病理学技术概论及常规病理技术

硕士研究生病理学南方医大学病理学教研室申洪授课内容病理学技术概论及常规病理技术细胞病理学技术及其在肿瘤诊断中的应用电镜在病理学诊断中的应用定量病理学技术及其生物医学中的应用病理学技术概论

及常规病理技术南方医大学病理学教研室申洪Tel:61648227Hongshen@一、病理学技术范畴1病理学2病理学技术广义范畴

狭义范畴：围绕病理形态学

病理形态学技术类型•

尸体剖验技术•

常规组织病理学技术•

常规细胞病理学技术•

组织化学和细胞化学技术•

免疫组织化学技术流式细胞技术•

超微结构技术体视学技术：•

定量病理学技术图像分析技术分子病理学技术激光共聚焦显微镜动物实验技术三维重建技术•

细胞培养技术

一、尸体剖验技术目的意义：查出病因和病变，明确诊断及死因

解释临床症状和体征等临床现象

及时发现和确诊新疾病，特别是传染病

提供第一手科研材料法律手续：死者家属签字

临床医生签字

单位签字基本要求：研究生：参加病理解剖本科生：见习二常规病理学技术

取材组织固定石蜡包埋切片技术：石蜡切片技术冰冻切片技术HE染色（一）取材切取病变组织或拟研究的组织标本的来源与收集1、临床活检2、尸体解剖3、实验动物

4、培养细胞取材注意事项1.及时、尽可能新鲜2.迅速固定、冷藏3.刀要快，不要挤压组织

4.注意研究目的

培养

定量

对比观察

临床诊断临床病理取材注意事项1、检查申请单的姓名是否与标本标注的姓名相符2、检查申请单所列标本是否与实际标本吻合。3、检查申请单所列标本件数是否与实际标本件数吻合。（二）固

定概念：用化学试剂保持尸体、器官、组织和细胞固有形态结构的过程谓固定所用的化学试剂谓固定剂或固定液。目的：防止自溶、腐败，保持良好结构原理：使组织及细胞内蛋白凝固；使有关成分沉淀、变性，成为不溶性物质方法：浸泡

灌注：局部灌注、全身灌注

蒸汽熏蒸

固定时间:

常规组织病理学:可长时间固定

细胞病理学：可长时间固定

细胞化学：不宜过长，约1小时为宜

固定后处理：

充分洗涤

固定时间越长，洗涤时间也应相应增加

固定注意事项1.固定液有毒性，注意自身防护2.及时，尽可能新鲜3.超微结构观察：低温固定4.注意不同研究目的对固定液的特殊需要

细胞化学

超微结构

细胞涂片巴氏染色5.固定液用量：足，必要时及时更换。6.固定时间7.固定后洗涤

常用固定液甲醛溶液：福尔马林，Formeldehyde

4％甲醛，或10％福尔马林40％甲醛

用于无特要求的组织常规固定

乙醇（EthylAlcohol）:95%

用于细胞涂片常规固定，糖原固定乙醇乙醚混合固定液:95%：95%乙醇+95%乙醚（1:1）

用于细胞涂片巴氏染色（三）石蜡包埋制样组织块脱水：逐级乙醇脱水

透明：二甲苯

浸蜡：65°C

包埋：溶解蜡人工脱水程序

(适应于3mm厚的组织块)1、80%酒精24h2、90%酒精12h3、95%酒精4h4、95%酒精4h5、100%酒精2h6、100%酒精2h7、二甲苯40min8、二甲苯40min9、石蜡（软）1h10、石蜡1h11、石蜡1h细小组织脱水程序（适合于胃、肠镜活检，肝、肺、肾穿刺活检的组织）1、80%酒精10-15min2、90%酒精10-15min3、95%酒精10-15min4、100%酒精10-15min5、二甲苯5-10min6、石蜡15-20min（四）石蜡切片

目的：

用染料通过不同的方法将切片中的不同组织结构显示出来，以利于镜下辨别其各种不同的形态，做出正确的诊断。类别：

常规染色法：普通染色法或HE染色法特殊染色法。(四)HE染色：苏木素－伊红染色HE染色：苏木素－伊红染色1脱蜡

（二甲苯）2水化

（逐级乙醇水化：100％－30％）3染苏木素41％盐酸酒精分化5返兰6逐级乙醇脱水[30％(或50％)－95％]7伊红染色8

逐级乙醇脱水

（95％－100％）

9

二甲苯透明10封片：中性树胶＋盖玻片HE染色法程序印戒细胞淋巴瘤HE染色冰冻切片三、常规细胞病理学技术细胞病理学（cytopathology）诊断细胞学（diagnosticcytology）

临床细胞学（clinicalcytology）。

该学科是利用身体器官组织正常或病变的离体细胞进行涂片，经显微镜观察，做出疾病诊断，特别是肿瘤良恶性诊断.

