发酵工程电子版

发酵工艺原理（发酵工程）讲义合用生物工程、生物技术、制药工程及生物科学专业用王莘2023.8.20第一章绪论发酵工业应用：生物生物学一、发酵定义：从工业微生物角度的发酵：运用培养微生物来获得产物的有氧或厌氧的任何过程，现在有扩大到培养生物细胞（具有动物、植物和微生物）获得产物的所有过程。从发酵工业角度的发酵：借助微生物在有氧和无氧条件下的生命活动来制备微生物体自身，或共同直接代谢产物或次级代谢产物的过程统称为发酵。传统发酵：酱油、醋、酒、长毛豆腐。新兴发酵：有机酸、酶制剂、抗生素。发酵工业的划分：食品工业（酿造工业）和非食品工业（发酵工业）发酵工业：运用生物的生命活动生产的酶对无机或有机原料进行酶加工获得产品的工业。二、发酵工业具有的条件：①要有某种适宜的微生物。②要保证或控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成，温度，溶氧浓度，酸碱度等）。③要有进行微生物发酵的设备。④要有将菌体或代谢产物提取出来精制成产品的方法和设备。三、发酵工业的改革 1．天然发酵阶段特点：1）家庭作坊式生产；2）容易感染细菌；3）厌氧发酵；4）非纯种培养；5）凭经验传授技术；6）产品质量不稳定。2．纯培养技术的建立阶段纯培养阶段特点：（1）．多为好氧产品；（2）、均为表面培养；（3）、产品生产过程简朴；（4）、设备规定不高；（5）、生产规模不大。3．通气搅拌发酵技术的建立阶段第二次世界大战爆发，1929年英国人费莱明发现青霉素，迅速形成工业大规摸生产。1940年英国人费洛里精制分离青霉素医治战伤药物。发酵工业新篇章：发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗菌素发酵工业→氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）→基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物。发酵工程产业化发展：发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题。细胞大规模培养技术：细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、藻类细胞等4．代谢控制发酵技术5．开拓发酵原料时期6．基因工程阶段四、发酵工业的范围：现代发酵工业涉及领域按微生物发酵产品的性质分为以下几个方面。1．微生物菌体发酵2．微生物酶发酵：3．微生物代谢产物发酵4．微生物的生物转化发酵：生物转化与化学反映相比优点：反映条件温和，对环境无污染。5．微生物特殊机制的运用（1）运用微生物消除环境污染环境恶化（2）运用微生物发酵保持生态平衡（3）微生物湿法冶金：（4）运用基因工程菌株开拓发酵工程新领域五、发酵工业的特点1.发酵原料的选择2.微生物菌种得选育及扩大培养3.发酵设备选择以及工艺条件控制发酵工艺控制关键：发酵全过程的无菌状态的保持，防杂菌污染，设备冲洗，培养基灭菌，空气过滤。4.发酵产物的分离提取5.发酵废物的回收和运用发酵培养基第一节培养基的类型及功能培养基：是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。（人工配制的具有营养物质的供微生物生长的介质。）发酵培养基作用：满足菌体生长+促进产物形成。一、培养基的营养成分及来源1、能源2、碳源3、氮源4、有机盐5、特殊生长因子二、培养基的类型和用途1、按物质来源分：自然培养基（化学成分不清楚，异养微生物完全培养基）、合成培养基（化学成分和数量已知配制，实验室用生长慢）、半合成培养基（天然碳、氮、生长因子和化学药品，多数微生物使用）合成培养基：由已知组成成分的各种营养物质组合的培养基叫合成培养基。复合培养基（天然+半合成）：由一些组成成分不完全明确的天然有机物与一些无机盐组合的培养基。2、按物理性状态分：固体培养基、半固体培养基、体培养基固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8%,重要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。3、按生产工艺用途分：从发酵生产应用考虑）孢子培养基、种子培养基、发酵培养基，工业中常用种子和发酵培养基用生产。（1）孢子培养基：供制备孢子用的。孢子：某一生长阶段中，在营养细胞内形成一个圆形，卵圆形或圆柱形的休眠体叫孢子。（2）种子培养基：供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。（3）发酵培养基：是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。三、发酵培养基的选择：培养基供菌生长、繁殖、代谢、合成产物的营养物质。培养基成分和配比的适合与否影响菌的生长代谢，对产物的工艺质量和产量影响大。1、选择和培植发酵培养基相应考虑的基本原则：（1）、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。（2）、有助于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。（3）、有助于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。