临床全自动生化分析仪课件

临床自动生化分析仪检验医学专业

教学目标和要求掌握自动生化分析仪的分析方法类型及其特点，连续监测法的理论K值，必选的分析参数，双波长测定的作用，双试剂的优点，分析仪与手工法比较的优点和缺点。熟悉分立式自动生化分析仪的根本结构，备选的分析参数，测定过程的自动监测，校准方式和校准要求，影响分析仪分析速度的因素和分析仪性能指标。了解某些分析参数的特殊意义，分析仪的工作过程和操作方法，干片式分析仪的结构和分析原理，常用分析仪的分析性能。自动生化分析仪由电脑控制，将生化分析中的取样(sampling)、加试剂、混匀、保温反响、检测(detect)、结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗(cleaning)等步骤组合在一起自动进行操作的分析仪器。自动生化分析技术的应用提高了临床生化检验质量和速度；减轻检验人员的劳动强度；节约样品和试剂；增加检验工程；提高检测精密度，减少实验误差；并且有利于临床检验标准化的实现。缺乏：温度、试剂、反响时间、加样自动生化分析仪按其工作方式不同分为连续流动式(continuousstreamingmovementstyle)或管道式：已很少用离心式(centrifugationstyle)：已很少用分立式(discretestyle)：应用最广泛干片技术(dryingstyle)：急诊多用第一节分立式自动生化分析仪的结构

完全模仿手工操作方式设计，各局部结构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等。一、根本结构〔一〕样品盘或样品架样品盘〔specimendisc〕：放置待测样品的转盘，可放置一定数量的样品杯〔specimencup〕或不同规格的采血试管，通过样品盘的转动来控制不同样品的进样。样品架〔specimenstock〕：每个样品架可放数只样品杯或采血试管〔多为5只或10只〕。样品架的移动通过样品传送带来进行。样品架上的条形码〔barcode〕或编码孔可识别样品架号及样品位置号。样品架的优点①随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；②通过样品架的移动能将样品传送到另一个分析模块〔analysisdie-block〕甚至另一台分析仪上再进行分析。

〔二〕试剂室和试剂瓶转盘式试剂室〔reagentchamber〕：内装放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置30～45种试剂瓶。试剂瓶容量一般为10～100ml。通过试剂转盘的转动来选用不同试剂。试剂架式试剂室：可放置容量为250ml～500ml的不同形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无交叉污染。但试剂管路较长使试剂存在一定的死体积，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测工程。大型分析仪同时备有第一试剂室和第二试剂室，即具备对同一检测工程添加两次试剂的功能，个别分析仪还具有参加第三试剂的功能。对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘上的任意位置，仪器能自动识别试剂的种类、批号和有效期。试剂室均具有冷藏装置，可将试剂保存在4～10℃。〔三〕反响杯和反响盘反响杯〔reactioncup〕是样品与试剂进行化学反响的场所，同时用作比色杯。由透光特性好的硬塑料或石英玻璃制成。比色杯光径不同分析仪有0.5～0.7厘米不等，大多数分析仪在计算时将其折算为1厘米光径。反响盘〔reactiondisc〕：100只或更多的反响杯围成一圈组成。在测定过程中反响盘作恒速的圆周运动，在静止时向反响杯中参加样品、试剂或进行搅拌混匀，当反响盘恒速圆周运动经过检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。〔四〕取样和加试剂装置1．取样装置〔samplingassembly〕：由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量吸取样品并参加到反应杯。不同分析仪的取样容量有不同的范围，一般为2～35μl，步进0.1微升不等。取样针设有电子液面感应器，取样针于样品上方下降，一旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样。适用于不同的采血试管上机测定。多数加样装置设有防撞功能，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有阻塞报警功能，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、冲洗取样针，并跳过当前样品，进行下一个样品的取样检测。

