双孢蘑菇菌种检验规程

1DB14/T1374—2017双孢蘑菇菌种检验规程本标准规定了双孢蘑菇菌种（固体菌种）检验的术语和定义、菌种质量要求、菌种质量检验。本标准适用于双孢蘑菇菌种（固体菌种）的质量指标与检验方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.28－2013食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB7096食品安全国家标准食用菌及其制品GB9688食品包装用聚丙烯成型品卫生标准GB/T12728食用菌术语GB/T19171双孢蘑菇菌种GB/T23190双孢蘑菇NY/T528食用菌菌种生产技术规程NY/T1097食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法NY/T1731食用菌菌种良好作业规范NY/T1846食用菌菌种检验规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1拮抗现象具有不同遗传基因的菌落间产生不生长区带或形成不同形式线形边缘的现象。3.2角变因菌丝体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象。3.3同工酶催化相同生化反应，而结构及理化性质不同的酶分子。通过凝胶电泳使同工酶分离成迁移率不同的区带，经生物化学染色后显示出的同工酶谱，可对生物品种进行酶分子水平的鉴别或鉴定。3.42DB14/T1374—2017母种经各种方法分离、选育或杂交得到的具有出菇能力的菌丝体纯培养物及其继代培养物。也称一级种，或试管种。3.5原种由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，称为原种。3.6栽培种由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物,是适用于栽培生产用的菌种，不可做再繁殖使用。也称三级菌种。4菌种产品质量要求4.1基本要求双孢蘑菇菌种商品基本要求见表1。表1双孢蘑菇菌种商品基本要求时将产品合格证书和菌种使用说明书提4.2母种质量要求4.2.1种性确认母种的购入或引进，应选择经省级以上国家机关批准的，具有专业资质的菌种生产单位或研究单位，并要求具有母种种性鉴定，栽培试验的有效书面报告。母种试管产品要有符合规定的产品标签，标志，标明生产时间等产品信息。4.2.2容器规格采用18mm×180mm、20mm×200mm的玻璃试管。4.2.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基），按GB4789.28中4.79规定配置。4.2.4母种质量指标3DB14/T1374—2017外观指标容器清洁无污物，完整无损坏，有清晰的标签和标志、转管时间等；棉塞干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌需要；培养基灌入量为试管总容积的四分之一至五分之一，斜面长度为试管总长度的二分之一至五分之一；斜面接种块大小为3mm～5mm×3mm～5mm。菌种感官指标斜面长满，生长势强，洁白或米白、浓密、均匀，羽毛状或叶脉状，平整，无角变；边缘整齐，无膏状、蜡状细菌或酵母菌菌落及霉菌菌落；无杂菌、杂质、害虫、积水、异味；培养基背面不干缩，颜色均匀、无暗斑、无色素；菌种遗传性指标符合NY/T1097，GB/T19171；酯酶同工酶（Est）鉴定符合NY/T1097、GB/T19171。菌种栽培性指标在适合的培养基中接种后，正常条件（24℃±1）下，24h内萌发恢复，定植迅速、菌丝健壮，15~20d左右长满培养基；栽培覆土后，要求12～16d结菇，18～22d采菇，每潮菇间隔7～10d；生物学效率一般不能低于30%；品种特性必须符合其品种认定时的特性及技术指标，如对温度、湿度、酸碱度等生长条件的适应性，耐受能力，对主要病虫害的抵抗能力等。4.2.5母种出售要求经过菌种生产单位自查，再经过国家认可的技术部门，管理部门检验后，印制完整的产品质量保证书和母种使用说明书，方可作为母种商业产品，进行商业出售或示范推广。4.3原种的质量要求4.3.1种性确认对计划用于生产原种的母种引进途径要严格确认。应选择经省级以上国家机关批准的，具有专业资质的菌种生产单位或研究单位，并要求具有母种种性鉴定，栽培试验的有效书面报告。4.3.2容器规格应符合NY/T528的规定。原种容器一般选用玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶/塑料袋。塑料瓶/塑料袋的卫生标准应符合GB9688的规定。