理↓

↓水解种子罐培养

↓

↓

[淀粉糖液][发酵罐(液体发酵)][发酵池(固体发酵)]

↓↓

↓

培养

配制培养基↓

(灭菌)[发酵液][成品曲]

↓↓

↓下游加工

{液态酶制剂}

↓{固体粗酶制剂}{各种精制酶制剂}酶发酵生产的一般工艺流程图二）菌种产酶类型同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型1、同步合成型合成与生长同步进行。对数生长期酶大量产生，平衡期合成停止。又称生长偶联型。如：米曲霉合成单宁酶。特点：生物合成可被诱导，不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。该酶所对应的mRNA很不稳定。2、延续合成型酶的合成伴随细胞生长而开始，但进入生长平衡期后酶可继续合成。如：黑曲霉合成聚半乳糖醛酸酶特点为：酶的生物合成可以诱导，不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。该酶所对应的mRNA相当稳定。3、中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平衡期后合成停止。如：枯草芽孢杆菌合成碱性磷酸酶受反应产物磷酸阻遏特点为：酶的生物合成受反应产物阻遏。该酶所对应的mRNA很不稳定。4、滞后合成型细胞生长进入平衡期后酶的合成才开始。

如：黑曲霉合成酸性蛋白酶。大多数水解酶的属于该类。特点为：酶的生物合成可能受分解代谢物阻遏。该酶所对应的mRNA相当稳定。同步合成延续合成中期合成滞后合成延迟期合成合成对数期合成合成合成平衡期合成合成mRNA不稳定稳定不稳定稳定分解代谢物阻遏反应产物阻遏诱导物诱导诱导

生产酶制剂的微生物有丝状真菌、酵母、细菌3大类群，主要是用好气菌。三）产酶微生物1、产酶菌种的要求（1）产酶量高；（2）繁殖快，发酵周期短；（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；（5）安全性可靠，非致病菌。

工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源酶产酶微生物用途α-淀粉酶枯草芽胞杆菌地衣芽胞杆菌米曲霉淀粉液化，织物退浆，消化助剂，加酶洗涤剂葡萄糖淀粉酶米曲霉，黑曲霉，米根霉制造葡萄糖，发酵、酿酒等工业的淀粉水解糖中性蛋白酶枯草芽胞杆菌，米曲霉皮革、毛皮加工，食品加工，调味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清碱性蛋白酶地衣芽胞杆菌加酶洗涤剂植酸酶黑曲霉毕赤酵母工程菌株饲料添加剂纤维素酶里氏木霉、黑曲霉水洗布生产，饲料添加剂，消化植物细胞壁半纤维素酶木霉、曲霉、根霉饲料添加剂，消化植物细胞壁，低聚木糖生产β-葡聚糖酶枯草芽胞杆菌，黑曲霉，啤酒酿造，饲料添加剂异淀粉酶产气克雷伯氏菌，芽孢杆菌淀粉加工乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉乳品工业（处理牛乳和乳清）果胶酶曲霉、欧文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，麻类纤维脱胶

工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源转化酶啤酒酵母、假丝酵母制造转化糖凝乳酶米赫毛霉,大肠杆菌真菌生产的重组酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工葡萄糖氧化酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖葡萄糖异构酶凝结芽胞杆菌，白色链霉菌生产果葡糖浆青霉素酰化酶细菌、霉菌、放线菌制造6-氨基青霉烷酸

工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源2、生产种子的制备

生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用于发酵罐接种的大量菌体。种子制备工艺过程保藏菌种活化培养逐级摇瓶培养种子罐培养接种至发酵罐（1）菌种活化

目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力。

方法：在试管斜面上培养1-3代。（2）扩大培养

目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。

方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。扩大培养应注意的事项：（1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性；（2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富；（3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接入下一级培养或发酵罐；（4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。（1）培养基培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。3、发酵产酶条件的控制碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有机碳的异养型微生物。有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。①碳源不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考虑营养要求外，还要考虑酶生物合成的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用。尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如，α－淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。②氮源不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%-3%的无机氮源。在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的。一般蛋白酶(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)生产采用碳氮比低的培养基比较有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3.75%、玉米粉0.625%、鱼粉0.625%。NH4Cl1%、CaCl20.5%、Na2HP040.2%、豆饼石灰水解液10%组成的培养基；③碳氮比淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)生产的碳氮比一般比蛋白酶生产略高，例如枯草杆菌TUD127α－淀粉酶生产采用由豆饼粉4%、玉米粉8%、Na2HP040.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCl20.2%组成的培养基。而在淀粉酶生产中糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。

