生物化学：第五章酶

第五章

酶enzyme蛋白质的一个重要生理功能是在生物体新陈代谢中作为生物催化剂——酶，生物体除了抗体酶和核酸酶以外几乎所有的酶都是蛋白质。生物体新陈代谢过程中所有的生化反应都是在酶的作用下进行的，没有酶生物体的新陈代谢无法进行，更不能有序地进行。一.酶概念的建立1.我国对酶的认识：比西方早得多。夏禹时代，周代，春秋战国时代。2.西方对酶的认识：1857年巴斯德认为发酵是酵母细胞活动的结果。Liebig提出发酵是由于细胞液中的酶引起。1913年Michaelis和Menten提出米氏学说。3.1878年提出了酶这个名称。1926年Summer第一次从刀豆中提取了脲酶结晶。30年代Northrop分离出结晶的胃蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，确立了酶的蛋白质本质。4.核酸酶和抗体酶。二.酶学发展动态1.目前已经鉴定出了3000多种酶，其中不少已得到结晶。2.人们已经弄清了溶菌酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶等酶的结构和作用机理。3.1979年Kakudo弄清了曲霉中的多元淀粉酶的空间结构。4.目前酶学研究领域1）进一步发现新酶，并尽量得到结晶。2）酶的结构与功能的研究。3）酶作用机理的研究。4）酶催化反应的动力学研究。5）酶在代谢中的地位及生物合成的遗传机理。6）酶系统的自我调节性质。7）酶在细胞分化过程的作用。8）酶工程研究。9）酶的应用开发研究。三.酶的应用1.利用酶工程生产生物制品2.工业上的应用：淀粉酶，蛋白酶，脱脂酶，纤维素酶。3.医药上的应用：酶进行治疗化验。4.农业上的应用：利用酶的抑制剂生产杀虫剂和除草剂。第一节

酶学概论一、

酶的概念及其作用特点1、酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。生物催化剂：酶(enzyme

核酶(ribozyme)

脱氧核酶(deoxyribozyme)

抗体酶2、

酶与非生物催化剂相比的几点共性：①催化效率高，用量少（细胞中含量低）。②加快反应速度但不改变化学反应平衡点。③降低反应活化能。④反应前后自身结构不变。催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行。催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。3.酶催化反应的特点即作为生物催化剂的特点（1）、

催化效率更高酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且高出非酶催化反应速度至少几个数量级。★转换数（TN)或催化常数（Kcat)表示酶的最大催化效率Kcat是一定条件下（[S]》Km）每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（数值上Kcat=K3）王镜岩p322表8-2一些酶的最大转换数。碳酸酐酶为600000，溶菌酶为0.5（2）.专一性高酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。一种酶只作用于一种底物或一类底物。（3）、

反应条件温和常温、常压，中性pH环境。（4）、

活性可调节别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。从而调节新陈代谢有序进行。（5）、

酶的催化活性与辅酶、辅基、金属离子有关（6）.酶易失活：一般催化剂因中毒而失活，酶容易变性而失活。因而，酶作用一般要求比较温和的条件。二、

酶的化学本质及其组成（一）

酶的化学本质绝大多数酶是蛋白质证据（1）酸水解的产物是氨基酸，能被蛋白酶水解失活，（2）具有蛋白质的一切共性，凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性；（具有蛋白质的颜色反应）少数酶是RNA或DNA（核酶和脱氧核酶）★

ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）（1）80年代初，ThomasCech和SidneyAltman四膜虫L19RNA具有生物催化功能，催化rRNA前体的剪接

（2）1983年Atman和PaceE.ColiRNaseP中的RNA具有加工tRNA前体的催化功能脱氧核酶(deoxyribozyme)：具有催化功能的DNA。20世纪90年代中后期发现。抗体酶1.定义：利用某种酶底物类似物（半抗原）对动物进行免疫，使动物产生相应抗体，这种抗体又具有相应酶的功能，叫抗体酶。2.举例：利用酯酶水解产物中的过渡态物质磷酸酯类似物免疫动物，使动物产生单克隆抗体，发现这种抗体具有酯酶的活性。这个抗体酶服从米氏动力学。但Km,Kcat,Kcat÷Km,比真正的酯酶少三个数量级。但能使酯的水解速度提高1000倍。这个磷酸酯类似物是其竞争性抑制剂。3.应用以及意义：用于开发可切割病毒，肿瘤等具催化活性的抗体酶；开发天然酶不能催化的反应的抗体酶。（二）

酶的化学组成单纯酶类(simpleenzyme)：仅由蛋白质组成脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等结合酶类（conjugatedenzyme):全酶（holoenzyme)=脱辅基酶蛋白（apoenzye)+辅助因子(cofactor)：例如：超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）★

酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物金属离子：Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn2+、、Mn3+、Mg2+、K+、Na+、Mo6+、Co2+等。有机化合物：NAD，NADP，FAD，生物素，卟啉等辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析除去。辅基(prostheticgroup)：与酶蛋白共价结合较紧，不易透析除去。P102表4-1金属离子作为一些酶的辅助因子P102表4-2基团转移反应中的辅酶和辅基。★酶蛋白决定酶专一性，辅助因子的功能是传递电子、原子或某些功能基团的作用，决定酶促反应的类型和反应的性质。NAD+构成专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶的辅基。三、

