DB36-T 1512-2021 DNA条形码鉴定四种茄属种质技术规程

ICS67.080.20

CCSB30

DB36

江西省地方标准

DB36/T1512—2021

DNA条形码鉴定四种茄属种质技术规程

TechnicalrulesforidentificationoffourSolanumspeciesbasedonDNAbarcode

2021-12-14发布2022-06-01实施

江西省市场监督管理局发布

DB36/T1512—2021

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由江西省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。

本文件主要起草人：袁欣捷、方荣、陈学军、周坤华、雷刚、黄月琴、郭丽虹。

II

DB36/T1512—2021

DNA条形码鉴定四种茄属种质技术规程

1范围

本文件规定了茄属喀西茄（Solanumaculeatissimum）、栽培茄（S.melongena）、蒜芥茄（S.

sisymbriifolium）和水茄（S.torvum）等种质的术语和定义、方法原理、仪器设备、主要试剂耗材及参

考种质、DNA条形码序列的获取以及DNA条形码比对及结果判定。

本文件适用于茄属喀西茄、栽培茄、蒜芥茄和水茄的DNA条形码鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

SN/T4625DNA条形码筛选与质量要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

待测茄属种质testedSolanumgermplasm

由送检人提供的待鉴定的疑似喀西茄、栽培茄、蒜芥茄或水茄的种质。

3.2

参照茄属种质referenceSolanumgermplasm

用于与待测种质进行PCR扩增片段大小比较或DNA条形码比对的标准种质，喀西茄为改良托鲁巴

姆，栽培茄为赣茄1号，蒜芥茄为HC003，水茄为HC002（参照种质见附录A）。

3.3

DNA条形码DNAbarcode

生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段,如matK和

psbA-trnH。

注1：matK基因：植物叶绿体中赖氨酸tRNA内含子内的成熟酶（参与RNA转录本中II型内含子剪切）编码基因。

本标准DNA条形码matK的筛选与质量要求，参照SN/T4625的规定执行。

注2：psbA-trnH：植物叶绿体psbA基因和trnH基因间的间隔序列。本标准DNA条形码psbA-trnH的筛选与质量要

求，参照SN/T4625的规定执行。

1

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4方法原理

根据茄属种质的matK或psbA-trnH序列特征，应用DNA条形码技术对喀西茄、栽培茄、蒜芥茄

或水茄等茄属种质进行鉴定。DNA条形码引物相关信息见附录B，DNA条形码序列相关信息见附录C。

5仪器设备、主要试剂耗材及参照种质

参照种质参见附录A，仪器设备及试剂、耗材参见附录D，溶液配制方法参见附录E。

6DNA条形码序列的获取

6.1样品准备

取0.2g～0.5g待测种质或参照种质的植物组织置于2mL离心管中，做好标记。

6.2DNA提取

6.2.1改良CTAB法提取DNA

待测种质采用改良CTAB法提取DNA，步骤为：

a）取直径为6mm钢珠2粒放入装有样品的2mL离心管中，加入预热至65℃的CTAB溶液800μL，于

植物组织研磨仪中充分研磨后，65℃水浴20min。

b）取出离心管加入600μL氯仿/异戊醇（24：1）溶液后，上下颠倒混匀，10,000rpm离心10min。

c）取上清液400μL于新的1.5mL离心管，加入800μL无水乙醇并混匀，10,000rpm离心10min。

d）去上清液，加入75%无水乙醇，颠倒混匀后于10,000rpm离心2min，弃上清，自然晾干后加50μL

ddH2O溶解DNA。

e）用超微量分光光度计检测DNA浓度，用ddH2O将DNA稀释到100ng/μL，置于-20℃冰箱保存备

用。

6.2.2试剂盒法提取DNA