（4）、有助于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。（5）、尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。（6）、原料价格低廉，质量稳定，取材容易。（7）、所用原料尽也许减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的运用率，减少能耗。（8）、有助于产品的分离纯化，并尽也许减少产生“三废”的物质。2、工业化发酵培养基选择环节：（1）、了解菌种来源、生活习惯，理化特性和营养规定。（2）、了解生产菌种的培养条件、生物合成代谢途径、代谢产物化学性质、结构、工艺、产品质量规定。（3）、选化学合成培养基进行摇瓶实验→每小发酵罐培养，氮、碳产物代谢能力情况的摸索，选择适宜的pH值。（4）、拟定培养基配比→拟定金属（非）离子的影响→无机要素营养规定，按高低、适中进行拟定→做复合培养基实验→做发酵条件与培养基关系实验→用碳酸钙调pH值→中间补料法控制碳、氮、养料、前体类物质代谢→引导发酵向合成产物的途径发展。四、配制工业发酵培养基的一般规定：1、营养物组成较丰富，浓度适当，能满足菌丝体菌种发芽和生长繁殖成大量具有生理功能的需要（产物合成潜力提高）2、在一定条件下，各种原材料彼此不产生化学反映，理化性相对稳定。3、粘度适中，渗透压适当。4、原材料品种及浓度对代谢产物生物合成过程要有助于主产物的生物合成，高产率维持时间长，副产物合成率要降至最低。5、不影响发酵过程的通气和搅拌，便于产物的分离纯化。6、原材料尽量选质优价廉、成本低。第二节发酵培养基的成分及来源培养基原料：C（50%）、N、无机盐、微量元素、水、生长因子、前体。一、碳源：（微生物自身细胞物质、糖类、脂、蛋白质等和能源构成菌体的重要元素及各代谢产物的重要原料。）定义：凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称碳源。功能：提供能量的重要元素。碳源：糖（碳水化合物）、脂肪、有机酸、醇、碳氢化合物（烃类）1、碳水化合物（糖类）（1）单糖：葡萄糖（实验室培养基）所有的微生物都能运用葡萄糖；但是会引起葡萄糖效应；工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达成一定的质量指标；糖蜜：糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜重要具有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。糖蜜使用的注意点：除糖份外，具有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预解决。（2）双糖：乳糖、麦芽糖、蔗糖（3）多糖：糊精、淀粉及其水解液，工业化过程常用淀粉水解物酶法水解为发酵糖。（4）淀粉、糊精：使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺陷：难运用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应2、脂肪：霉菌和放线菌运用油脂作碳源，其具有消沫和补充碳源的双重作用。3、无机酸、醇：在单细胞蛋白、氨基酸、维生素、抗生素发酵中作碳源和补充碳源。4、碳氢化合物（烷烃）：微生物表面糖脂吸取系统乳化后运用碳。二、氮源（细菌、酵母菌氮含量大，霉菌含蛋量低，—NH2基存在不提供能量）：指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。1、重要功能：构成微生物细胞和含氮的代谢产物，补充碳源，是细胞合成蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸及抗生素等重要代谢物成分。2、有机氮源（有碳有氮）：具有蛋白质、肽类、游离氨基酸、糖类、脂肪、无机盐、生长因子。微生物对这类氮源的运用品有选择性。土霉素生产中玉米浆和氨基酸的运用率增长；选择有机氮时要注意品种、产地、加工方法对质量的影响。3、有机氮源：氨基酸、蛋白质水解物及尿素。4、无机氮源（无碳有氮）：铵盐、硝酸盐及氨气、氯化铵。5、实验室用培养基氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等蛋白水解物。6、工业化生产常用氮源：硫酸铵、尿素、氨水、黄豆粉、花生粉、鱼粉、棉籽粉、玉米浆、酒精水及屠宰场废水等。氮源使用的一些相关问题：有机氮源和无机氮源应当混合使用；初期：容易运用易同化的氮源—无机氮源；中期：菌体的代谢酶系已形成、则运用蛋白质；有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：蛋白酶的生产有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力；开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴的课题；三、无机盐和微量元素1、定义：是微生物代谢所需的重要物质。2、功能：构成菌体成分，作为酶的辅基或激活剂，调节微生物体内氧化还原电位、pH值及维持渗透压。