单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体1、

单体酶由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子牛胰RNase124aa单链鸡卵清溶菌酶129aa单链胰凝乳蛋白酶三条肽链等水解酶。2.寡聚酶：即为寡聚蛋白质，由几个甚至几十个亚基组成。①含相同亚基的寡聚酶：苹果酸脱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基②含不同亚基的寡聚酶：琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。★大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。3、

多酶复合体1.定义：由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：①丙酮酸脱氢酶（E1）以二聚体存在2×9600②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）70000③二氢硫辛酸脱氢酶（E3）以二聚体存在2×56000

12个E1二聚体24×9600024个E2单体24×700006个E3二聚体12×56000总分子量：560万4、

多酶融合体（多功能酶）★一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。例如：天冬氨酸激酶I---高丝氨酸脱氢酶I融合体（双功能酶）该酶是四聚体α4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶

第二节酶的分类及命名一、

习惯命名法1.依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶2.依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶3结合上述两个原则命名：琥珀酸脱氢酶。4.有时加上酶的来源胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶二、

国际系统命名★★基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。酶国际系统命名法举例：谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶★★

国际系统分类法及编号（EC编号）（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。（2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3。（3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。乙醇脱氢酶EC1.1.1.1，乳酸脱氢酶EC1.1.1.27，苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37

第一个数字表示大类：氧化还原第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。三.酶的国际系统分类★分为六类：氧、转、水、裂、异、合1、

氧化还原酶类催化氧化还原反应：A·2H+B=A+B·2H

乳酸：NAD+氧化还原酶（EC1.1.1.27），习惯名：乳酸脱氢酶

2、

转移酶类AB+C=A+BCAla：酮戊二酸氨基移换酶（EC2.6.1.2），

习惯名：谷丙转氨酶3、

水解酶类催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1），习惯名：Ile氨肽酶。4、

裂合酶类（裂解酶）催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7），

习惯名：醛缩酶5、

异构酶催化同分异构体相互转化6-磷酸Glc异构酶6、

合成酶（连接酶）催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。UTP：氨连接酶（CTP合成酶）L-酪氨酸：tRNA连接酶（酪氨酰tRNA合成酶）T4DNA连接酶◆国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异SOD：EC1.15.1.1，只有一个名称和编号2O2-+2H+→H2O2+O2

三类不同的SOD：CuZn-SOD真核生物细胞质中Mn-SOD真核生物线粒体中Fe-SOD同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。★在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。第三节酶的活力测定与分离纯化一、

酶活力与酶促反应速度酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度即能力（一般测初速度，避免了各种干扰）。用来测定酶量的大小。酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。单位：浓度/单位时间关系：酶反应速度越快，酶活力越高；反之则越低。

研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗≤5%）。二、

酶的活力单位（U）国际单位（IU单位）：在最适反应条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），1IU=转化1umol底物的酶量/min国际单位（Katal,Kat单位）：在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位实际工作中可以根据需要自己规定。最适条件：最适温度（25℃或37℃）,最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度（1）通常很大，使酶饱和（2）底物消耗≤5%[sucrose]V零级反应[enzyme]V一级反应但是实际工作中可以根据需要自己规定。例如：限制性核酸内切酶3种定义：用粘度法测活性：30℃，1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。转化率法：5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。淀粉酶两种定义：A：1g可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme量。B：lml2%可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme量。1g酶制剂溶于1000mlH2O，取0.5ml与2%的starch20ml反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。A：20×2%×1/0.5×1000×60/10=4800u/克enzyme制剂B：20/0.5×1000×60/10=240000u/克enzyme制剂三.酶的比活力

Specificactivity定义：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：U/mg蛋白质。有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。一个酶的分离纯化分为4步。步骤1234总活力（U）6432总蛋白质（mg）201052比活力（U/mg）6/204/103/52/2

酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。

酶的纯化倍数：

酶的回收率：×100%四、酶活力的测定方法酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。单位：浓度/单位时间。测量初速度。利用底物或产物的理化性质而分别采样不同的方法，哪个容易就测哪个。具体方法有：分光光度法荧光法同位素法电化学法化学滴定法等五.酶的分离纯化1.分离纯化的方法及操作步骤跟蛋白质相似。2.注意事项：1）一般操作应在低温下进行0－5度；2）防止重金属使酶失活，加入鳌合剂EDTA;3）防止含巯基的酶失活，常加入巯基乙醇；4）常不断测定酶的比活力即不断测酶的纯度，指导提纯工作正确进行，直到得到纯酶。3.保存：浓缩结晶的酶在－20度以下保存；不能结晶的酶采样以下方法：1）保存浓缩的酶液，用硫酸氨沉淀或反透析浓缩；2）冰冻干燥，制成酶干粉；3）浓缩液加入等体积甘油后，在－20度以下保存。第四节