若待测种质样本量少，或样本已降解或部分降解，可购买专用试剂盒提取DNA，按照试剂盒的说

明进行提取，并按照9.2.1步骤e）的方法存放。

6.3PCR扩增

6.3.1PCR反应体系

PCR反应体系为：2×TaqMasterMix（含染料）20μL，10μM正向引物（附录B表B.1）和反向引

物（附录B表B.1）各0.4μL，100ng/μL的DNA模板2.0μL，ddH2O补齐至40μL。每管PCR体系滴入一

滴液体石蜡防止蒸发。

6.3.2PCR反应程序

所述PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，38个循环；

72℃延伸5min。

6.4PCR扩增产物检测

2

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6.4.1凝胶制备

称取1.2g琼脂糖于三角瓶中，加入120mL1×TAE缓冲液，在微波炉中加热至完全溶解后自然冷却

至约50℃，加入12μL核酸凝胶染色试剂GelRed（10,000×水溶液），混匀后倒于放有凝胶托盘的制胶

盒中，垂直将加样梳插入制胶盒的小凹槽中。

6.4.2电泳及检测

琼脂糖胶凝固后，垂直拨出加样梳，将凝胶托盘取出置于电泳槽中，用移液器吸取5μLDL2000

Marker点于每排第一个加样孔，其后依次加入4μL待检测PCR产物。将电泳仪设置为恒压150V，待指

示染料迁移至凝胶2/3处时，取出于凝胶成像系统检测PCR条带。参照种质的matK片段大小为1032bp，

psbA-trnH片段大小为745bp，待测样品条带大小应与参照种质条带大小基本一致，对待测样品PCR产物

进行Sanger测序，获取DNA条形码序列。

7DNA条形码比对及结果判定

7.1喀西茄的判定

利用DNA条形码psbA-trnH对喀西茄进行判定：将疑似喀西茄待测种质psbA-trnH片段两端质量低的

DNA序列截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对，相似度最高的为喀西茄；与序列2（附录C.1）进

行比对，对应序列2的第232位碱基为A，则确定待测种质为喀西茄。

7.2栽培茄的判定

利用DNA条形码matK对栽培茄进行判定：将疑似栽培茄待测种质matK片段两端质量低的DNA

序列截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对（/Blast.cgi），相似度最高

的为栽培茄；与序列1（附录C.2）进行比对，对应序列1的第491位碱基为C，同时第726位碱基为

T，则确定待测种质为栽培茄。

7.3蒜芥茄的判定

利用DNA条形码matK对蒜芥茄进行判定：将疑似蒜芥茄待测种质matK片段两端质量低的DNA

序列截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对，相似度最高的为蒜芥茄；与序列1（附录C.2）进

行比对，对应序列1的第645位碱基为C，则确定待测种质为蒜芥茄。

7.4水茄的判定

利用DNA条形码matK对水茄进行判定：将疑似水茄待测种质matK片段两端质量低的DNA序列

截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对，相似度最高的为水茄；与序列1（附录C.2）进行比对，

对应序列1的第682位碱基为T，则确定待测种质为水茄。

3

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附录A

（资料性）

参照种质

参照种质名单见表A.1。

表A.1参照种质名单

编号样品名分类来源

1改良托鲁巴姆S.aculeatissimum商品种

2赣茄1号S.melongena江西省农业科学院蔬菜花卉研究所

3HC003S.sisymbriifolium重庆市农业科学院

4HC002S.torvum重庆市农业科学院

4

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附录B

（资料性）

引物序列

DNA条形码引物序列见表B.1。

表B.1DNA条形码引物

编号目标DNA条形码引物序列(5'→3')