无机元素对菌体生长的影响：浓度减少→促进生长；浓度提高→克制生长3、无机盐：磷酸、硫酸盐、氯化物、钠、钾、钙、镁、铁。4、微量元素：一般参与酶的组成或使酶活化。微量元素缺少，导致细胞生理活性下降，甚至停止生长。P：构成菌体核酸、核蛋白及磷脂成分，组成高能磷酸化合物及许多酶的活性基，参与氧化磷酸化反映必须元素。Fe：是细胞色素及其氧化酶的激活剂。Zn（脱氢酶）、Mg（糖化酶）、Co（B2辅酶）：是某些酶的辅酶或激活剂。Na：维持细胞渗透压。K：影响细胞膜透性。Ca：调节细胞透性作用。使用注意事项：1、对于其它渠道有也许带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml发酵罐必须进行表面解决使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟四、生长因子、消沫剂、前体和产物促进剂1、生长因子：微生物生长必需而少量的，自身不能合成或少量合成，以满足机体生长需要的有机化合物，如维生素。功能：构成辅酶的组成部分，促进生命活动进行。如维生素B族是各种酶的活性基的组成部分，没有维生素B，E就不能活动。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源具有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。2、消沫剂：工业化生产中消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌，保证生产的正常运转。常用的消沫剂：植物油、动物油、高分子化合物。3、前体：在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质称为前体。前体可自身合成（缬氨酸、半胱氨酸→青霉素合成时用）；外源性前体（苯乙酸→青霉素G）青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136作用：前体有助于提高产量和组份用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有助于提高前体的转化率4、产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。促进剂提高产量的机制尚不清楚。有些促进剂自身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；五、水：是培养基的重要组成成分，是构成菌体细胞的重要成分，是营养物质传导介质。功能：水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸取的。渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的，并且水直接参与代谢作用中的许多反映。对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，由于在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的重要考虑参数涉及pH值、溶解氧、可溶性固体、污染限度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻。对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。六、影响培养基质量的因素工业发酵过程中，生产水平波动大，菌体代谢异常等现象。1、原材料质量的影响2、水质的影响3、灭菌的影响4、其他影响因素第三节发酵培养基的设计和优化一、培养基成分选择的原则菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导100∶0.2～2.0、合适的C、N比、pH的规定二、培养基实验设计：培养基成分的含量最终都是通过实验获得的；合理的实验方法：多因子实验；多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等；在筛选培养基中使用的原材料种类和浓度配比时，经常采用的方法：单因子实验法、正交实验设计和均匀实验设计。1、单因子实验法：合用培养基组成和单一营养成分的选择（费时，准确性低）2、均匀实验法：实验点均匀分散特点，实验组数与因素的水平数相同，实验结果分析采用计算机对实验数据进行多元回归系统解决，求得一回归方程→定量预测最优的条件和结果，最佳培养基组成和浓度→由菌种的生长情况、C/N代谢规律、pH值变化、产物合成速率决定。3、正交实验设计:是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面实验中挑选出部分有代表性的点进行实验，这些有代表性的点具有了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交实验设计是分式析因设计的重要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。三、培养基设计的环节①根据前人的经验和培养基成分拟定期一些必须考虑；的问题，初步拟定也许的培养基成分；②通过单因子实验最终拟定出最为适宜的培养基成分；③当培养基成分拟定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。