酶促反应动力学内容：研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。意义：在酶的结构和功能的关系研究以及酶的作用机理的研究中，以及为了解酶在代谢中的作用和酶在某些药物中的作用机理等，都需要了解掌握酶促反应的规律，因此，酶促反应动力学是酶学研究中一个既有理论意义又具实践意义的重要课题。一、化学动力学基础（自学）二、

底物浓度对酶促反应速度的影响（条件：单底物单产物酶促反应）（一）

中间复合物假说与米式方程1903Henrisucrose+H2Oglucose+fructoseacidV[sucrose][enzyme]V[sucrose]Venzymesucrose+H2Oglucose+fructose1、中间产物假说：

酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。一级反应：反应开始反应速度V与底物浓度[S]成正比关系。混合级反应：随[S]增高，反应速度并不按正比升高。零级反应：随[S]增高，V不再上升，趋向一个极限，趋向Vmax.说明酶可被底物饱和的现象，所有的酶都有此现象。中间产物假说：中间产物假说证据：（1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性（3）结晶ES复合物的获得。快速平衡假说：酶与底物两者反应速度较快，迅速建立平衡。米氏学说：2、米氏学说：：1913年Michaelis和Menten提出，建立在以上两个学说基础上建立的V与[S]的定量关系，建立了米氏方程。Ks为底物解离常数（底物常数）（二）

米式方程的导出：1、

早年的米式方程基于快速平衡假说①

在反应的初始阶段，[S]远远大于[E]，因此，[S]可以认为不变。②

因为研究的是初速度，P的量很小，由P+E

ES可以忽略不记。③

游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成产物的速度极慢，故，[ES]

的动态平衡与ES

P+E没有关系（即K1、K2＞＞K3）ES的生成速度：K1（[E]-[ES]）[S]ES的分解速度：K2[ES]K1（[E]-[ES]）[S]=K2[ES]反应速度：KS现在称为底物常数2、

“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：Briggs和Haldane1925[ES]的动态平衡不仅与E+S

ES有关，还与ES

P+E有关。稳态平衡假说的贡献在于发展了快速平衡学说的第③点。所谓“稳态”：ES的形成速度与分解速度相等、ES的浓度保持不变的反应状态ES生成速度：k1（[E]-[ES]）[S]ES分解速度：k2[ES]+k3[ES]以上两个速度相等：k1（[E]-[ES]）[S]=k2[ES]+k3[ES]用稳态假说推导米式方程：Vmax=k3[E]（米氏常数）当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。（单体酶）（寡聚酶）当[S]《Km时当[S]》Km时，即酶被底物饱和时。当[S]=Km时（三）

米式方程中各参数的意义1、

快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别当K1、K2》K3时，即ES

P+E是整个反应平衡中极慢的一步：

“稳态平衡=快速平衡+慢速平衡”：当ES

P+E极慢（K3/K1极小）时，稳态平衡基本等于快速平衡

★都是K3惹的祸2、

Km的物理意义当反应速度v=1/2Vmax时，Km=[S]，Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。单位：mol·L-1或mmol·L-1，与底物浓度单位相同。Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件（如pH值和温度)有关，与酶的浓度无关。

P112表4-4一些酶的Km值。3、

Km与天然底物Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V对△[S]

越灵敏。V[S]1/2VmaxKm4、

Km、Ks与底物亲和力★Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。★Ks是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。1/Ks越大酶与底物的亲和力越大，反之越小。★只有当K1、

K2》K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。1/Km越大酶与底物的亲和力越大，反之越小。★底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势有关。即与K3／K1有关。问题：（1）

Km越小，底物亲和力越大（X）（2）

Ks越小，底物亲和力越大（√）（3）

天然底物就是亲和力最大的底物（X）（4）

天然底物就是Km值最小的底物（√）（5）底物亲和力越大酶促反应速度越大（X）（6）对于不同的酶或同一种酶的不同底物，Km越小反应速度越大（X）5、

Km与米式方程的实际用途（1）根据[S]求V（2）根据V（或相对速度a）求[S]设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9[S]0.9=9Km同理有：[S]0.8=4Km[S]0.7=2.33Km[S]0.6=1.5Km[S]0.5=1Km[S]0.1=1/9Km[S]0.9/[S]0.1=81[S]0.7/[S]0.1=21说明：米氏方程只适合一定条件下单底物，只形成一个酶底物复合物并只产生一个产物的酶促反应。但对于形成多个中间物，不只一个底物和不只一个产物的酶以及多酶复合体则不能解释。当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与[S]无关，只和[E]成正比。当v=1/2Vmax时，表示活性部位有一半被占据。（3）根据相对速度推测酶活性中心饱和度Y：（4）根据Km推测代谢的方向及程度★根据正逆反应Km的差别及细胞内正逆两相底物的浓度推测酶促反应的正逆方向。★根据代谢途径中各个酶的Km及其相应底物浓度判断限速步骤（Km最大的步骤不一定是限速步骤）★根据Km值的大小判断分支代谢的流向★酶工程与代谢工程中改造酶的Km调控代谢途径（强化则降低Km，弱化则提升Km