取样针防交叉污染〔crossingcontamination〕措施绝大多数采用水洗方式〔又有瀑布式和涌泉式之分〕，在吸取另一个样品前对接触样品的样品针内外壁进行冲洗；也有采用化学惰性液〔chemicalinertiafluid〕膜的方式来隔绝样品与取样针内外壁之间的接触。2．加试剂装置加试剂装置用于定量吸取试剂参加反响杯，可参加试剂容量一般为20～350μl。步进1～5微升不等，取样精度在1微升左右。注射器方式：组成部件与取样装置类似，其液面感应系统能检测并提示试剂剩余量。灌注式：具有许多条试剂管路及其喷嘴，每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴，不存在各试剂间的交叉污染。大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测工程的第一试剂和第二试剂，大多数分析仪所有检测工程参加第二试剂的时间点统一固定为1个或2个点，也有分析仪有3个参加时间点可供选择。〔五〕混匀与搅拌装置反响杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，外表的疏水材料能防止反响液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为旋转式搅拌，也有震动式搅拌方式。也设置了防止搅拌棒在不同反响液之间携带交叉污染的清洗措施。〔六〕温控和定时系统温控系统使反响杯浸浴在恒温环境：恒温循环水浴方式：温度传递速度快，保养要求较高。恒温空气浴方式：温度传递速度不如恒温水浴循环方式，保养简单。温度控制器能使循环水或循环空气的温度控制在规定温度±0.1℃。规定温度可有37℃和30℃两种选择，一般固定在37℃。定时系统：不同分析仪对检测吸光度的间隔时间有不同的规定，反响时间应该设定为此间隔时间的倍数。总反响时间一般限制在8.5-10min内，个别分析仪可以设定为15或22min等。〔七〕光路和检测系统自动生化分析仪以紫外可见分光光度法为其中心和主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由光源、单色器和检测器组成。1．光源〔lightsource〕一般为卤素钨丝灯〔halogentungstenfilamentlamp〕，也有采用长寿命的氙灯〔xelamp〕，要求在340～800nm波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。2．单色器〔monochromato〕①干预滤光片〔interferencefilter〕分光系统：常带有340、380、405、500、550、600、660nm等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以转盘旋转的方式来选择波长。这种分光系统在半自动和小型自动分析仪中常用，且不能同一时刻进行多波长检测。②光栅〔raster〕分光系统：常在340〔或293〕～800nm范围内选择10～13种固定的单色光。前分光和后分光方式光栅分光有前分光和后分光两种方式，光源首先经过单色器分光，然后透射到比色溶液的方式为前分光。目前以后分光方式为多见，其优点是单色器中没有转动局部，双波长在同一时刻检测，因而提高了检测的精度和速度。光源先透过比色杯中的反响液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析工程的分析参数，后分光方式选择其中一个或两个波长〔双波长方式〕的吸光度值，用于分析结果的计算。3．检测器〔detector〕由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反响杯的吸光度值。〔八〕数据处理系统

具有多种数据处理功能。计算测定结果判断结果准确性保存各种数据自我诊断功能

〔九〕清洗系统反响杯清洗装置：一个反响杯内的反响和检测结束后，该反响杯就被冲洗系统及时冲洗。清洗过程：由废液针吸取反响杯内废液，参加清洗剂〔detergent〕冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，然后做杯空白的吸光度检查，假设通过检查那么此反响杯可继续循环使用；更高级的仪器带有风干技术。如果不能通过，分析仪将提示该反响杯异常，并跳过此反响杯使用下一个反响杯，或提示更换反响杯。样品针、试剂针和搅拌棒清洗一般在用于下一个样品、试剂或反响杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一批检测完成后，那么自动进行清洗剂清洗。清洗剂可配有1至3种可供选择，除一种常规清洗剂外，其它1至2种可按设定对试剂针、样品针或反响杯进行补充清洗。二、组合式自动分析仪

〔一〕组合式自动生化分析仪将相同或不同的两台或两台以上的分析局部，即分析模块进行组合连接，采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模块所分析工程的组合提高了分析效率，这些分析模块除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还有基于离子选择电极的电解质分析模块，甚至还可组合建立在免疫发光分析原理的免疫分析模块。组合式分析仪i2000SRImmunoassayModulec8000ClinicalChemistryModuleci8200ImmunoChemistryIntegration〔二〕实验室自动化系统

〔laboratoryautomationsystem，LAS〕包括样品前处理系统、样品输送系统和各样品分析系统。不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。随着检测样品量的增加，只需添加需要的新模块，将其安装连接，即可扩大处理能力。这样可防止同类硬件和功能的重复投资，节省占地面积所需的根底投入。当一模块发生故障时，其余模块仍在运行，在24小时内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日常工作。样品前处理系统能独立工作，由样品投入部、离心别离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的局部，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。也可通过样品输送局部与样品分析系统连接，组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从采血到报告的实验室的全自动化。第二节生化自动化分析方法概要