4.3.3培养基应符合NY/T528的规定。4.3.4原种质量指标外观指标容器、标签和标志、棉塞参考母种要求；种量为接原种4－6瓶，接种物大于或等于12mm×15mm；培养基顶面距瓶口50mm±5mm。菌种感官指标菌种长满容器，生长势强，洁白或米白、浓密、均匀，羽毛状或叶脉状，平整，无角变；丝与培养基结合整齐，瓶壁与菌丝紧密相接，无干缩；无杂菌、杂质、害虫、积水、异味。4DB14/T1374—2017菌种栽培性指标种瓶应发满菌丝，在适温（24℃±1℃)下菌丝长满瓶不超过45d；结菇转潮性能、生物学效率、菌种的品种特性参考母种要求。4.3.5原种出售要求原种应注明母种的来源及种性特征，并符合上述质量要求，经过菌种生产单位自己检查，再经过国家认可的技术部门，管理部门检验后，印制完整的产品质量保证书和原种使用说明书，方可作为原种商业产品，进行商业出售或繁殖栽培种。4.4栽培种的质量要求4.4.1种性确认对用于生产栽培种的母种、原种的引进途径、繁殖和生产加以确认。应选择经省级以上国家机关批准的，具有专业资质的菌种生产单位或研究单位，并要求具有母种种性鉴定，栽培试验的有效书面报告。4.4.2容器规格玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶/塑料袋应符合NY/T528的规定。塑料袋的卫生标准应符合GB9688的规定。各类容器均应使用棉塞或无棉塑料盖。4.4.3培养基符合NY/T528的规定。4.4.4栽培产品质量指标外观指标容器、标签和标志、棉塞参考母种要求；接种量每瓶/袋原种接种栽培种30～50瓶/袋，培养基顶面距瓶口50mm±5mm。菌种感官指标菌种栽培性指标4.4.5栽培种要求栽培种应注明原种，母种的来源及种性特征，并符合上述质量要求，经过菌种生产单位自己检查，再经过国家认可的技术部门，管理部门检验后，印制完整的产品质量保证书和栽培种使用说明书，方可作为栽培种用于生产。5菌种质量检验5.1检验依据菌种质量检验（包括母种，原种，栽培种）要符合GB/T19171、NY/T528和NY/T1846。5DB14/T1374—20175.2检验人员菌种生产单位要配有专职的质量管理人员和质量检测人员，这些人员应该经过特殊的专业训练，具有一定的专业资质、专业经历和检测技能（参照中国农业部颁发的食用菌菌种管理办法(农业部令2015年第1号修订)。5.3菌种质量检验的抽样按照GB/T19171的规定执行。5.4菌种质量检验项目和检验方法5.4.1肉眼检查容器外观、产品标签、棉塞或无棉塑料盖、培养基确认、培养基灌入量（母种）、培养基斜面长度（母种）、接种量（原种，栽培种）、菌丝生长量、菌丝状态特征、菌落边缘等感官指标通过肉眼观察来判断。5.4.2微生物学实验按NY/T1846的规定执行。菌丝培养过程中的杂菌检验采用培养物镜检，用放大倍数不低于10X40的光学显微镜对培养物的水封片进行观察，每一检样应观察不少于30个视野。细菌检验取少量疑有细菌污染的培养物，按无菌操作接入营养肉汤培养液中，培养液成分按照GB4789.28执行，25℃~28℃振荡培养1～2d，观察培养液是否混浊。培养液混浊，为有细菌污染；培养液澄清，为无细菌污染。霉菌检验取少量疑有霉菌污染的培养物，按无菌操作接入PDA中，25℃~28℃培养3～4d，观察到双孢蘑菇以外的菌落，检查是否有绿色，黑，红，黄，灰等颜色的异常，或有异味出现，可认为有霉菌污染。必要时可以做水封片检验。5.4.3菌丝生长速度测定母种用直径90mm的培养皿灭菌后，在无菌条件下倒入使用的（如PDA等）培养基20mL，制成平板，接种平板5个，25℃±1℃下培养，48h后观察是否有污染发生，之后再培养1～10d，观察并记录菌丝每日生长量以及长满平板天数。5.4.4菌种遗传性鉴定取菌龄为15～20d的试管母种（原种、栽培种先制成试管种）,刮取菌丝,按1:3:0.5的比例混合菌丝(g)、0.1Mol/L磷酸缓冲液(mL)和石英砂(g),研磨成匀浆,台式离心机10000r/min离心5min,取上清液,按5:1:1的比例混合上清液、40%蔗糖和0.01%溴酚蓝溶液作为电泳样品,4℃下冷藏备用。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。用pH8.9Tris-HCl缓冲液配制9%分离胶,用pH8.3Tris-甘氨酸作电极缓冲液。点样75uL,3℃下120V电泳20min后稳压200V,4h。用固蓝RR盐60mg,0.1Mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)80mLα-萘乙酯38mg和β-萘乙酯38mg溶于3mL丙酮配制的染色液染色,显现酶谱,再根据特征带分型。5.4.5栽培特性试验6DB14/T1374—2017栽培试验要