显微物镜数值孔径图像式测量方法-编制说明

国家标准

《显微物镜数值孔径图像式测量方法》

编制说明

（征求意见稿）

中国科学院苏州生物医学工程技术研究所、

齐之明光电智能科技（苏州）有限公司、

苏州中科医疗器械产业发展有限公司等

2022年11月

第一章工作简况

一、任务来源

本标准编制任务来源于2022年4月22日国家标准化管理委员会发﹝2022﹞17号文“国家

标准化管理委员会关于下达2022年第一批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通

知”，属于国家标准制定，计划号为20220056-T-491，归口单位为全国光电测试标准化技术委

员会（SAC/TC487），项目周期为22个月。

立项之后，标准编写组针对本标准进行了充分论证，并召开了多次专家组会，与会专家

一致认为本标准的应用范围不止限于超分辨成像光学系统物镜的数值孔径测试，建议将其名

称调整为《显微物镜数值孔径图像式测量方法》。标准编写组于2022年9月26日，向中国科学

院条件保障与财务局提交“关于调整《超分辨成像光学系统物镜数值孔径图像式测量方法》

项目名称的申请”，详见附件一。该申请于2022年10月21日获得中科院条财局批准，详见附件

二。

二、协作单位和主要起草人及其所做的工作

起草单位：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所（简称“苏州医工所”）、齐之明光

电智能科技（苏州）有限公司（简称“齐之明”）、苏州中科医疗器械产业发展有限公司（简

称“苏州中科”）、苏州市计量测试研究所（简称“苏州计量所”）、中国计量科学研究院（简

称“中国计量院”）、中国科学院空天信息创新研究院（简称“空天院”）、中国计量大学、

宁波舜宇仪器有限公司（简称“舜宇仪器”）、宁波永新光学股份有限公司（简称“宁波永新”）。

主要起草单位及工作分配详见表1，主要起草人及工作分配详见表2。

表1主要起草人及工作分配

序号起草单位工作分配

1中国科学院苏州生物医学工程技术研究所牵头开展标准起草工作

2齐之明光电智能科技（苏州）有限公司起草标准与编制说明

3苏州中科医疗器械产业发展有限公司标准关键技术验证

4苏州市计量测试研究所标准关键技术验证

5中国计量科学研究院标准关键技术验证

6中国科学院空天信息创新研究院标准工作指导

7中国计量大学标准专业技术内容审核

1

8宁波舜宇仪器有限公司标准实验验证

9宁波永新光学股份有限公司标准实验验证

表2主要起草人及工作分配

序号起草人工作单位工作分配

1巩岩中国科学院苏州生物医学工程技术研究所标准总体负责人

2唐玉国中国科学院苏州生物医学工程技术研究所制定标准起草计划与实施方案

3张艳微齐之明光电智能科技（苏州）有限公司起草标准与编制说明

4郎松苏州中科医疗器械产业发展有限公司标准关键技术验证

5黎俊苏州市计量测试研究所标准关键技术验证

6徐英莹中国计量科学研究院标准关键技术验证

7王璞中国科学院空天信息创新研究院标准工作指导

8张淑琴中国计量大学标准专业技术内容审核

9胡森虎宁波舜宇仪器有限公司标准实验验证

10崔志英宁波永新光学股份有限公司标准实验验证

三、主要工作过程

本标准已经完成了调研、立项论证、工作组讨论稿起草、征求意见稿起草，下面详细对

每个阶段的工作过程进行概述。

（一）预阶段

众所周知，光学系统成像技术具备快速成像、无损观察等重要特点，在人类探索和发现

未知世界奥秘中扮演着重要角色。对于成像相关的研究而言，无论是宏观或是微观，其分辨

率都受限于光衍射特性限制，光学系统的空间分辨率不可能无限小[1]。传统光学成像系统的

空间分辨率最高只能达到观测波长的1/2，因此，在可见光波段，人类无法借助显微系统分辨

200nm以下的细节信息。

超分辨成像技术是近些年迅速发展的一项技术，该技术突破了光学衍射极限，将光学系

统的成像分辨率从几百纳米提高到了几纳米，极大地促进了微观科学的进步[2]。物镜作为超

高分辨成像光学系统中的核心部件，其数值孔径与系统能够达到最大分辨率直接相关。为了

实现更高的分辨率，超高分辨显微成像系统通常需要采用数值孔径大于1的物镜。

2

基于《国家重大科技基础设施建设中长期规划（2012—2030年）》“…启动大型成像和精

密高效分析研究设施建设…”的要求，中科院苏州医工所于2014年承担了国家重大科研装备

研制项目——“超分辨显微光学核心部件及系统研制”，其主要成果之一是超/高分辨率成像系