一、分析方法分类〔一〕终点法〔endassay〕被测物质在反响过程中完全被转变为产物，到达反响终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反响终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反响时间一般较长，精密度较好。终点时间确实定①根据时间-吸光度曲线来确定，②根据被测物反响终点，结合干扰物的反响情况来确定。1．一点终点法〔onepointendassay〕在反响到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。结果计算公式：待测物浓度CU=〔待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB〕×KK为校准系数图4-3一点终点法反响曲线A单试剂一点终点法B双试剂一点终点法2．两点终点法〔twopointendassay〕在被测物反响或指示反响尚未开始时，选择第一个吸光度，在反响到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。计算公式为：CU=〔待测吸光度A2－待测吸光度A1〕×K。图4-4两点终点法反响曲线A单试剂两点终点法B双试剂两点终点法

该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸〔icterus〕和脂浊〔lipo-turbid〕等样品本身光吸收造成的干扰。图4-5血红蛋白、胆红素和脂浊的

光吸收曲线

〔二〕固定时间法〔fixed-timeassay〕指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反响初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也称此法为两点法。计算公式与两点终点法相同，CU=(A2-A1)×K。图4-6固定时间法反响曲线A单试剂固定时间法B双试剂固定时间法该分析方法有助于解决某些反响的非特异性问题。〔三〕连续监测法

〔continuousmonitoringassay〕又称速率法〔rateassay〕，是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期〔各两点间吸光度差值相等〕的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值〔ΔA/min〕计算结果。图4-7连续监测法反响曲线A单试剂连续监测法B双试剂连续监测法

酶促反响的线性段δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段连续监测法的优点可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反响的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性〔U/L〕＝ΔA/min×理论〔或校准〕K值。代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。1．理论K值

多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min×将此式中以K来表示，即为：理论K值-可作为分析参数输入到分析仪中。

采用理论K值的前提

应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论K值。〔1〕NADH〔NADPH〕

“摩尔吸光系”数的测定NADH〔NADPH〕没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反响途径。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。根据公式A=εbC，比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH〔NADPH〕的摩尔吸光系数ε为A/bC。测定方法葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液参加量为3.5μL，酶试剂参加量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，那么实测NADH摩尔吸光系数＝＝6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH〔NADPH〕的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH〔NADPH〕的ε为6220。〔2〕“色素原”酶促产物

在405nm波长摩尔吸光系数的测定有许多酶底物为人工合成的“色素原”底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反响产物，在405nm波长具有吸收峰。ALP底物磷酸对硝基苯酚(4-Nitrophenylphosphate，4-NPP)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)GGT底物γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid，ANBA)。以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例试剂：①4-NP标准储存液(1Ommo1/L)②4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/LAMP缓冲液稀释而成)③底物缓冲液(l5mmol/L4-NPP配于0.84mol/LAMP-HCL缓冲液中，37℃,pHl0.09土0.02)。测定方法4-NP标准液参加量为5μL，底物缓冲液参加量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度ΔA=A1-A2，假设测得ΔA为0.460，那么实测4-NP摩尔吸光系数＝186622．校准K值酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，那么使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。〔四〕透射比浊法抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反响液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊〔transmissionturbidimetry〕测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。二、常用生化检测工程分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素〔氧化法或重氮法〕、结合胆红素〔氧化法或重氮法〕、血清总蛋白〔双缩脲法〕、血清白蛋白〔溴甲酚氯法〕、总胆汁酸〔酶法〕、葡萄糖〔葡萄糖氧化酶法〕、尿酸〔尿酸酶法〕、总胆固醇〔胆固醇氧化酶法〕、甘油三酯〔磷酸甘油氧化酶酶法〕、高密度脂蛋白胆固醇〔直接测定法〕、钙〔偶氮砷Ⅲ法〕、磷〔紫外法〕、镁〔二甲苯胺蓝法〕等。2．固定时间法

苦味酸法测定肌酐采用此法。

3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的工程如：脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反响的工程，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗“O”、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。第三节分析参数设置

各种测定工程的分析参数〔analysisparamete〕大局部也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测工程的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数确实切意义。一、分析参数介绍