例1：类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化原培养基:初步拟定也许的培养基成分(以碳源为例)通过单因子实验拟定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好结果：碳源：乙酸钠0.2%；氮源：氯化铵0.2%；酵母膏0.03%；无机盐:复合无机盐0.05%例2：正交设计拟定优化的配方例3：发酵培养基改善后培养基的发酵结果；摇瓶水平到反映器水平的优化配方；摇瓶、反映器培养基研究的两个层次；摇瓶——培养基设计的第一步；反映器—最终的优化的基础配方第三章工业发酵的染菌及灭菌第一节发酵染菌的危害发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。特别是无菌限度规定高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。几乎所有的发酵工业，都有也许遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者也许导致倒罐，甚至停产。一，染菌对不同品种发酵的影响青霉素；疫苗；柠檬酸；谷氨酸；肌苷、肌苷酸；酶制剂二，不同种类的杂菌对发酵的影响青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大；链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大；四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大；柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌；肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大；谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体；高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大；三，不同染菌时间对发酵的影响种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌及发酵后期染菌。四，不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性；空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐；培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性；设备渗漏：这种途径导致染菌的危害性较大；五，染菌对产物提取和产品质量的影响对过滤的影响：发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度增长；导致的后果：过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度减少过滤收率；对提取的影响有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液具有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开。离子互换工艺：杂菌易粘附在离子互换树脂表面或被离子互换树脂吸附，大大减少离子互换树脂的互换量。对产品质量的影响对内在质量的影响：染菌的发酵液具有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经解决过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。六，染菌对三废解决的影响使过滤后的废菌体无法运用；发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增长三废治理费用和时间第二节发酵过程中染菌的检查判断一、染菌的检查与判断目前生产上常用的杂菌检查方法有：①显微镜检查：染色；镜检②平板划线检查：到平板→空培养→待测样品划线→培养观测。③酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基空培养→接入样品→培养观测1、显微镜检查（镜检）：革兰氏染色法2、平板划线培养或斜面培养检查法3、肉汤培养检查法判断发酵是否染菌应以无菌实验结果为根据无菌实验的目的：1，监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底；2，监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入；3，了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角；二，各种检查方法的比较显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观测面也小，因此不易检出初期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺陷是需经较长时间培养(一般要过夜)才干判