F:ACAAAAAATATCCAAATACCAAATCC

1matK

R:CCCGTTCATCTGGAAATCTTG

F:ATCCACTTGGCTACATCCGC

2psbA-trnH

R:CAACAACTCTCGTTCGTTACACTTC

5

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附录C

（资料性）

条形码参考序列

C.1psbA-trnH序列

atccacttggctacatccgccccctcccctactgatgacattccatttttacattattga60

aattagaaaacaaaagatttaagttcgaatatttctcttctttcttatttcacttatttc120

aatgatagtattatttcgattattatttcaaagatatgaaagatatgaggtcaaaattgg180

attttttatgtgaaatgcaataaaaagatatagtaacattagcaacaagaggaacaagtt240

atatttctttgaaataaatagaaaatcaaaatcgaatactcaatcatgaataaatgcagg300

caaataccctctccttctttttctataatttaaacaaaaaagtctatgtcagtcaaatac360

taggaaattaataataaaaaaaaaaaaaagaaaggagcaatagcaccctcttgataaaac420

aagaaaatggttattgctcctttcttttcaaaacctcctatagactagactgggatctta480

tccatttgtagatggagcttcgatagcagctaggtctagagggaagttatgagcattacg540

ttcatgcataacttccataccaaggttagcacggttgatgatatcagcccaagtattaat600

tacacgaccctgactgtcaactacagattggttgaaattgaaaccatttaggttgaaagc660

catagtgctgatacctaaagcggtaaaccagatacctactacaggccaagcagctaggaa720

gaagtgtaacgaacgagagttgttg745

C.2matK序列

acaaaaaatatccaaataccaaatccgacttctatatactccccacaaactagacgaagc60

tcgtgggaaggtcaaagaaagaacttgttcttccgacgttaagaattcttccaataattc120

cgagcccgatcttttcaaaaaagtgcgtacagtacttttgtgtttccgagctaaagttct180

agcacaagaaagtcgaagtatatactttattcgatataaagtcttttttttggaagatcc240

gctataataatgaaaaagatttctgcatatacgcccaaatcggtcaataatatcagaatc300

tgataaatcggaccaaactggtttactaatgggatgccctaatacggtacaaaagtgtgc360

tttagctaatgatccaatcaaaggaataattggaacaagggtctcgaacttcttaattgg420

attattgattagaaatgaattttctaacatttgactacgtaccattgaatgatttagtcg480

cacacttgaaagatagcccataaagtcacgggaatggttggataattggtttatatggat540

ccttcctgtgtgaaagtacatagaaaaatgacattgccaaaaattgacaaggtaaaattt600

ccatttattcatcaaaggaaacgtcccttttgaagccagaattgattttccttcatacct660

6

DB36/T1512—2021

aacataatgcatgaaaggatccttgaataaccatagggtaacctgaaaatccttagcaaa720

gacttctacaagacgttctatttttccatagaaatatattcgttcaagaagggctccaaa780

agatgttgatcgtaaatgagaagattggttccgtagaaagacgaaagtggattcgcattc840

atatacataagaattatataagaagaagaagaatctttgatttttttttgaaaaggagta900

accgggcttctttgaagtaataagactattcaaattacaatattcgtggagaaagaatcg960

taataaatgtaaagaagaggcatcttttacccaatagcgaagagtttgaaccaagatttc1020

cagatgaacggg1032

7

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附录D

（资料性）

主要仪器设备与试剂、耗材

D.1主要仪器设备

D.1.1PH计。

D.1.2纯水仪。

D.1.3电子天平。

D.1.4磁力搅拌器。

D.1.5恒温水浴锅。

D.1.6植物组织研磨仪。

D.1.7高速离心机。

D.1.8超微量分光光度计。