〔一〕必选分析参数1．试验名称〔testcode〕2．方法类型〔也称反响模式〕(assaymode)3．反响温度4．主波长〔primarywavelength〕5．次波长〔secondarywavelength〕6.反响方向〔responsedirection〕7．样品量〔samplingvolum〕常量、减量和增量。8．第一试剂量〔firstreagentvolum〕一般20-300μl9．第二试剂量〔secondreagentvolum〕同上。10．总反响容量〔totalreactingvolum〕一般180-350μl，现仪器能减少至120μl。11．孵育时间〔incubatetime〕12．延迟时间〔delaytime〕13．连续监测时间〔continuousmonitoringtime〕一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点〔3个吸光度变化值〕14．校准液〔calibrator〕个数及浓度15．校准K值〔calibratecoefficient〕或理论K值16．线性范围〔linearityrange〕17．小数点位数〔decimalpointdigit〕〔二〕备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但假设样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。2．底物耗尽值〔substrateexhaustlimit〕在负反响的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。假设低于此限时底物已太少，缺乏以维持零级反响而导致检测结果不准确。3．前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差异〔ΔA〕设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。4．试剂空白吸光度范围超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反响时的变化速率。6．方法学补偿系数用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。7．参考值范围对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。〔三〕某些参数的特殊意义1．最小样品量一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。2．最大试剂量对方法灵敏度很高而线性上限低的检测工程，很重要。3．弹性速率〔flexrate〕在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反响时，有些仪器具有弹性速率功能，能自动选择反响曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如AST可从1000U/L扩展至2000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低本钱。4．标本空白速率以胆红素干扰碱性苦味酸法测定肌酐为例：样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反响过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。设置空白速率以消除胆红素干扰假设在参加第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反响，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂参加后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图4-8。

空白速率法消除胆红素对肌酐测定的干扰

图4-8二、单波长和双波长方式

〔一〕概念采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长方式。当反响液中含有一种组分，或在混合反响液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。当反响液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。〔二〕双波长的作用①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰：当样品中存在非化学反响的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，双波长方式可以局部消除这类光吸收干扰。〔三〕次波长确实定方法

当被测物的主波长确定之后，根据干扰物吸收光谱特征选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。三、单试剂和双试剂方式

反响过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。双试剂方式分析的优点是：①可提高试剂的保存稳定性；②能设置两点终点法；③在某些工程检测时能消除非特异性化学反响干扰。双试剂方式消除非特异性化学

反响干扰举例血清ALT测定时，血清中原有酮酸也可与试剂LDH起反响，使结果偏高。假设先参加缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使原有酮酸与LDH反响，之后参加含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动ALT酶促反响生成丙酮酸，这些丙酮酸与LDH反响消耗的NAD＋能真正反映ALT活性，从而消除以上副反响的影响。四、测定过程的自动监测

1．试剂空白监测：①每瓶试剂在使用前先自动检测试剂空白吸光度；②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度。为某些先加试剂后取样品的分析仪所采用。2．试剂空白变化速率监测设置此项监测后，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。在以监测NAD〔P〕H减少为指示反响的酶活性测定中，空白速率速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反响的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这局部干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。4．结果可靠性监测〔1〕终点监测〔2〕线性期监测①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始假设干点的变化速率与连续监测期最后假设干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。

5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，那么说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此监测对于采用负反响分析酶活性的方法甚为重要。

底物消耗监测

图4-96．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果假设超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。四、分析参数设置举例

以肌酸激酶测定为例。

1.肌酸激酶试剂盒通用参数

样品量50µl，第一试剂1000µl，37℃保温5min，加第二试剂500µl，延时2min在340nm读第一点吸光度，连续监测2min。2.某生化分析仪有关参数的设置范围样品量2－35µl，第一试剂量20－270µl，第二试剂量20－270µl，总反响容量180－350µ，吸光度监测周期18s，总反响时间10min，各试剂可参加时间：1.5min，4.5min，9.5min。3.参数设置如下〔1〕按比例减少样品量和各试剂量，使反响液总容量在分析仪180－350µl范围内。选择样品量为10µl，第一试剂200µl，第二试剂100µl，这时反响液总容量是310µl。或者选择样品量为8µl，第一试剂160µl，第二试剂80µl，这时反响液总容量是248µl。〔2〕确定第二试剂参加时间，根据通用参数，应选择4.5min为第二试剂参加点。〔3〕确定各个吸光度选择点，由于第二试剂参加时间4.5min，换算成监测时间为第16，17点之间，加上2min延时，那么在第24监测点为第一点吸光度，并连续选择24-31监测点。〔4〕计算K值：根据样品量10µl，第一试剂200µl，第二试剂100µl，代入计算公式那么K===4984也可以采用肌酸激酶的校准品，执行校准程序来得到校准K值。4．对新设置的反响参数进行试运行在开始运行时，分析仪会对各反响参数之间的逻辑合法性进行检测，如果反响参数中出现逻辑性错误，那么分析仪会显示错误信息并停机，这时可以根据提示信息对反响参数进行修改。第四节自动生化分析仪