统的核心部件——超/高分辨物镜。该项目于2018年12月顺利通过验收，之后，中科院苏州医

工所对系列高端物镜进行了成果转化，在工程化过程中，发现现有技术手段都无法对高NA

物镜的数值孔径进行精确测试，严重影响了该类物镜性能指标的精确标识，进而影响该类高

端物镜的量产和真正商品化。

为了采用科学、先进手段对超高分辨显微光学成像系统的物镜的数值孔径进行精确测试，

项目组通过在国际标准化组织（ISO）、国际电工委员会（IEC）、美国国家标准学会（ANSI）、

英国标准学会（BSI）、德国标准化学会（DIN）、法国标准化协会（AFNOR）、西班牙标

准认证协会（AENOR）、日本工业标准调查会（JISC）、全国标准信息公共服务平台等国内

外知名标准机构检索，检索到与显微成像物镜相关的标准包括：中华人民共和国国家标准

GB/T2609-2015《显微镜物镜》[3]、中华人民共和国国家标准GB/T22056-2018《显微镜物

镜和目镜的标志》[4]、广东省地方标准DB44/T1529.1-2015《显微镜物镜标志第1部分：平

场》[5]、广东省地方标准DB44/T1529.2-2015《显微镜物镜标志第2部分：色差校正》[6]。

只有标准《显微镜物镜》规定了物镜数值孔径测量方法，即利用阿贝数值孔径计、显微镜

架、对中望远镜和针孔光阑对物镜数值孔径进行测试。该方法需要测试人员对游标进行手动

调节，通过人眼确定调节是否准确，并读取游标上的数值。这种方法主要存在以下两点缺陷：

（1）严重依赖操作人员，无法避免人眼观测带来的随机误差；（2）对数值孔径大于1的浸液

物镜，需要改进测试装置，测试过程更为复杂，存在较大测试误差。

为了打破这方面的技术壁垒，促进我国大数值孔径物镜产业的健康发展，并推动国产超

高分辨成像光学系统的自主研制，我们于2018年4月成立了国家标准《超分辨成像光学系统

物镜数值孔径图像式测量方法》预研工作组，开展国家标准预研工作。国家标准预研工作组

通过专家交流、文献检索、专利检索等方式，开展了国内外针对数值孔径大于1的浸液物镜的

数值孔径检测技术调研。

1993年，W.Lehmann等人提出一种直接测量方法，该方法根据数值孔径的定义，通过测

试物镜焦距、放大率以及物镜在像平面的聚焦角来计算数值孔径[10]。该方法需要测试的参

数较多，且光线角度测试难度和误差较大，直接影响数值孔径测试精度。1995年，M.Muller

等人提出一种间接测量方法，该方法通过测试物镜焦面场，计算得到点扩散自相关函数

（PSAF），进而反推得到待测物镜的数值孔径，但这一方法计算较复杂，也极易受到测试装

3

置误差的影响[9]。2005年，LuruDai等人提出一种新型测量方法，如图1，该方法利用荧光物

质的反射特性将物镜物方聚焦角度转化为后焦面孔径分布，并由相机记录，进而计算得到物

镜数值孔径[11]。但该方法面临荧光分子漂白和不稳定、荧光物质与盖玻片之间存在空气间隙

等问题。

图1基于荧光物质反射特性的物镜数值孔径测量方法

国内方面，2017年，长春长光华大智造测序装置有限公司申请的发明专利《物镜数值孔

径的检测方法及装置》描述了一种利用波像差探测器和反射镜对待测物镜波前像差进行测试，

再根据波前像差计算待测物镜的数值孔径[12]，如图2，该方法适用于空气物镜和浸液物镜，

但检测精度受反射镜面形和浸液均匀度等影响，且装调难度较大。2018年，南京大学申请的

发明专利《一种基于计算成像的光学镜头数值孔径测量方法》所述方法是利用待测物镜搭建

显微成像系统，并对标识物体进行成像，通过计算图像的频域支持域获取待测物镜的数值孔

径[13]，如图3，该方法中支持域边界的提取受标识物体空间频率、待测物镜数值孔径、相机

像元尺寸等影响，精度有限。2019年，北京航空航天大学申请的发明专利《一种基于衍射光

栅的显微物镜数值孔径测量方法》，其原理是光束通过衍射光栅后发生多缝衍射，不同角度

的光束经待测物镜聚焦在物镜后焦面处，形成衍射条纹，通过确定衍射条纹位置和后焦面视

场边界位置可计算得到待测物镜的数值孔径[14]，如图4，该方法需要高精度光栅，同时也涉

及到大数值孔径物镜如何浸液。

4

图2一种基于波像差的物

图3一种基于计算成像的光学镜头数值孔径测量方法

镜数值孔径检测方法

图4一种基于衍射光栅的物镜数值孔径测量方法

此外，国内很多单位，如中科院苏州生物医学工程技术研究所、苏州中科医疗器械产业

发展有限公司、齐之明光电智能科技（苏州）有限公司、中国计量科学研究院、舜宇光学、