）6、

Vmax与K3（

Kcat）的意义在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。

Vmax=K3[E]K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat），表明酶的最大催化效率P113表4-5一些酶的最大转换数转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒7、Kcat/Kmrepresentsactualcatalyticefficiencybecause

invivo[S]/Km=0.01-1.0[S]<<Km时：Kcat/Km的上限是K1，既生成ES复合物的速度(酶促反应的速度不会超过ES的形成速度K1，在水相中不会超过108~109）只有Kcat/Km可以客观地比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率（四）

Km和Vmax的求解方法1、

Lineweaver-Burk

双倒数作图法1/Vmax1/Km1/[S]1/V斜率=Km/Vmax选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量：[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。2、

Eadie-HofsteeV—V/[S]作图法见p115。3、Hanes-Woolf作图法见p115。（4）Eisenthal作图法见王镜岩p363。（5）Hill作图法-LogKmLog[S]（寡聚酶）三、

多底物的酶促反应动力学（一）多底物酶促反应有

二种动力学机理1.sequentialreactions（single-displacementreactions):序列反应或单－置换反应1）Orderedreaction(orderedBiBi)，即有序反应2）Randomreactions(randomBiBi)，即随机反应2.Pingpongreactions（double-displacementreactions)，即乒乓反应或双－置换反应1、有序反应机理（orderedreactions,orderedBiBi)只有Leadingsubstrate(领先底物A)首先与酶结合，然后B才能与酶结合，形成的三元复合物EAB（ternarycomplex)转变为EPQ，B的产物P先释放，A的产物Q后释放。★在缺少A时，B不能与E结合E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQ★A与其产物Q相互竞争地结合EPEAAEAEBQEPBQEQ★反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数NAD与NADH相互竞争E上的NAD结合部位2、

随机反应机理（randomreactions)(randomBiBi)底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物AEB→QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。

示意图p119图4－11（b)★限速步骤是AEB→QEP★A与Q相互竞争E上的底物结合部位A，B与P相互竞争E上的底物结合部位B★反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数糖原磷酸化酶：糖原与小糖原竞争E上糖原结合部位，Pi与G-1-Pi竞争E上Pi结合部位3、乒乓反应机理Pingpongreactions（double-displacementreactions)底物A先与E结合成AE二元复合物，AE→PE’（修饰酶形式），释放第一个产物P，接着底物B与E’形成E’B，E’B→EQ，释放第二个产物Q示意图p119图4－11(c)★A与Q竞争自由酶形式E，B与P竞争修饰酶形式E’★整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式谷氨酸：草酰乙酸氨基转移酶符合双置换、双底物机制的酶★谷氨酸(A)与天冬氨酸(Q)竞争性结合E-磷酸吡哆醛，a-酮戊二酸(P)与草酰乙酸(B)竞争性结合E’-磷酸吡哆胺（二）双底物反应的动力学方程1、乒乓机制的动力学方程KmA：[B]达到饱和浓度时A的米氏常数KmA’：A的表观米氏常数Vmax：[A][B]都达到饱和浓度时的最大反应速度乒乓机制的动力学曲线(见p121图4－14）★乒乓机制的动力学曲线是两组平行直线★表观米氏常数KmA’（KmB’）随[B]（[A]）浓度的增大而增大★表观最大反应速度Vmax’随[B]（[A]）的增大而增大2、序列机制的底物动力学方程序列机制的动力学曲线(见p121图4－12和图4－13）★序列机制的动力学曲线是两组相交直线（交于X轴负侧）★交点在X轴：表观KmA’（KmB’）不随[[B]（[A]）浓度变化而变化（KmA’=KmA、KmB’=KmB）★交点在X轴上：表观KmA’（KmB’）随[[B]（[A]）浓度的增加而减小★交点在X轴下：表观KmA’（KmB’）随[[B]（[A]）浓度的增加而增大★表观最大反应速度Vmax’随[B]（[A]）的增大而增大四、

pH对酶促反应速度的影响1.pH影响酶活力的因素①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。③影响酶和底物分子中另外一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。2．酶的最适pH和稳定性pH最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。

最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。几种酶的最适pH，见P117。

★虽然大部分酶的pH—酶活力曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。五、

温度对酶促反应速度的影响。1．最适温度及影响因素温度对酶促反应速度的影响有两个方面：①提高温度，加快反应速度。②提高温度，酶变性失活。最适温度：在一定温度下，酶反应速度即酶活力最高，此温度叫酶的最适温度。温度—酶活力曲线一般也是钟形温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的Q10一般为1~2。温血动物的酶，最适温度35℃—40℃，植物酶最适温度40℃—50℃，细菌TaqDNA聚合酶70℃。最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、pH、离子强度等因素有关。2、酶的稳定性温度在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。

酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。六、

激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。无机离子或简单有机化合物对酶的激活。无机离子或蛋白酶对酶原的激活。1、

无机离子的激活作用（1）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+（2）阴离子：cl-、Br-、PO43-（3）氢离子

★不同的离子激活不同的酶。★不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+之间常常拮抗，但Mg+与Zn+常可替代。★