工作过程和操作方法

一、工作过程在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序〔procedure〕进行工作。1．取样加试剂和混匀样品盘转动使样品进入待测位置样品针定量吸取样品参加一反响杯反响盘旋转试剂转盘转动使所需试剂瓶进入试剂吸取位置试剂针定量吸取试剂参加反响杯搅拌机构将反响杯内液体进行搅拌混匀2．保温反响和吸光度检测反响盘旋转反响杯内液体在恒温条件下进行化学反响当该反响杯通过检测窗口时被检测得到一个吸光度值按规定的间隔时间检测吸光度值直至总反响结束总反响时间一般为10min，如果18s为检测吸光度的间隔时间〔intervaltime〕，那么10min得到34个吸光度值，假设15s为间隔时间，那么得到40个吸光度值。3．计算并显示或打印结果分析仪根据各测光点读数对某一检测工程进行结果计算，并显示或打印出每个工程的报告，也可按标本显示或打印出全部工程的累积。即待某样品指定的工程测试完毕，便显示或打印检测结果。二、操作方法

〔一〕操作前的各项检查〔1〕正常开机以后，检查冲洗用水装置是否正常、各项分析试剂是否充足、各种清洗剂是否足够，以及样品针、试剂针和搅拌棒是否清洁。〔2〕确认要进行校准的工程，确认要做的质控批号及工程，以及校准品、质控品是否足够。〔3〕进行光度计自检来确认光路与检测系统是否处于正常工作状态。〔二〕校准分析仪在样品分析之前都要对该分析工程进行校准〔也称定标〕，得出一个该工程的校准系数〔K〕。校准前首先必须在反响程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数〔K=校准品浓度/校准品吸光度〕。1．校准方式

有单点校准、两点校准和多点校准单点校准：校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可，两点校准：假设校准曲线呈直线但不通过原点，那么需用两个浓度的校准液做两点校准；多点校准：当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等。2．对校准的要求

〔1〕选择适宜〔配套〕的校准品〔2〕如有可能校准品应溯源到参考方法或参考物质。〔3〕确定校准的频度。〔4〕如有以下情况发生时，必须进行校准：①改变试剂的种类或批号；②仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件；③质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了实验室规定的接受限。〔三〕质控品测定质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于分析仪的批测定，是指一批样品从开始测定到完成测定后停止的整个过程。其中如果进行了添加或更新试剂、进行了有可能改变吸光度的维护等操作，均应进行一次质控样品的检测，以便及时监测到分析系统的改变。

所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序：①设定有关质控参数，如每个质控品的批号、靶值和标准差；②选择质控图的方式，如均值－标准差质控图；③质控结果的统计分析，分析仪会保存每次测定的质控结果，并对其进行统计，以列表及质控图的形式在屏幕上显示。可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果判为失控那么应从试剂、质控品、校准品和分析仪等几方面寻找原因。通过对质控结果的分析，可以了解某工程的分析精密度和准确度的改变。〔四〕检测工程的输入与测定1．工程输入〔1〕逐项输入：每份样品可以任选分析仪中已设置的且试剂室内已预置试剂的工程中的一项、几项或全部工程。〔2〕工程组合输入：把与疾病相关的检验工程组合在一起，进行组合检验，这有利于方便病人，有利于疾病的诊断和预后分析，同时也简化了分析操作，提高分析效率。〔3〕批量输入：对于有连续相同测定工程的样品，可使用批量输入的方法。多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入该批第一个样品的样品号，分析仪即会自动逐个地对样品进行测定。一般在开始画面还可选择：①是否需要对结果超过设定的线性范围、超过允许的吸光度上限等的样品自动进行重复测定；②测定结果是否需要按照已设定的打印格式自动打印与测定结果有关的选项。2．进行测定3．急诊检验