北京航空航天大学等正在开展物镜研制、生产和测试方面的工作，对物镜数值孔径的测量方

法也都进行一定的试验研究，但尚未形成统一且一致的标准化测量方法。

国家标准预研工作组经过调研发现，大数值孔径物镜在超高分辨成像光学系统中具有极

其重要的应用，其数值孔径是表征物镜和成像系统的重要参数，相关研究和生产领域对于制

定统一且可操作性强的大数值孔径测量方法具有迫切需求。目前，国内很多单位已具备制定

国家标准《超分辨成像光学系统物镜数值孔径图像式测量方法》的条件。

（二）立项阶段

5

2018年8月：根据预阶段的调研情况，为了满足超高分辨成像光学系统物镜的大数值孔

径测试需求，我们成立了国家标准《超分辨成像光学系统物镜数值孔径图像式测量方法》申

报工作组，起草了《超分辨成像光学系统物镜数值孔径图像式测量方法国家标准化指导性技

术文件项目建议书》和国家标准《超分辨成像光学系统物镜数值孔径图像式测量方法》草案。

2018年9月：根据标准草案测量方法，开展试验验证工作。

2018年10月：在北京参加了全国光电测试标准化技术委员会组织的国家标准立项评审，

根据评审意见，修改完善了推荐性国家标准项目建议书和草案。

2019年12月：参加了国家标准技术审评中心组织的国家标准立项评估会，经专家质询，

建议对提交的标准文本进行修改完善。

2020年3月~8月：进一步改进测量方法和测试仪器，并对标准文本进行修改完善。

2021年7月：提交到苏州“生物医疗标准化工作组”委员会议，与会专家肯定了标准的编写

原则和文本结构，根据专家意见，再次修改完善了推荐性国家标准项目建议书和草案。

2021年11月：参加了国家市场监督管理总局国家标准技术审评中心组织的推荐性国家标

准立项评估会，经专家质询，通过立项评估。

2022年4月28日：国家标准化管理委员会下达推荐性国家标准计划，计划号为20220056-

T-491，项目周期为22个月。

（三）起草阶段

（1）起草工作组讨论稿

2022年4月：为了顺利完成国家标准项目，由苏州医工所牵头成立了“超分辨成像光学系

统物镜数值孔径图像式测量方法”标准编写工作组。

2022年5月-6月：标准编写工作组根据前期调研的物镜数值孔径国内外先进测量方法，召

开了2次内部研讨会，对标准的各项技术细节进行了完善。

2022年7月：为了提高本标准的普适性，标准编写工作组与全国光学和光子学标准化技

术委员会（SAC/TC103）取得了联系，经过双方协商，一致同意将本标准名称修改为《显微

物镜数值孔径图像式测量方法》，由全国光电测试标准化技术委员会（SAC/TC487）主导、

SAC/TC103辅助共同完成本标准的制定，本标准归口单位为两个标委会。

2022年8月-9月，标准编写工作组对本标准的实验方案进行了改进，并根据改进方案进行

了一系列实验，完成了两款显微物镜数值孔径的测试、不确定度分析以及标准文件的修改。

6

2022年9月26日，召开标准预审会，标准编写组对标准文件、试验报告和编制说明进行了

详细汇报，专家组对标准文件进行了审查，并提出多项意见，最终同意本标准修改完善后形

成专家审议后的工作组讨论稿，提交标委会年会。

（2）起草征求意见稿

2022年10月28日，标准编写工作组参加了全国光电测试标准化技术委员会（SAC/TC487）

年度会议，编写工作组汇报了本标准基本情况，与会专家审议了标准相关文件，并提出了多

项建议。标准编写工作组针对各项意见进行了修改，最终形成征求意见稿。

第二章国家标准编制原则和确定国家标准主要内容的论据

一、国家标准编制原则

统一性——标准各部分的文体和术语应保持一致，相同条款应使用相同措辞表述。

协调性——标准各部分的内容应相辅相成，自成体系。

适用性——标准的内容应便于实施，具有可操作性。

一致性——标准的内容应与有关的现行法律、法规和强制性国家标准保持一致。

规范性——标准的编写规则应遵循GB/T1.1-2020与GB/T20001.4-2015的规定。

二、确定国家标准主要内容论据

（一）测试原理

本标准根据大数值孔径显微物镜数值孔径的测试需求，确定了显微物镜数值孔径图像式

测量方法作为本标准的主要内容，该测量方法适用于数值孔径大于1.0的无限远校正显微物

镜，测试原理如图5。

测量光光源发出的光经过准直扩束镜组形成一束平行光，该平行光经分光棱镜反射后进

入待测物镜，再经浸液后聚焦于盖玻片下表面。盖玻片下方为空气，光线由盖玻片入射到空

气时，会发生反射和折射。将入射光线与盖玻片法线之间的夹角定义为入射角。基于全反射