激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM2、

简单有机分子的激活作用①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。3、蛋白酶对酶原的激活七、

抑制剂对酶促反应速度的影响变性作用(denaturation)：失活作用：凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性变性剂没有选择性抑制剂：能对酶起抑制作用的物质。有不同程度的选择性研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控代谢或代谢控制发酵（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础（一）抑制程度的两种表示方法★相对活力分数（残余活力分数★相对活力百分数（残余活力百分数）2、抑制率★抑制分数★抑制百分数1、相对活力（二）抑制作用的类型1、不可逆的抑制作用：抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。专一性的不可逆抑制：用来研究酶的专一性即酶活性中心基团性质。非专一性的不可逆抑制：用来研究酶蛋白中哪些基团是必需的，以及研究酶的构象。2、

可逆的抑制作用抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。根据抑制剂与底物的关系可以分为三种类型。（1）竞争性抑制（Competitiveinhibition）

抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。P结构式丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制（2）非竞争性抑制底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。抑制剂与酶活性中以外的基团结合，其结构可能与底物无关。不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+（3）、

反竞争性抑制酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I→ESI≠P常见于多底物的酶促反应中（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别1、通过透析、超滤、凝胶过滤等2、通过V-E速度曲线

王镜岩P370图9-189-193、通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分三种可逆抑制作用（四）可逆抑制作用的动力学推出三种抑制方程。1、

竞争性抑制：E+S—ES—E+P,E+I—EI相对活力：抑制分数：动力学方程：（Ki为EI的解离常数）★抑制程度决定于[I]、[S]、Km和Ki★Vmax不变★Km变大，而且随[I]浓度的增大而增大交于y轴竞争性抑制作用小结：（1）

Vmax不变，Km变大。（2）抑制程度决定于[I]、[S]、Km和KiA.抑制程度与[I]成正比，与[S]成反比[I]一定，增加[S]，可减少抑制程度。[S]一定，增加[I]，可增加抑制程度。B.在一定[I]和[S]下，Ki越大，抑制作用越小，Km值愈大，抑制程度愈大。2.非竞争性抑制E+S—ES—E+P,E+I—EI+S—ESI,ES+I—ESI相对活力：抑制分数：

★抑制程度决定于[I]和Ki

，与底物的Km和[S]无关动力学方程：交于x轴★Km不变，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）非竞争性抑制小结：（1）Km不变，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）（2）抑制程度决定于[I]和Ki

，与底物的Km和[S]无关：

抑制程度与[I]成正比在一定[I]

下，Ki越大，抑制作用越小3.反竞争性抑制E+S—ES—E+P,ES+I—ESI相对活力：抑制分数：动力学方程：★抑制程度决定于Km、Ki、[S]、[I]★Km及Vmax都变小一组平行直线反竞争性抑制小结：（1）Km及Vmax都变小(2)抑制程度决定于Km、Ki、[S]、[I]抑制程度既与[I]成正比，又与[S]成正比在一定的[S]、[I]下，Ki越大，抑制程度越小；Km越大，抑制程度越小。P122表4-7小结：三种可逆抑制作用的酶促反应速度V与Km值（五）一些重要的抑制剂1、

不可逆抑制剂：

（1）、

非专一性不可逆抑制剂

与酶的活性中心以及活性中心外的某一类或几类必需基团反应1）、

有机磷的酰化物二异丙基磷酰氟（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药。Ｐ374结构式：磷酰化剂与DFPP374反应式：磷酰化剂与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶抑制机理：与蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂键。毒理：强烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。

解毒剂：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。2)、有机汞、有机砷化合物抑制机理：使酶的巯基烷化,抑制含巯基的酶。

P：对氯汞苯甲酸（PCMB）与巯基酶的反应

毒理：主要与还原型硫辛酸辅酶反应，抑制丙酮酸氧化酶系统。解毒剂：二巯基丙醇（BAL）、Cys、GSH等过量的巯基化合物。3)重金属

Ag、Cu、Hg、Cd、Pb在高浓度时能使大多数酶变性失活，低浓度时产生抑制作用，EDTA可解除。4)、烷化物含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等）常作用于酶中的巯基.氨基.羧基.咪唑基等，鉴定酶中巯基。5)氰化物、硫化物、CO与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。6)青霉素：与糖肽转肽酶活性部位丝氨酸羟基共价结合，使酶失活，抑制细菌细胞壁合成。（2）

专一性不可逆抑制剂此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团反应。1)、

Ks型不可逆抑制剂（亲和标记试剂，亲合修饰试剂）具有与底物相似的结构，可与酶活性中性非共价结合，同时还带有一个能与酶活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团，从而抑制酶的活性。因抑制是通过对酶的亲合力来对酶进行修饰标记的，故称为亲和标记试剂。专一性程度取决于它与活性中心非共价结合的解离常数及与活性中心外的基团共价结合的Ks之比。故这类抑制剂称为Ks型不可逆抑制剂。王镜岩P376

图9-25胰蛋白酶的底物及其Ks型不可逆抑制剂胰蛋白酶的最佳底物：对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯(TLME)Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TLCK）-CH2-cl与酶活性部位外的必须基团一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化，引起不可逆的失活。2）、

Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物,suicidesubstrate）具有与底物相似的结构，也是酶的底物，不仅能与酶结合，而且有一个潜伏的反应基团（latentreactivegroup）能被酶催化而活化，并与酶活性中心必需基团进行不可逆结合而使酶失活。有人称他为酶的自杀性底物。

王镜岩P376图9-26β-氯代-D-Ala抑制丙氨酸消旋酶的机制。此酶使D-Ala变成L-Ala。举例1：E.coli.β-羟基癸酰硫酯脱水酶：催化的反应：P反应式Kcat型不可逆抑制剂：（3，4-葵炔酰-N-乙酰半胱胺）此抑制剂能被酶催化生成连丙二烯结构，连丙二烯易与His咪唑反应，使酶失活。

P反应式举例2：炔类化合物是以FMN、FAD为辅基的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂。单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂（如组胺），引起高血压。

由于迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，因而能抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，降低血压。

2、

可逆抑制剂

★竞争性抑制剂（Competitiveinhibition）

许多代谢类似物都是竞争性抑制剂，可用作抗菌药物和抗癌药物。★磺胺类药物及其作用机理:对氨基苯磺酰胺或其衍生物对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制细菌的二氢叶酸合成酶活性;抗菌增效剂TMP是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂。蝶呤对氨基苯甲酸Glu二氢叶酸合成酶二氢叶酸四氢叶酸嘌呤核苷酸二氢叶酸还原酶一碳单位磺胺类药物磺胺类药物的抗菌机理：细菌不能利用外源叶酸，只能合成。TMP★抗癌药:氨基叶酸、阿拉伯糖胞苷、5-氟尿嘧啶等。★抑制剂与药物开发Kcat型不可逆抑制剂的专一性程度很强，前景广阔底物类似物型的竞争性抑制剂最易开发过度态底物类似物型药物最具价值(高效\特异)

八.酶浓度对酶反应速度的影响条件:1.[s]足够大，使酶饱和，则v与酶浓度成正比。2.酶必须是纯酶制剂或抑制剂的粗酶制剂。[enzyme]V一级反应九、

有机介质中的酶促反应传统观点：酶是水溶性生物大分子，只能在水介质中进行催化反应，有机介质会使酶变性。其实在细胞中，许多生物膜上的酶就是在低极性的微环境中发挥催化功能的。优点：①利于疏水性底物的反应。②可提高酶的热稳定性，提高催化温度。③能催化在水中不能进行的反应。④可改变反应平衡移动方向。⑤可控制底物专一性。⑥防止由水引起的副反应。⑦可扩大pH值的适应性等等。1、

有机介质中酶促反应的条件（1）、

必需水（结合水、束缚水）：脂肪酶：几个水分子/每个酶分子胰凝乳蛋白酶：50个水分子/每个酶分子乙醇脱氢酶：几百个水分子/每个酶分子可把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。（2）、对酶的要求：具有对抗有机介质变性的能力。（3）、合适的溶剂及反应体系（4）、合适的pH2、

有机介质对酶性质的影响（1）、稳定性a.热稳定性提高猪胰脂肪酶在醇和酯中进行催化反应，在100℃半衰期长达12h，其活性比25℃时还高几倍b.储存稳定性提高胰凝乳蛋白酶在20℃时，在水中半衰期只几天。在辛烷中，可放6个月，仍保持全部活性。（2）、活性升高活性降低活性酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。（3）、专一性脂肪酶在有机介质中有合成肽键的功能。（4）、反应平衡有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。例如：水解酶类（蛋白水解酶）在水介质中，水的浓度为55.5mol/L，平衡趋向水解方向，在含水量极低的有机介质中，平衡向合成方向偏移。（酶）合成产物溶剂合成收率枯草杆菌蛋白酶核糖核酸酶甘油90%50%无色杆菌蛋白酶胰岛素乙醇30%80%

凝血酶人生长素甘油80%20%（5）、分子印迹和pH记忆酶在冻干前可用配体作印迹。竞争性抑制剂，可诱导酶活性中心构象发生变化，而此种构象在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。pH记忆：酶在有机介质中能“记住”它最后存在过的水溶液的pH值，因该pH值决定了酶分子上有关基团的解离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持。第五节

酶的作用机理一

酶的活性中心1、活性中心的概念：活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位、催化部位。频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。

不需要辅酶的酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团。需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。2、

活性中心的结构特点：

接触残基：R1、R2、R6、R8、R9、R163辅助残基：R3、R4、R5、R164、R165结构残基：R10、R162、R169非贡献残基：其它酶蛋白必需残基非必需残基活性中心活性中心外接触残基辅助残基结构残基结合残基催化基团（1）接触残基：结合基团，催化基团。（2）辅助残基：不与底物接触，辅助酶与底物结合，协助接触残基上述两类基团构成酶活性中心。（3）结构残基维持酶分子三维构象，与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基。上述三类残基统称酶的必需基团（4）非贡献残基（非必需基团）可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。3、研究活性中心的方法（1）通过酶的专一性（2）酶的化学修饰法（3）亲合标记法（4）X射线晶体衍射法（5）分子生物学的方法4、活性中心的一级结构与分子进化一些酶的活性中心一级结构与催化机理相似，可把它们归为一族。蛋白水解酶：（1）丝氨酸蛋白酶家族（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等）（2）锌蛋白酶家族（羧肽酶等）（3）巯基蛋白酶家族（木瓜蛋白酶等）（4）羧基蛋白酶家族（胃蛋白酶等）丝氨酸蛋白酶族活性中心：胰蛋白酶（牛）Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys胰凝乳蛋白酶（牛）Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn弹性蛋白酶（猪）Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn凝血酶（牛）…Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro这4个源于哺乳动物的酶活性中心，都含有一个包括Ser在内的完全相同的六肽：Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Prou