D.1.9PCR仪。

D.1.10微波炉。

D.1.11电泳仪。

D.1.12凝胶成像系统。

D.1.13冰箱。

D.2主要试剂

D.2.1十六烷基三乙基溴化铵（CTAB，AR）。

D.2.2聚乙烯吡咯烷酮K-30（PVPK-30，AR）。

D.2.3乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA，AR）。

D.2.4二水乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O，AR）。

D.2.5冰乙酸（CH3COOH，AR）。

D.2.6氯化钠（NaCl，AR）。

D.2.7三羟甲基氨基甲烷（Tris碱，AR）。

D.2.8氯仿（CHCl3，AR）。

D.2.9异戊醇（C5H12O，AR）。

D.2.10无水乙醇（C₂H₆O，AR）。

8

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D.2.11氢氧化钠（NaOH，AR）。

D.2.122×TaqMasterMix。

D.2.13DNAMarker（DL2000）。

D.2.14液体石蜡（AR）。

D.2.15DNA条形码引物。

D.2.16ddH2O。

D.3主要耗材

D.3.1离心管（1.5mL，2.0mL）。

D.3.2移液器及配套枪头。

D.3.3枪头盒。

D.3.496孔PCR板。

D.3.5蓝盖试剂瓶。

D.3.66mm钢珠。

D.3.7一次性手套。

D.3.8乳胶手套。

D.3.9量筒。

D.3.10玻璃棒。

D.3.11三角瓶。

D.3.12制胶盒

D.3.13凝胶托盘

D.3.14加样梳。

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附录E

（资料性）

溶液配制

E.1DNA提取液的配制

E.1.12%CTAB溶液

称取Tris-HCl12.44g，NaCl81.82g，Na2EDTA7.45g，CTAB20g，PVPK-3020g，加ddH2O至

800mL刻度处，于65℃加热使其充分溶解，待溶液冷却至室温后用NaOH将pH调至8.0。

E.1.2氯仿/异戊醇（24:1）溶液

量取480mL氯仿，20mL异戊醇置于棕色玻璃瓶中，混匀备用。

E.1.375%无水乙醇

量取375mL无水乙醇，125mLddH2O于棕色玻璃瓶中，混匀备用。

E.2PCR扩增溶液的配制

E.2.1DNA条形码引物稀释

装有引物（见附录C）粉末的离心管在离心机中5000r/min离心2min，加适量ddH2O将引物稀释到

10μmol/L。

E.3琼脂糖凝胶电泳相关溶液的配制

E.3.150×TAE缓冲液

称取Tris碱242g，Na2EDTA·2H2O37.2g，加ddH2O至800mL刻度处，搅拌混匀，加入57.1mL冰乙

酸，加ddH2O定容至1000mL。

_________________________________

10

DB36/T1512—2021

目次

前言............................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4方法原理..........................................................................2

5仪器设备、主要试剂耗材及参照种质..................................................2

6DNA条形码序列的获取.............................................................2

7DNA条形码比对及结果判定...........................................................3

附录A（资料性）参照种质....................................................4

附录B（资料性）引物序列....................................................5

附录C（资料性）条形码参考序列....................................................6

附录D（资料性）主要仪器设备与试剂、耗材..........................................8

附录E（资料性）溶液配制...................................................10

I

DB36/T1512—2021

DNA条形码鉴定四种茄属种质技术规程

1范围

本文件规定了茄属喀西茄（Solanumaculeatissimum）、栽培茄（S.melongena）、蒜芥茄（S.

sisymbriifolium）和水茄（S.torvum）等种质的术语和定义、方法原理、仪器设备、主要试剂耗材及参

考种质、DNA条形码序列的获取以及DNA条形码比对及结果判定。

本文件适用于茄属喀西茄、栽培茄、蒜芥茄和水茄的DNA条形码鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