原理，入射角大于全反射临界角的光线将发生全反射，入射角小于临界角的光线的将小部分

反射和大部分折射。经盖玻片下表面反射的光线再次经待测物镜形成一束边缘强、中心弱的

圆环形平行光束，最后经分光棱镜到达图像传感器。

图像传感器接收到的图像为一个中心亮度低、边缘亮度高的圆环形图案，称为物镜数值

孔径测试图像。中心亮度低的圆形区域是由入射角小于全反射临界角的光线形成，边缘亮度

高的圆环部分由入射角大于全反射临界角的反射光线形成。因此，中心亮度低的圆形区域的

7

边界由入射角为全反射临界角的光线形成，其直径称为全反射圆直径；整个圆环图案的边缘

由入射角最大的光线形成，其直径称为最大数值孔径圆直径。

标引序号说明：

1——LED光源；9——测量光光源；

2——聚光镜；10——准直扩束镜组；

3——盖玻片；11——入射角大于全反射临界角的光线；

4——浸液；12——入射角小于全发射临界角的光线；

5——待测物镜；13——载物台；

6——分光棱镜；14——调焦机构；

7——镜筒透镜；15——物镜数值孔径测试图像。

8——图像传感器；

图5显微物镜数值孔径图像式测试原理图

如图1所示，当待测物镜出射的光线在盖玻片与空气界面发生全反射时，该光线在浸液

和盖玻片介质中的入射角满足公式（1）。

푛1sin(휃1)=푛2sin(휃2)=1………………...…………..（1）

8

式中：

n1——浸液的折射率；

θ1——光线在浸液中的入射角，单位为度（°）；

n2——盖玻片的折射率；

θ2——光线在盖玻片中的入射角，单位为度（°）。

从待测物镜出射的边缘光线的入射角由待测数值孔径决定，该光线在浸液和盖玻片介质

中传播，满足公式（2）。

푛1sin(훼1)=푛2sin(훼2)=푁퐴…..……………..……..（2）

式中：

α1——光线在浸液中的最大入射角，单位为度（°）；

α2——光线在盖玻片中的最大入射角，单位为度（°）；

NA——待测物镜的数值孔径。

对于无限远校正物镜，其全反射圆直径与数值孔径圆直径分别由公式（3）和公式（4）

计算得到。

퐷内=2푛1푓osin(휃1)…….………….……………..（3）

퐷外=2푛1푓osin(훼1)…….……….………………..（4）

式中：

D内——全反射圆直径，单位为毫米（mm）；

푓표——待测物镜的焦距，单位为毫米（mm）；

D外——数值孔径圆直径，单位为毫米（mm）。

联立公式（1）（2）（3）（4），可得到待测物镜的数值孔径计算公式（5）为：

퐷

푁퐴=外….………………...…………….（5）

퐷内

（二）仿真分析

利用LightTools光学仿真软件，根据本标准的测试原理，搭建了仿真光路，待测物镜为数

值孔径1.30的显微物镜，在合适位置设置探测器接收光信息，光路结构和仿真得到的数值孔

径测试图像如图6所示，利用图像处理算法对该图像进行处理，计算得到的数值孔径为1.3035。

9

图6数值孔径测试仿真光学结构及探测到的数值孔径测试图像

（1）离焦量仿真

考虑到待物物镜具有一定的景深，待测物镜与盖玻片之间的距离无法准确保证，对于大

数值孔径物镜，其景深约为1.0μm。仿真时改变物镜与盖玻片之间的距离，即改变离焦量，得

到相应的探测图像，并对其进行处理，计算得到数值孔径，结果如表3所示。在准焦位置上下

偏移1.0μm，可保证测试误差在0.5%以内，偏移3μm，测试误差将达到1.8%。因此，在数值孔

径测试实验中，必须采取一定的方法保证物镜离焦量小于1.0μm。

表3离焦量与测试得到的数值孔径的关系

离焦量/μm计算得到的数值孔径（NA）相对测试误差

-3.01.2796-1.57%

-2.01.2875-0.96%

-1.01.2964-0.28%

-0.21.30550.42%

0.01.30350.27%

+0.21.30330.25%

+1.01.2938-0.48%

+2.01.2839-1.24%

+3.01.2776-1.72%

（2）光束发散角仿真

10

理论上，入射待测物镜的光束应为理想的平行光，但实际测试中，光束都具有一定的发

散角，因此，需要对测试光束的发散角进行仿真分析。在仿真中，依次改变入射光束的发散

角，得到相应的探测图像，再对其进行图像处理，得到数值孔径，仿真结果如表4。当测试光

束发散角优于0.4mrad时，可保证测试误差在0.8%以内，当光束发散角达到4.0mrad时，测试

误差高达13.5%。因此，在数值孔径测试实验中，需对测试光束的发散角进行精确测试，保证