同源的趋异进化来自胰脏的胰蛋白酶（Lys、Arg）、胰凝乳蛋白酶（Phe、Tyr、Trp、）和弹性蛋白酶（疏水残基），活性中心Ser附近的aa顺序相同，且分子一级结构中有40%aa顺序相同，三维结构也相似，表明它们起源于共同的祖先，但是它们的底物专一性不同，这叫同源的趋异进化。★来源于共同祖先，经基因突变而得出不同专一性的结果称为同源的趋异进化。

u

异源的趋同进化丝氨酸蛋白酶族活性中心：枯草杆菌蛋白酶：-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser

胰脏的胰凝乳蛋白酶等：Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro电荷中继网：枯草杆菌蛋白酶：Asp32-His64-Ser221胰凝乳蛋白酶：Asp102-His57-Ser195★枯草杆菌蛋白酶与胰凝乳蛋白酶等来源不同，功能特征相同，称异源的趋同进化。二、

专一性的机理（一）

酶专一性类型1、

结构专一性（1）、相对专一性★键专一性（如酯酶，对底物结构要求最低）★基团专一性GroupSpecificity不仅对键有要求，还对键一端的基团有要求，但对另一端基团要求不严格。α—D—Glc苷酶，水解蔗糖和麦芽糖。（2）、

绝对专一性只能作用于一个底物，或只催化一个反应。麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只催化尿素水解。2、

立体异构专一性（1）、

旋光异构专一性：如L-氨基酸氧化酶。（2）、

几何异构专一性反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成苹果酸

立体化学专一性还表现在酶能区分从有机化学观点看属于对称分子中的两个等同的基团，并只催化其中一个，而对另一个无作用。a.

甘油激酶只催化甘油中的一个CH2OH磷酸化。b.

顺-乌头酸酶只作用于柠檬酸的两个-CH2COOH中的一个。立体专一性在实践中的应用：药物的不对称合成或不对称拆分。用乙酰化酶制备L—氨基酸（二）

酶作用专一性的解释1、锁钥模型(lock-keyhypothesis)Fisher1894酶活性中心的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一部分像钥匙一样，专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物。酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。

王镜岩p334图8-5锁钥模型较好地解释了立体异构专一性。但不能解释可逆反应。2、

诱导楔合模型(induced-fithypothesis)Koshland1958酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。三、

酶催化高效性的机理

1、邻近效应与定向效应变分子间反应为分子内反应邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。邻近效应与定向效应对反应速度的影响：是主要因素，可使酶反应速度提高10的8次方倍。①使底物浓度在活性中心附近很高

②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用

③酶使分子间反应转变成分子内反应④邻近效应和定向效应对底物起固定作用

2、底物形变和诱导契合的催化效应酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能。①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。②底物形变，利于形成ES复合物。③底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能。3、

酸碱催化酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。

Specificacid-basecatalysis:即H+,OH-的催化。Generalacid-basecatalysis王镜岩p391表10－4酶分子中可作为广义酸碱的功能基团。Glu,Asp;Lys,Arg;Tyr;Cys;His等氨基酸残基。

影响酸碱催化反应速度的两个因素⑴酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。⑵给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期小于10-10秒4、

共价催化酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，这个中间物很易变成过渡态，因此反应的活化能大大降低，底物可以越过较低的能域而形成产物，从而提高反应速度。王镜岩p392表10-5形成共价ES复合物的某些酶亲核基团：能提供自由电子的基团。如酶中的Ser-OH，Cys-SH，His-N：亲电基团：能接受电子的基团。如底物磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glu-C-OH）；酶中的Tyr,Lys。酶中的亲核基团和亲电基团分别与底物中的亲电基团和亲核基团作用形成共价中间物，提高反应速度。因此，Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys常是酶的活性中性氨基酸残基。

5、活性中心金属离子的催化作用金属酶（metalloenzyme):含紧密结合的金属离子Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+，金属-激活酶（metal-activatedenzyme):含松散结合的金属离子Na+、K+、Mg2+、Ca2+

金属离子主要以三种方式参与催化过程：（1）通过结合底物为反应定向（2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应（3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷或静电稳定。6、

活性中心的微环境⑴疏水环境介电常数低，加强极性基团间的作用。⑵电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子四、

某些酶的活性中心及其作用机理（一）、

丝氨酸蛋白酶的作用机理：胰蛋白酶(trypsin)胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin)弹性蛋白酶（elastase)凝血酶（thrombin)枯草杆菌蛋白酶（subtilisin)纤溶酶（plasmin)乙酰胆碱酯酶（acytalcholinesterase)1、丝氨酸蛋白酶家族的底物专一性即结构特点1）丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser

-His-Asp催化三联体（电荷中继网）。王镜岩p407图10-34胰凝乳蛋白酶的催化三联体电荷中继网：Ser195—His57—Asp102氢键体系,Ser的羟基与His的咪唑基以及Asp的羧基与His的咪唑基形成氢健。通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。但它们活性中心的底物结合部位不同，底物专一性也不同。2）丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性王镜岩p408图10-35和教材p144图4－35胰脏中的三种蛋白酶的底物结合部位胰凝乳蛋白酶：口袋较大，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两个Gly组成），底部为丝氨酸，因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位。裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键胰蛋白酶：

口袋较大，上部为两个甘氨酸，底部有Asp，利于Lys.、Arg结合，裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键弹性蛋白酶：

口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成），底部为丝氨酸只能让Ala等小分子进入，裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键2、胰凝乳蛋白酶的动力学研究图10-36研究胰凝乳蛋白酶作用机制的人工底物图10-37胰凝乳蛋白酶的动力学曲线（1）（乙）酰化阶段：（2）脱（乙）酰化阶段图10-383、胰凝乳蛋白酶的催化机制1）丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser

-His-Asp催化三联体（电荷中继网）。王镜岩p407图10-34胰凝乳蛋白酶的催化三联体电荷中继网：Ser195—His57—Asp102氢键体系。通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。王镜岩p407图10-40在胰凝乳蛋白酶中催化三联体的作用没有底物时，Ser195—His57—Asp102形成一个氢键体系，His57是去质子化状态，Asp102的COO-通过氢键定位并固定His57。结合底物时：His57从Ser195接受一个质子，增加了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性，Asp102的COO-稳定过度态中His57的正电荷形式。2）

王镜岩p410

图10-42和教材p145图4－36胰凝乳蛋白酶反应的详细机制

第一阶段：酰化Ser195­--OH中的氧攻击肽键的羰基碳（共价催化），酶的His57咪唑H+与底物中的-NH形成氢键（酸碱催化），形成四联体过渡态（Ser195—O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+

），肽键断裂，氨基产物释放，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。第二阶段：脱酰电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羰基C原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，底物中的酸成分从Ser195上释放。（二）溶菌酶的作用机制（三）天冬氨酸蛋白酶的结构特点与作用机制第六节

多酶体系与酶活性的调节控制一、

多酶体系及其分类多酶体系：在完整细胞内的某一代谢途径中，由几个酶连在一起形成的反应链体系。可溶性的多酶体系（分散性的）：每个酶单独存在，彼此之间没有结构上的联系。如细胞基质中的糖酵解。结构化的多酶体系（多酶复合体）：各个酶非共价地结合在一起形成一定的结构形成多酶复合体。如丙酮酸脱氢酶复合体，脂肪酸合成酶复合体。定位在细胞结构上的多酶体系（结构化程度更高）：一般定位在细胞器的上，如呼吸链和光合链。

★

多酶体系具有自我调节能力（1）第一步反应往往是限速步骤，控制着全部反应序列的总速度。（2）反馈抑制与底物激活催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制，有的则是反应序列分叉处的酶或第一步的反应受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活；

二、

酶活性的调节控制和调节酶酶活性的调节有两种情况：1调节酶浓度：酶的诱导与阻遏2调节酶活性：反馈抑制、抑制剂与激活剂的调节、别构调节、可逆的共价修饰、酶原激活、同工酶形式的调节、激素及特异调控蛋白对酶活性的调节调节酶：活性可被调节的酶，主要是别构酶和共价修饰酶。（一）别构酶活性的别构调控1、

别构酶的结构特点和性质（1）

已知的别构酶都是寡聚酶，通过次级键结合（2）具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。（3）多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同位效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。（4）不遵循米式方程，动力学曲线是S型（正协同效应）或表观双曲线（负协同效应）。2.别构效应（或变构效应）：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）非共价结合后，诱导出或稳定了酶分子的某种构象，从而调节酶活性中心对底物的结合与催化作用受到影响即酶活性受到影响，从而调节美的反应速度及代谢过程，此种效应称为酶的别构效应。

3.调节物1）负调节物：当调节物同别构部位结合后，能降低或关闭别构酶酶的催化活性，这种调节物叫负调节物或负效应物。它常常是一个代谢途径的末端产物，是底物以外的分子。2）正调节物：有的别构酶可被它的专一性调节物激活，这样的调节物称为正调节物或正效应物。常是酶的底物或其它分子。同位效应或同促效应：别构酶受底物调节的效应。异位效应：别构酶受底物以外的分子调节的效应。有抑制和激活两种情况。3、天冬氨酸转氨甲酰酶—正协同效应的别构酶（aspartatetranscarbamylase,ATCase）ATCase催化的反应底物氨甲酰磷酸和天冬氨酸的结合是正协同的即具同位效应。图10-46ATCase的别构效应CTP终产物反馈抑制：降低酶与底物的亲和力，即具异位效应，不改变Vmax，ATP激活：增加酶与底物的亲和力，