细胞病理学方法简便易行、诊断准确、可靠，已成为癌症早期诊断的重要手段之一，可广泛应用于临床和大量人群防癌普查。常规细胞病理学技术

一、取材、涂片制备痰涂片、胸水、腹水及尿液制片

二、固定

三、染色(巴氏染色)

常用固定液（1）等量95%乙醇和乙醚混合液（2）氯仿酒精固定液（3）95%酒精固定液（4）福尔马林固定液

细胞学研究，固定液选择要根据实验要求条件而定，如用细胞涂片作原位PCR，固定液要选用多聚甲醛。

巴氏染色步骤1．标本95％酒精固定3-5分钟2．Harris苏木素液5-10分钟3．水（蒸馏水或自来水）漂洗2-3次4．1％盐酸水溶液（或1％盐酸酒精液）浸1-3次5．自来水浸洗1-2次6．自来水或稀碳酸锂（100ml蒸馏水中加碳酸锂饱和液1滴），涂片返蓝为止

7．依次置入70％→80％→95％酒精，各2分钟8．桔黄G6液，1分钟9．95％酒精Ⅰ、Ⅱ缸，各1分钟10．EA36液，5分钟11．95％酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各1分钟12．无水酒精Ⅰ、Ⅱ，各1分钟13．二甲苯Ⅰ、Ⅱ，各2分钟14．中性树胶盖片封固四、组织化学和细胞化学技术用化学反应原理，在切片上滴加某种化学试剂，使之与组织或细胞中的生物化学物质结合，再用显色剂使之显色，达到定位、定性地显示组织或细胞中的某种物质成分，这种技术称为组织化学和细胞化学技术。其结果可用显微镜和电镜观察。结合定量病理学技术，还可对有关成分定量。

应

用•

糖类•

脂类

•

核酸

•

酶类•

胶原纤维•

弹力纤维•

神经纤维•

细胞膜、核膜结构五、免疫组织化学技术概念：免疫组织化学技术是指利用已知的抗

体与组织中相应的抗原结合，并利用

显色剂在原位将抗原物质显示出来原理：抗原＋抗体＋显色剂特点：在组织中原位显示某种特异性抗原常用显色剂种类：酶、金属粒子、同位素

生物素、化学显色剂（DAB）结果观察：显微镜、透射电镜

基本原理

抗原←组织中

+

抗体

←试剂

↓

抗原抗体复合物

+

第二抗体←标记有显色底物

↓

显色反应←显色剂(DAB)树突状细胞S-100阳性六、超微结构的基本技术

超微结构是在高分辨条件下观察到的细胞膜、细胞核、核仁、核膜、各种细胞器、微绒毛、纤毛、细胞连接结构及胶原纤维、弹力纤维等光镜水平观察不到的细微结构。

（一）透射电镜技术1.取材：1×1mm32.固定:2%戊二醛2h1%锇酸1－2h3.脱水：逐级丙酮，环氧丙烷4.包埋及聚合：浸透、包埋（Epon812）

聚合（硬化）、时间5.超薄切片：超薄切片机6.染色：饱和醋酸铀、1％柠檬酸铅

7.透射电镜观察

（二）扫描电镜技术1.取材：1×1mm32.固定:2%戊二醛2h1%锇酸1－2h3.脱水：逐级丙酮，环氧丙烷4.干燥：临界点干燥，醋酸异戊酯5.喷金：

6.扫描电镜观察

七、定量病理学技术形态测量学（Morphometry）平面测量学（Planimetry）体视学(Stereology)

形态结构要素计数，如核分裂计数

显微分光光度术

流式细胞术

激光共聚焦显微图像分析

图像分析

体视学(Stereology)概念：二维结构信息定量推论三维结构信息研究内容：

二维定量推论三维的原理、方法及应用，图像分析原理和方法生物体视学(BiologicalStereology)：

用体视学原理和方法研究生物组织的三维结构，并据生物组织的结构特点研究相应的体视学测试方法称为生物体视学特

点给出量化结果提高结果表达的客观性和准确性

应

用

•

诊断•

预后分析•

基础数据•

三维结构定量分析•

形态与机能有机结合八、分子病理学技术

广义概念：狭义概念：将分子生物学方法与病理形态学技术相结合，从分子生物学水平原位阐明