其发散角小于0.4mrad。

表4光束发散角与测试得到的数值孔径的关系

发散角/mrad计算得到的数值孔径（NA）测试误差

0.01.30350.27%

0.41.30960.74%

1.01.33092.38%

2.01.37345.65%

4.01.475313.48%

（三）测试装置

物镜数值孔径图像式测试装置见图7，包括测量照明模块、成像照明模块、测试模块、调

焦模块、探测模块及数据处理模块。

图7显微物镜数值孔径图像式测试装置

11

测量照明模块：由光源和准直扩束镜组构成。该模块输出的测量光束应满足发散角小于

0.4mrad，光束口径大于待测物镜的出瞳，光斑光强分布均匀。

当测量光源为激光时，为了尽量抵消激光的相干性，测试照明模块中需要集成消散斑结

构。消散斑方法主要包括引入振动或旋转的散射体、利用空间相位调制元件调整光束波前相

位、振动或移动光路中的光学元件等方法[15]。本装置采用高速转台带动毛玻璃旋转的方法，

经实验证明，消散斑效果良好，如图8所示。

图8消散斑前与消散斑后的物镜数值孔径测试图像

成像照明模块：由LED光源和聚光镜构成，用于对待测物镜进行透射照明。

测试模块：由分光棱镜、浸液、盖玻片构成。消散斑后的平行光束由分光棱镜反射后进

入待测物镜，经待测物镜和浸液后会聚于盖玻片下表面，不同入射角的光线以不同的反射率

反射后，再次经过待测物镜转换为平行光束，并通过分光棱镜进入探测模块。分光棱镜的反

射与透射分光比为1:1，浸液和盖玻片的选择以待测物镜型号为准。

需要注意的是，在物镜设计时，盖玻片和浸液均被看作是物镜的一部分，共同参与物镜

的设计与优化，因此每只物镜均有与其匹配的盖玻片和浸液。盖玻片的厚度、折射率和色散

的公差按JB/T8230.4要求[17]。为了提高数值孔径，物镜需要浸液，常用的浸液有油、水或甘

油，其折射率、色散等性能应满足GB/T26600要求[18]。测试时，需准备满足要求的盖玻片和

浸液。

调焦模块：由调焦机构和载物台构成，用于精确调节待测物镜与盖玻片之间的距离。调

焦机构分辨率应优于待测物镜景深的二分之一。以NA1.49显微物镜为例，其景深约为0.37μm，

因此本装置所采用的调焦机构分辨率为0.1μm，可满足调节精度。

探测模块：由镜筒透镜、图像传感器（CCD或CMOS）构成。该模块有两种工作模式：

（1）对焦模式，镜筒透镜置于测试光路中，与待测物镜联合使用，确保待测物镜焦面与图像

传感器探测面为共轭关系，通过透射照明，实现对盖玻片下表面图案的成像，该工作模式的

12

光路结构见图9；（2）测试模式，完成待测物镜的对焦之后，将镜筒透镜移出光路，图像传

感器接收经盖玻片下表面反射回的光束，得到物镜数值孔径测试图像。图像传感器的探测面

应大于待测物镜出瞳，且分辨率优于400像素*400像素，保证物镜数值孔径测试图像被有效

记录。

标引序号说明：

1——LED光源；6——分光棱镜；

2——聚光镜；7——镜筒透镜；

3——盖玻片；8——图像传感器；

4——浸液；15——载物台；

5——待测物镜；16——调焦机构。

图9对焦模式的光路结构

数据处理模块：对图像传感器探测到的数值孔径测试图像进行处理，主要包括：利用最

大类间方差算法计算图像二值化阈值，并对图像进行二值化处理；遍历二值化图像，提取边

界像素，并根据边界像素与图像中心的距离，将边界像素分为外圆边界和内圆边界；根据内

圆和外圆边界像素坐标，分别对其进行圆拟合，计算内圆和外圆直径，其中内圆直径为全反

射圆直径，外圆直径为最大数值孔径圆直径；按照公式（5）计算得到待测物镜数值孔径。

13

图10数值孔径测试图像处理：(a)原始图像；（b）二值化图像；（c）边界提取结果

第三章主要试验（或验证）的分析、预期的经济效果

一、主要试验分析

根据本标准制定的物镜数值孔径测量方法，起草单位建立了相关测试装置。为了验证本

标准制定的数值孔径测量方法的可行性，标准工作组进行了详细的试验分析。

（一）测试装置调试

完成测试装置的初步集成之后，需要对测试装置的光路进行了精确调试，主要包括：

（1）通过调节激光器、消散斑结构以及准直扩束镜组之间的距离和位置，保证三者的光

轴重合，最终实现激光照明模块输出的光束光斑能量分布均匀，光束发散角为0.36mrad，满

足设计要求；

（2）经扩束后的测试光束口径为36.8mm，大于显微物镜出瞳口径；

（3）测试光束经分光棱镜反射，到达待测物镜，通过精密调节，保证测试光束光轴与待