SN/T4625DNA条形码筛选与质量要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

待测茄属种质testedSolanumgermplasm

由送检人提供的待鉴定的疑似喀西茄、栽培茄、蒜芥茄或水茄的种质。

3.2

参照茄属种质referenceSolanumgermplasm

用于与待测种质进行PCR扩增片段大小比较或DNA条形码比对的标准种质，喀西茄为改良托鲁巴

姆，栽培茄为赣茄1号，蒜芥茄为HC003，水茄为HC002（参照种质见附录A）。

3.3

DNA条形码DNAbarcode

生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段,如matK和

psbA-trnH。

注1：matK基因：植物叶绿体中赖氨酸tRNA内含子内的成熟酶（参与RNA转录本中II型内含子剪切）编码基因。

本标准DNA条形码matK的筛选与质量要求，参照SN/T4625的规定执行。

注2：psbA-trnH：植物叶绿体psbA基因和trnH基因间的间隔序列。本标准DNA条形码psbA-trnH的筛选与质量要

求，参照SN/T4625的规定执行。

1

DB36/T1512—2021

4方法原理

根据茄属种质的matK或psbA-trnH序列特征，应用DNA条形码技术对喀西茄、栽培茄、蒜芥茄

或水茄等茄属种质进行鉴定。DNA条形码引物相关信息见附录B，DNA条形码序列相关信息见附录C。

5仪器设备、主要试剂耗材及参照种质

参照种质参见附录A，仪器设备及试剂、耗材参见附录D，溶液配制方法参见附录E。

6DNA条形码序列的获取

6.1样品准备

取0.2g～0.5g待测种质或参照种质的植物组织置于2mL离心管中，做好标记。

6.2DNA提取

6.2.1改良CTAB法提取DNA

待测种质采用改良CTAB法提取DNA，步骤为：

a）取直径为6mm钢珠2粒放入装有样品的2mL离心管中，加入预热至65℃的CTAB溶液800μL，于

植物组织研磨仪中充分研磨后，65℃水浴20min。

b）取出离心管加入600μL氯仿/异戊醇（24：1）溶液后，上下颠倒混匀，10,000rpm离心10min。

c）取上清液400μL于新的1.5mL离心管，加入800μL无水乙醇并混匀，10,000rpm离心10min。

d）去上清液，加入75%无水乙醇，颠倒混匀后于10,000rpm离心2min，弃上清，自然晾干后加50μL

ddH2O溶解DNA。

e）用超微量分光光度计检测DNA浓度，用ddH2O将DNA稀释到100ng/μL，置于-20℃冰箱保存备

用。

6.2.2试剂盒法提取DNA

若待测种质样本量少，或样本已降解或部分降解，可购买专用试剂盒提取DNA，按照试剂盒的说

明进行提取，并按照9.2.1步骤e）的方法存放。

6.3PCR扩增

6.3.1PCR反应体系

PCR反应体系为：2×TaqMasterMix（含染料）20μL，10μM正向引物（附录B表B.1）和反向引

物（附录B表B.1）各0.4μL，100ng/μL的DNA模板2.0μL，ddH2O补齐至40μL。每管PCR体系滴入一

滴液体石蜡防止蒸发。

6.3.2PCR反应程序

所述PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，38个循环；

72℃延伸5min。

6.4PCR扩增产物检测

2

DB36/T1512—2021

6.4.1凝胶制备

称取1.2g琼脂糖于三角瓶中，加入120mL1×TAE缓冲液，在微波炉中加热至完全溶解后自然冷却

至约50℃，加入12μL核酸凝胶染色试剂GelRed（10,000×水溶液），混匀后倒于放有凝胶托盘的制胶

盒中，垂直将加样梳插入制胶盒的小凹槽中。

6.4.2电泳及检测

琼脂糖胶凝固后，垂直拨出加样梳，将凝胶托盘取出置于电泳槽中，用移液器吸取5μLDL2000

Marker点于每排第一个加样孔，其后依次加入4μL待检测PCR产物。将电泳仪设置为恒压150V，待指

示染料迁移至凝胶2/3处时，取出于凝胶成像系统检测PCR条带。参照种质的matK片段大小为1032bp，

psbA-trnH片段大小为745bp，待测样品条带大小应与参照种质条带大小基本一致，对待测样品PCR产物

进行Sanger测序，获取DNA条形码序列。

7DNA条形码比对及结果判定

7.1喀西茄的判定

利用DNA条形码psbA-trnH对喀西茄进行判定：将疑似喀西茄待测种质psbA-trnH片段两端质量低的

DNA序列截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对，相似度最高的为喀西茄；与序列2（附录C.1）进

行比对，对应序列2的第232位碱基为A，则确定待测种质为喀西茄。

7.2栽培茄的判定

利用DNA条形码matK对栽培茄进行判定：将疑似栽培茄待测种质matK片段两端质量低的DNA

序列截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对（/Blast.cgi），相似度最高

的为栽培茄；与序列1（附录C.2）进行比对，对应序列1的第491位碱基为C，同时第726位碱基为

T，则确定待测种质为栽培茄。

7.3蒜芥茄的判定

利用DNA条形码matK对蒜芥茄进行判定：将疑似蒜芥茄待测种质matK片段两端质量低的DNA

序列截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对，相似度最高的为蒜芥茄；与序列1（附录C.2）进

行比对，对应序列1的第645位碱基为C，则确定待测种质为蒜芥茄。

7.4水茄的判定

利用DNA条形码matK对水茄进行判定：将疑似水茄待测种质matK片段两端质量低的DNA序列

截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对，相似度最高的为水茄；与序列1（附录C.2）进行比对，

对应序列