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，并且结果也更为准确；三，杂菌检查中的问题检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为重要根据；平板划线和肉汤培养应做三个平行样；要定期取样；酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，拟定为无菌时方可弃去；取样时防止外界杂菌混入的措施；表4-1四，发酵异常现象判断是否染菌除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据以下参数的异常变化来判断是否染菌溶解氧、pH值、尾气中CO2含量1、发酵异常现象判断是否染菌：溶解氧、pH、二氧化碳含量及菌体酶活力。溶氧浓度（谷氨酸发酵时）谷氨酸发酵时止常利J异常的溶解氧曲线——正常发酵溶解氧曲线；‥‥‥异常发酵溶解氧曲线；－·－·一异常发酵光密度曲线发酵初期：菌体适应期→溶氧浓度不变→耗氧量↓染好氧杂菌→溶解氧↓接近于0发酵中期：菌体对数生长期→溶氧浓度↓→耗氧量↑染厌氧杂菌→溶解氧↑→耗氧量↓发酵后期：菌体衰老期→溶氧浓度↑→耗氧量↓2）二氧化碳的含量杂菌染菌→糖耗↑二氧化碳含量↑；噬菌体染菌→糖耗↓二氧化碳含量↓耗气性发酵排气中二氧化碳含量与糖代谢有关。第三节发酵染菌和染菌因素分析一、发酵染菌率发酵染菌率：定义：指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。总染菌率（一年内）=发酵染菌批数/总投料批数×100%发酵染菌率以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应涉及染菌重消后的反复染菌的罐批（次）在内。设备染菌率：记录发酵罐或其他设备的染菌率，有助于查找因设备缺陷而导致的染菌因素不同品种发酵的染菌率：记录不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的因素。不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期提成前期、中期和后期三个阶段，分别记录其染菌率。有助于查找染菌的因素。季节染菌率：记录不同季节的染菌率，可以采用相应的措施制服染菌。操作染菌率：记录操作工的染菌率，分析染菌因素，考核操作工灭菌操作技术水平。二、发酵染菌和染菌因素分析避免在发酵生产中污染杂菌应以防止为主。“防重于治”，事前防止胜于事后挽救。假如一旦发生染菌现象就要尽快找出因素及时纠正、堵塞漏洞才干减少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。但在发酵生产中，往往由于生产过程的环节很多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措施不尽相同，引起染菌的因素比较复杂，有时不能及时找出而耽误了生产。1、国外一抗生素发酵染菌因素的分析2、国内一制药厂发酵染菌因素的分析国外一抗生素发酵染菌因素的分析国内一制药厂发酵染菌因素的分析染菌因素百分率%染菌因素百分率%染菌因素百分率%染菌因素百分率%种子带菌9.64蛇管穿孔5.89外界带入杂菌（取样、补料带入）8.20操作违反规程1.60接种时罐压跌零0.19接种管穿孔0.39设备穿孔7.60种子带菌0.60培养基灭菌不透0.79阀门泄漏1.45空气系统带菌26.00因素不明35.00空气系统带菌19.96罐盖漏1.54停电罐压跌零1.60搅拌轴密封泄漏2.09其他设备漏10.13接种11.00泡沫冒顶0.48操作问题10.15蒸汽压力不够或蒸汽量局限性0.60夹套穿孔12.36因素不明24.91管理问题7.093，从染菌的规模幅度来分析染菌因素大批（多个）发酵罐染同一种菌：空气系统问题部分发酵罐(或罐组)染菌：前期也许是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则也许是中间补料系统或油管路系统发生问题所导致的个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象个别发酵罐偶尔染菌：因素比较复杂，由于各种染菌途径都也许引起。4，从染菌的时间来分析发酵前期：种子、无菌空气、培养基、设备灭菌不彻底、接种操作不妥、设备或管道有死角。发酵后期：中间补料、操作不合理问题、设备渗漏。5，从染菌的类型来分析浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌)：发酵罐的冷却管、夹套渗漏或水污染。耐热性芽孢杆菌：死角、培养基、设备灭菌不彻底。球菌、酵母、不耐热无芽孢杆菌：也许是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的、种子带菌、设备渗漏、操作问题。霉菌：无菌室及灭菌不彻底或操作不严格问题第四节发酵杂菌污染途径及防止一、种子带菌的因素及防止1、种子带菌因素问题培养基及用品灭菌不彻底，灭菌温度达不到规定。菌种在移接过程，操作和管理不妥。菌种在培养过程或保藏过程中外界空气和杂菌进入（试管有长度、紧度，应恒温，严检）④无菌室的无菌条件不符合规定。2，种子带菌的防止种子带杂菌是发酵前期染菌的因素之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。