几乎所有全自动生化分析仪都具备“急诊优先”的功能，仪器留有急诊样品的分析位置或专用样品架以或急诊分析的专用编号。一旦在急诊样品位置上放置了样品，并设定了急诊检验的工程，分析仪就会在常规样品的测定过程中，优先安排对该样品进行分析测定。〔五〕样品的减量与预稀释方式样品的预稀释方式是指在分析过程中仪器首先对样品做自动稀释，然后进行测定。操作过程:a.样品针吸取一定量样品，参加反响杯，b.试剂针把稀释液参加已取样品的反响杯，并搅拌混匀，c.由取样针在已稀释的反响杯里吸取已稀释的样品，加至另一个反响杯进行分析测定。样品预稀释的优点：稀释过程自动化，能使用到高达100倍或更高的稀释比例。缺点：需占用3个取样周期(samplingcycle)。〔六〕分析仪的维护

分析仪的常规维护(maintenanc)是保证分析仪能够正常运行的重要手段。分析仪要严格根据操作手册的要求进行维护。每天维护每周维护不定期维护

〔七〕分析仪数据连网分析仪的数据连网是指分析仪与实验室电脑网络系统之间分析数据的互传与共享。连网的实现是通过分析仪的数据接口以及接口软件来完成。通过连网，能使来自分析仪的结果数据在网络软件的强大功能下得到进一步的处理，如报告单的格式〔形式〕更加为医生与患者所接受；患者的信息与对应的检验结果能长期保存；结果的分析与管理更为完善。三、自动化分析与手工操作的比较〔一〕优点1.检测速度快2.检测灵敏度高3.检测准确度高4.检测精密度高5.样品和试剂用量减少6.其他:能精确地控制反响时间;能精确地控制反响温度;能进行复杂的结果计算。〔二〕缺点1.选择次波长较困难2.操作时间受限3.操作复杂性受限:加试剂的次数受限制;无法做复杂的操作;选择和改变反响温度困难4.样品量/试剂量的比例受限制5.不适宜做参考方法6.仪器维护和保养较复杂第五节

干片式生化分析仪简介

一、仪器结构〔一〕干片试剂干片试剂的结构从上到下一般分为展开层、试剂层、显色层和支持层，见图4-10。〔二〕检测仪器也有半自动和全自动之分干化学的原理〔1〕

试剂结构Sample散布层试剂层显色层支持层二、分析原理

〔一〕分析过程1．展开层待测样品定量加到干片试剂，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。展开层还能为反射光检测提供一个具有反射的背景。2．试剂层样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反响。试剂层的结构还能控制多步化学反响的反响次序。3．显色层化学反响的产物在显色层与显色试剂起呈色反响。支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。4．吸光度检测整个过程经过一个规定的时间，由反射光度计进行检测分析。光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层，一局部光线被吸收，另一局部光线那么反射到接收器被检测。待测物浓度越高，光线被吸收越多，检测到的反射光越弱，因而待测物浓度与吸光度成正比。〔图4-10〕干化学的原理〔2〕反响过程演示干化学的原理〔3〕

比色展开层试剂层显色层支持层

接收器〔二〕分析方法原理以血氨测定为例，氨干试剂片的有效成分是溴酚蓝〔BromphenolBlue〕,其它成分包括外表活性剂、缓冲成分和保湿剂。氨通过半透膜进入试剂层，与指示染料溴酚蓝反响产生颜色产物，其颜色强度也即吸光度与样品中氨含量成正比，由反射光度计在605nm进行吸光度检测，与经同样检测的氨校准品进行比较，得到样品中氨的浓度。血氨测定的分析参数很简单：样品10μl，反响时间5min，波长605nm。第六节自动生化分析仪性能评价

全自动分析仪将取样至出结果的全过程都自动完成。操作者只要把样品放在分析仪一定的位置上，输入要测定的工程代号，仪器就会根据分析程序自动地进行操作，并打印出测定结果。举例来说，一台分析速度为1600测试/h的分析仪，工作4小时所完成的工作量，如果用手工操作，一般需要10到15个人工作1天。另外由于全自动化操作，并且分析仪设有完善的测定过程监测功能，因此人为主观误差因素很小，检测精密度大大提高。半自动分析仪根据其工作原理叫自动比色仪可能更恰当，其共用流动式比色杯，反响液之间互染率大。其优点是结构简单，价格廉价。缺点有：①交叉污染较重，反响液间相互影响不可防止。②每个工程检测后均需冲洗才能进行下一个工程测定，速度慢。③分析过程中的某些步骤需手工完成〔如加试剂、取样、混合、保温等〕。这类仪器体积小，结构简单，价格低，分析仪的测定过程监测功能较为简单，也存在一定的主观误差。目前更多地用于小型实验室或研究性实验或教学中。一、分析速度

1．通道(channel)