测物镜光轴重合；

（4）通过机械结构保证待测物镜与镜筒透镜的光轴重合，测试光路的光轴与图像传感

器的探测面垂直。

（二）对焦方法验证

仿真分析结果表明，待测物镜与盖玻片之间的距离，即待测物镜的离焦量对数值孔径测

试结果影响较大，因此必须保证待测物镜准确对焦。首先，我们直接利用数值孔径测试光路

对其进行测试，图像传感器观测到的图像为一个圆环行光斑，且圆环形光斑会随着待测物镜

与盖玻片之间的距离不断变化，如图11所示。通过对这些图像进行处理，计算得到的数值孔

径值变化极大，从1.467变化至1.586，因此该方案无法准确判断待测物镜是否对焦，测试误差

大，重复测试精度低。

14

图11数值孔径测试图像随物镜工作距离变化而变化

基于上述实验结果，我们提出一种与现有测试方案兼容的物镜对焦方法，如图9所示。在

对焦工作模式下，将镜筒透镜置于光路中，利用透射照明光对盖玻片下表面的标记物进行成

像，通过精密调节盖玻片与待测物镜的距离，实现标记物的清晰成像，如图12所示。此时可

保证待测物镜处于准确对焦位置，然后再将测试光路切换至如图5所示结构，开展数值孔径

测试。该对焦方法可有效提高测试精度和重复测试精度。

图12待测物镜对焦方法

（三）图像处理算法分析

对图像传感器探测到的数值孔径测试图像进行处理，主要包括以下三个步骤：（1）图像

二值化；（2）提取边界像素；（3）计算圆直径；（4）计算数值孔径。下面将对其进行详细

分析。

（1）图像二值化，典型的数值孔径测试图像如图13所示，由其局部放大图可知，外圆边

界较为清晰，内圆边界有一定的过渡区域，因此二值化时，需针对外圆边界和内圆边界设置

不同的阈值。经实际测试与分析，最终确定内圆的二值化阈值为总能量的70%，外圆的二值

化阈值利用最大类间方差算法计算得到。

15

图13数值孔径测试图像原始图及二值化结果

（2）提取边界像素

通过遍历二值化图像，提取边界像素坐标，并将其分为内圆像素点合集和外圆像素点合

集，如图14所示。

图14物镜数值孔径测试图像边界提取结果

（3）计算圆直径

根据内圆和外圆边界像素坐标，分别对其进行圆拟合，圆拟合方法为最小二乘法，在拟

合过程中，需要不断剔除超出拟合残差的坐标点，保证所有参与圆拟合的坐标点均具有较小

的拟合残差，最终得到内圆直径与外圆直径。

（4）计算数值孔径

内圆直径为全反射圆直径，外圆直径为数值孔径圆直径，按照公式（5）计算得到待测物

镜的数值孔径。

（四）不确定度分析

16

参考《JJF1059.1-2012测量不确定度评定与表示》，根据不确定度传播律以及数值孔径

计算公式（5）可知，其不确定度与数值孔径圆直径和全反射圆直径有关，物镜数值孔径测试

结果的合成标准不确定度计按公式（6）计算：

22

푈푈

̅̅̅̅√퐷外퐷内（）

푈푁퐴=NA(̅̅̅̅̅)+(̅̅̅̅̅).…….…….…….………….6

퐷外퐷内

式中：

푈푁퐴——数值孔径的合成标准不确定度；

푁퐴̅̅̅̅——数值孔径测试结果算术平均值；

푈퐷外——数值孔径圆直径的不确定度，单位为像素数量；

̅̅̅̅̅

퐷外——数值孔径圆直径的算术平均值，单位为像素数量；

푈퐷内——全反射圆直径的不确定度，单位为像素数量；

̅̅̅̅̅

퐷内——全反射圆直径的算术平均值，单位为像素数量。

不确定度评定方法分为A类和B类，其中，A类方法采用多次重复测试，B类方法主要

分析仪器的不确定度和测试时的估计误差，一般情况下，后者远小于前者，可忽略不计。下

面以NA1.49显微物镜数值孔径测试为例，对其进行不确定度分析。

按标准所述测试步骤，对OlympusNA1.49进行10次重复测试，测试结果见表5。

表5NA1.49显微物镜数值孔径测试结果

数值孔径圆直径全反射圆直径

测试次数数值孔径

像素数量像素数量

1471.66313.841.503

2472.88312.611.513

3470.59312.991.504

4466.48318.031.467

5466.60316.841.473

6474.99314.801.509

7473.43315.941.498

8469.22317.931.476

9473.99317.581.492

10470.40318.001.479

17

算术平均值471.02315.861.491

数值孔径圆直径和全反射圆直径的A类标准不确定度按公式（7）计算：

∑푁(푥−푥̅)2

푢=√푖=1푖…….…….………….（7）

퐴푁(푁−1)