（1）无菌室无菌室的基本规定：无菌室面积不宜过大，一般约4—6米2高约2．6米。为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1—3个套间(缓冲过道)无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，规定无裂缝，墙角最佳做成形。室内布置应尽量简朴，最佳能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。化学灭菌药剂：用作喷洒或揩擦的(以揩擦为主)：75%酒精;0.25%新洁而灭(季胺盐)；0.6~1%漂白粉；0.5%石炭酸；0.5%过氧乙酸；1%煤酚皂(来苏尔)；0.5%高锰酸钾；300单位／毫升土霉素；50单位／毫升制霉菌素等。用作熏蒸：甲醛(每立方米空间约用10毫升)或硫磺(每立方米空间约用2-3克)。（2）培养基规定无原料性状（颗粒、结块等）及原料无发霉变质现象出现。（3）种子培养基灭菌灭菌操作时需要注意排气管是否畅通；固体培养基可采用两次灭菌的方法；通入蒸汽后使瓶内培养基温度达成121ºC所需的时间与瓶内培养基的体积有关。二、设备灭菌不彻底：1、实罐灭菌未充足排除罐内空气，导致“假压”，使罐顶空间局部温度达不到规定→开排气阀使蒸汽透过所有管线彻底灭菌。2、培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，达不到灭菌温度→自控装置。3、设备管道存在“死角”，引起蒸汽不能有效到达或不能充足到达预定到达的局部灭菌部位→形成不彻底灭菌部位“死角”。4、设备渗漏引起染菌及防止：砂眼（腐蚀）裂缝（振动）→选优质材料。5、操作问题：移料+罐压=0，外界空气进入+泡沫顶盖+压缩空气压力突降+发酵液倒流入空气过滤器→高度责任心+管理+高素质。三、发酵设备、管件的渗漏与配置设备和管件的渗漏一般是指设备和管件由于腐蚀、内应力或其他因素形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才干发现。1，设备渗漏的因素发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀；设备加工不良；弯管时，弯头处管壁变薄；焊接不良；2，盘管渗漏的防止放罐后要认真清洗发酵罐；控制冷却水质量，减少其中氯离子含量；对盘管定期检查、试漏，及时发现漏隙；3，空气分布管渗漏的防止空气带菌：空气净化设备、流程、过滤介质选用和装填、介质灭菌管理等。4，罐体渗漏的防止5，管件的渗漏与发酵罐相连接的管路很多，有空气、蒸汽、水、物料、排气、排污等管路，管路多，相应的管件和阀门也多。管道的连接方式、按装方法以及选用的阀门形式对防止污染有很大的关系。所以，与发酵有关的管路不能同一般化工厂的化工管路完全同样，而有其特殊的规定。四、发酵罐与管件的死角所谓死角是指灭菌时因某些因素使灭菌温度达不到或不易达成的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，会导致连续染菌，影响生产的正常进行。1，法兰连接的死角发酵工厂的有关管路要保持光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会。例如法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生凹凸不平现象就会导致死角(图7—8c)。垫片的内圆比法兰内径大或比较小以及安装时没有对准中心也会导致死角(图7—8a、b)。2，渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角3，不锈钢衬里的死角4，接种管路的死角采用种子罐时是运用压力差将种子罐中培养好的种子输入发酵罐内，种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。如下图所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以应在阀1的半截上装设旁通，焊上一个小的放气阀，此段管路即可得到蒸汽的充足灭菌。5，排气管的死角罐顶排气管弯头处如有堆积物，其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭，而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来导致污染。此外排气管的直径太大，灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能所有杀死。所以排气管要与罐的尺寸有一定比例，不宜过大或过小。6，不合理补料管配置导致的死角7，压力表安装不合理形成的死角五、染菌后的挽救措施种子培养或种子罐中发现污染。发酵初期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。中后期染菌，假如杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应当提早放罐。有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，假如提早放罐，这些物质会影响后解决提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。