在微生物酶生产过程中，培养基的碳氮比也因培养过程不同而异。例如种子培养时，为了适应菌体生长繁殖的需要，要求提供合成细胞蛋白质的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，种子培养基的碳氮比一般要比发酵培养基低些。发酵时，不同发酵阶段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草杆菌BF－7658生产α－淀粉酶的发酵过程中，发酵前期要求培养基的碳氮比适当降低，以利菌体生长繁殖，发酵中后期要求培养基的碳氮比适当提高，以促进淀粉酶的生成。微生物酶生产和其他微生物产品生产一样，培养基中需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作为磷源，以硫酸镁为硫源和镁源。钙离子对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有十分重要的稳定作用，④无机盐在天然培养基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉为碳源时，添加100ppmCo2+和Zn2+，放线菌166蛋白酶活力可增加70%-80%。微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，这类物质统称生长因子(或生长素)。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶制剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。玉米浆中一般含有生长素32-128mg/mL。⑤生长因子产酶促进剂是指在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。产酶促进剂大体上分为两种：一是诱导物，二是表面活性剂。⑥产酶促进剂表面活性剂，如吐温－80的浓度为0.1%时能增加许多酶的产量。表面活性剂能增加细胞的通透性，处在气－液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶的活性。生产上常采用非离子型表面活性剂，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、羧甲基纤维素、苯乙醇等。离子型的表面活性剂对微生物有害。①发酵温度发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度的变化而变化的。微生物在生长发育中，不断地吸收培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都是吸热反应；培养基中的营养物质被大量分解时的生化反应都是放热反应。发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量，发酵液需要升温。(2)培养条件当菌体繁殖旺盛时，情况则相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，这时，发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度。微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性质不同而异，生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。一般细菌为37℃，霉菌和放线菌为28-30℃，一些嗜热微生物需在40-50℃下生长繁殖，如红曲霉生长温度35-37℃，而生产糖化酶的最适温度为37-40℃。在酶生产中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有进行变温生产的。例如以枯草杆菌ASl.398进行中性蛋白酶生产时，培养温度必须从31℃逐渐升温至40℃，然后再降温到31℃进行培养，蛋白酶产量比不升温者高66%。据报道，酶生产的温度对酶活力的稳定性有影响，例如用嗜热芽孢杆菌进行α－淀粉酶生产时，在55℃培养所产生的酶的稳定性比35℃好。种子培养基和发酵培养基的pH直接影响酶的产量和质量。在发酵过程中，微生物不断分解和同化营养物质，同时排出代谢产物。由于这些产物都与pH有直接关系，因此发酵液pH在不断发生变化。生产上根据pH的变化情况常作为生产控制的根据。pH对产酶的影响一般来说，培养基成分中碳/氮(C/N)比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N低，发酵液倾向于碱性，pH高。pH的这些变化情况，常常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。因此生产中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加缓冲液维持一定的pH；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节培养基的初始pH，保持一定的C/N比；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。pH对产酶的影响其实通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一般来说，在发酵初期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通风量可以少些；菌体生长繁殖旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异，一般需要强烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。因此，菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。通风量对产酶的影响对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还需要搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。搅拌的影响发酵中往往产生较多的泡沫。泡沫的存在阻碍了CO2的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响补料，也易使发酵液溢出罐外造成跑料。因此，生产上必须采用消泡措施。一般除了机械消泡外，还可利用消泡剂。消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮.

泡沫的影响用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。湿度4、提高酶产量的措施（1）添加诱导物诱导酶的发酵生产，添加酶合成的诱导物，可以显著提高酶产量。诱导物的浓度：必须控制在适当浓度。诱导物的分类（1）酶作用的底物；（2）酶作用底物的类似物；（3）酶的反应产物；（4）底物和底物类似物的前体物。（2）控制阻遏物的浓度A、解除终产物阻遏的方法降低培养基中酶作用产物的浓