式中：

푢퐴——A类标准不确定度；

푥푖——第i次测试结果；

N——测试次数；

푥̅——N次测试结果的算术平均值。

由于测量次数有限（10次），需要对A类标准不确定度进行修正，修正因子푡푝参照

JJF1059.1-2012中附录B确定取值为2.26（0.95置信概率），修正公式（8）为：

푈퐴=푡푝푢퐴…………….………….（8）

式中：

푈퐴——修正后的A类标准不确定度；

푡푝——修正因子。

最终利用A类评定方法得到数值孔径圆直径与全反射圆直径修正后的A类标准不确定

度分别为：，。

푈퐴_퐷外=2.106푈퐴_퐷内=1.535

B类方法主要通过圆拟合精度分析数值孔径圆直径和全反射圆直径的不确定度，经过仿

真分析与实验验证，数值孔径圆和全反射圆直径的拟合精度为5个像素，考虑到拟合圆直径

可能值的分布为矩形（均匀）分布，参照JJF1059.1-2012中表3，置信因子푘取值应为√3。

按照公式（）可计算得到两者的类标准不确定度，分别为：。

9B푈퐵_퐷外=푈퐵_퐷内=2.887

푎

푈=………….………...….…….………….（9）

퐵푘

式中：

푈퐵——B类标准不确定度；

푎——拟合圆直径可能值的半宽度；

푘——置信因子。

按照公式（10）计算全反射圆直径和数值孔径圆直径的合成标准不确定度分别为：

，。

푈퐷外=3.574푈퐷内=3.270

22

푈=√푈퐴+푈퐵….…….………….（10）

18

式中：

푈——合成标准不确定度。

将上述计算结果带入公式（6），计算得到数值孔径的合成标准不确定度为푈푁퐴=0.019。

（五）实验分析

全国光电测试标准化技术委员会秘书处组织起草单位，选取具有代表性的两款大数值孔

径物镜，开展了试验验证工作，详细记录了试验条件、试验装置、试验步骤和试验数据。被

测物镜信息和最终测试结果如表6所示。试验结果表明，本标准制定的显微物镜数值孔径测

量方法具有良好的重复精度和可操作性。

表6物镜数组孔径测试结果

序号型号研制单位数值孔径测试结果

1NA1.4960X奥林巴斯1.491

2NA1.45150X奥林巴斯1.449

二、预期的经济效果

超分辨显微光学成像技术突破了传统光学系统的衍射极限，将分辨率从几百纳米提升至

几纳米，极大地促进了微观科学的进步，在生命科学、纳米技术、材料科学和半导体等领域

都具有广泛的应用前景。据统计，2019年全球超高分辨率显微镜市场规模为26亿美元，预计

从2020年到2027年复合增长率为8.7%，推动该市场增长的关键因素包括：在生命科学行业中

应用的不断增加、技术进步以及对纳米技术的日益关注。物镜作为超高分辨成像光学系统的

核心部件，其性能直接决定了成像质量，特别是数值孔径与成像系统分辨率息息相关。

本标准制定的数值孔径图像式测量方法适用于超高分辨显微光学成像系统所使用的大

数值孔径物镜，解决了传统数值孔径计测试误差较大的问题，为客观定量评价大数值孔径物

镜性能提供了标准。本标准可有效指导物镜的研制、生产、使用、计量等单位科学规范开展

相关评价工作，从而提高超高分辨光学成像系统的观测能力，促进超高分辨系统在生物医学、

纳米技术、材料科学等领域的应用，也将大大推动我国高端物镜和超高分辨显微镜产业的良

性发展。

19

第四章采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水

平的对比情况

本标准编制工作组在国际标准化组织（ISO）、国际电工委员会（IEC）、美国国家标准

学会（ANSI）、英国标准学会（BSI）、德国标准化学会（DIN）、法国标准化协会（AFNOR）、

西班牙标准认证协会（AENOR）、日本工业标准调查会（JISC）等国际知名标准机构检索，

未发现与显微物镜数值孔径测试相关的国际标准和国外标准。因此，本标准没有可以采用的

国际标准和国外先进标准。

第五章与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系

本标准与现行法律、法规和强制性国家标准的关系是一致的，无冲突。

第六章重大分歧意见的处理经过和依据

本标准在编制过程中无重大分歧意见。

第七章国家标准作为强制性国家标准或推荐性国家标准的建议

建议本标准为推荐性国家标准。

第八章贯彻国家标准的要求和措施建议

一、组织措施

为了贯彻国家标准执行，建议本标准发布后，开展宣传和培训工作，推动相关产业方对

标准的认识与理解，提高国家标准为社会经济发展创造价值的驱动能力，扩展贯彻国家标准

执行的范围。

二、技术措施

本标准实施后，建议作为数值孔径大于1.0的无限远校正显微物镜的数值孔径检验的依据，

其它类型无限远共轭距镜头可参照执行，主要面向研发、生产、使用、计量等相关单位使用。

三、过渡办法

本标准的实施能够填补国内外大数值孔径物镜数值孔径检验标准的空白，提升大数值孔

径物镜在生物医学、纳米技术、半导体等领域的应用能力，促进国民经济质的提升，建议尽

快将本标准发布、实施，在相关领域进行推广应用。

在本标准发布、实施之前，为了弥补标准缺失可能引发的贸易壁垒，建议采用本标准的

送审稿开展的物镜数值孔径测试，为大数值孔径物镜的客观评价提供依据。

20

第九章废止现行有关标准的建议

无。

第十章其他应予说明的事项

无。

参考文献

[1]GUM.Advancedopticalimagingtheory[M].SpringerVerlag,2000.

[2]陈婕,刘文娟,徐兆超.多种超分辨荧光成像技术比较和进展评述[J].色谱,2021,

39(10):10.

[3]GB/T2609-2015《显微镜物镜》.

[4]GB/T22056-2018《显微镜物镜和目镜的标志》.

[5]DB44/T1529.1-2015《显微镜物镜标志第1部分：平场》.

[6]DB44/T1529.2-2015《显微镜物镜标志第2部分：色差校正》.

[7]ISO10934-2《光学和光学仪器.显微镜词汇.第2部分:光学显微镜的先进技术》.

[8]张粹玲,张蓓.无限共轭距物镜的数值孔径全自动测量方法与系统[J].仪器仪表学报,

2021,42(05):9~16.

[9]LehmannW,WachtelA.Numericalaperturesoflightmicroscopeobjectives[J].Journalof

Microscopy,1993,169(1):89-90.

[10]MullerM,BrakenhoffGJ.Characterizationofhigh-numerical-aperturelensesbyspatial

autocorrelationofthefocalfield[J].OpticsLetters,1995,20(21):2159~2161.

[11]Luru,Dai,Ingo,etal.Measuringlargenumericalaperturesbyimagingtheangulardistribution

ofradiationoffluorescingmolecules[J].OpticsExpress,2005,13(23):9409~9414.

[12]苗亮,孙志远等.物镜数值孔径的检测方法及装置[P].中国,ZL201711437047.4,

2019.07.02.

[13]徐飞,田云飞等.一种基于计算成像的光学镜头数值孔径测量方法[P].中国,

ZL201811253669.6,2019.03.08.

[14]张蓓,肖天宇等.一种基于衍射光栅的显微物镜数值孔径测量方法[P].中国,

ZL201910342715.8,2019.06.21.

[15]伏霞,邓泽微.激光消散斑技术综述[J].中国新通信,2018,20(19):143.

[16]JoyeuxD,LowenthalS.SpeckleRemovalbyaSlowlyMovingDiffuserAssociatedwitha

21

MotionlessDiffuser[J].JournaloftheOpticalSocietyofAmerica,1971,61(7).

[17]JB/T8230.4-1997显微镜用盖玻片.

[18]GB/T26600-2011显微镜光学显微术用浸液.

[19]GB/T7962.1-2010无色光学玻璃测量方法第1部分：折射率和色散系数.

[20]韦秋叶，范晓辉.液体折射率的测量方法研究进展[J].计量科学与技术，2022，66(1):14-

18.

[21]GB/T22055.1-2008显微镜物镜螺纹第1部分：RMS型物镜螺纹（4/5in×1/36in）.

[22]GB/T22055.2-2008显微镜物镜螺纹第2部分：M25×0.75mm型物镜螺纹.

[23]JJF1059.1-2012测量不确定度评定与表示

22

附件一

23

24

附件二

25

26

27

28

目次

第一章工作简况.....................................................................................................................................................1

一、任务来源..............................................................................................................................................................1

二、协作单位和主要起草人及其所做的工作..........................................................................................................1

三、主要工作过程......................................................................................................................................................2

（一）预阶段..............................................................................................................................................................2

（二）立项阶段..........................................................................................................................................................5

（三）起草阶段..........................................................................................................................................................6

第二章国家标准编制原则和确定国家标准主要内容的论据.................................................................................7

一、国家标准编制原则..............................................................................................................................................7

二、确定国家标准主要内容论据..............................................................................................................................7

（一）测试原理..........................................................................................................................................................7

（二）仿真分析..........................................................................................................................................................9

（三）测试装置........................................................................................................................................................11

第三章主要试验（或验证）的分析、预期的经济效果......................................................................................14

一、主要试验分析....................................................................................................................................................14

（一）测试装置调试................................................................................................................................................14

（二）对焦方法验证................................................................................................................................................14

（三）图像处理算法分析..............................................................