有时发酵罐偶而染菌，因素一时又找不出，一般可以采用以下措施：(1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4~!10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80°C，存放解决4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。(2)对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消解决。甲醛用量：0.12~0.17L/m3罐体积。(3)对染菌种子罐罐内放水灭菌，灭菌后水量占罐体的2/3以上。细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。六、制服染菌对发酵过程的规定1、对空气净化系统的规定。2、对蒸汽规定。3、对设备的规定。4、对工艺的规定。第五节灭菌培养基+设备+空气→灭菌→防止发酵过程染菌+保证生产。染菌：营养物质消耗+克制产生菌生长+改变培养液性质+产生破坏代谢产物的酶类。一、灭菌的方法灭菌：指用化学的或物理学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。工业常用的灭菌方法：化学物质灭菌；热灭菌；辐射灭菌；过滤介质除菌。（一）、消毒和灭菌的区别：消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。（杀死引起感染的微生物）或（用物理、化学方法除去表面的致病微生物）灭菌：用物理、化学方法杀死或除去环境中所有微生物。（杀死一切微生物）消毒→不一定灭菌（无菌态）；灭菌→无菌态（可消毒）（二）、常用的灭菌方法1、干热灭菌法干热灭菌法一般认为繁殖型细胞在100℃以上干热1小时即被杀死。耐热性细菌芽胞在120℃以下长是时间加热也不死亡，介140℃前后则杀菌效率急剧增长。所以，关于干热灭菌条件，有的药典规定为180℃1小时以上，有的药典规定为160－170℃2－4小时，此仅是大至的标准而已.2、湿热灭菌1）湿热灭菌定义：借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。2）优点：①来源容易，操作无毒。②穿透力强，灭菌彻底。③具有很大的潜热，蒸汽冷却的水有助于灭菌。④蒸汽输送可借助于自身的压力。⑤经济快捷。3）湿热灭菌的原理：在有水分存在的情况下，蛋白质更易受热而发生不可逆的凝固变性。3、辐射灭菌1）定义：运用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。2）紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用的波长范围：250—270nm杀菌率高。3）放射性同位素CO60，密封包装灭菌（产品成品包装的灭菌）4、化学物质灭菌1）定义：化学物质用于消毒和防腐。2）作用：药物易与细胞中的某些成分起化学反映，使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性而杀灭微生物。3）合用范围：药残难除，易于蛋白质产生化学反映，不适合培养基灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。4）化学药品：①高锰酸钾：氧化蛋白质、氨基酸，浓度为0.1~0.25%;②次氯酸钠（漂白粉）：强烈氧化作用;③75%酒精：细胞脱水作用，使乙醇分子进入蛋白质的肽键空间，引起蛋白质变性或沉淀。范围为皮肤和器具表面杀菌。④新洁尔灭和杜灭芬：阳离子表面活性剂与微生物菌体表面结合，引起菌外膜损伤和蛋白变性。对芽孢无灭菌作用。范围：器具和环境。使用浓度：0.25%（5%加水稀释20倍）。⑤甲醛：还原作用杀菌，与蛋白质氨基结合使其变性。37%甲醛溶液称为福尔马林。范围：无菌室和车间空间消毒。⑥戊二醛：应用广泛，使用范围为碱性条件下杀死孢子，浓度为2%。范围：器具和仪器。⑦过氧乙酸：强氧化剂，对营养细菌、真菌（孢子）、病毒起作用；杀菌浓度0.01%；无害浓度0.2%；-40℃仍可杀菌，有腐蚀性。⑧酚类：有毒性，水溶性差，污染环境。浓度为0.1—0.15%，15分钟灭大肠杆菌。⑨抗生素：抑菌灭菌剂，有选择性（细菌）。二培养基湿热灭菌（一）、影响培养基灭菌的因素1、培养基成分：油脂越高，糖类越高，蛋白质的浓度越高，都会使微生物的耐热性增高。2、pH值：pH值为6.0—8.0，微生物耐热性好；pH值<6.0↓灭菌时间↓3、培养基中的颗粒：颗粒越大，灭菌越难，反之，越易。颗粒小于1mm培养基无影响。4、泡沫：培养基形成泡沫对灭菌极为不利，由于泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热量很难穿透去杀灭空气中的微生物。解决办法加消泡剂。（二）、培养基灭菌方式1、分批灭菌（实罐灭菌）：将配制好的培养基输入发酵罐内，用直接蒸汽加热，达成灭菌规定的温度和压力后，维持一定期间，再冷却至发酵规定的温度，这一工艺称为分批灭菌或实罐灭菌。合用于小批量生产，固体颗粒培养基，产泡沫多时采用。通常必须灭菌条件：110-130℃，5-20分钟，培养液灭菌采用高温短时加热的方式。2、连续灭菌：培养基在发酵罐外通过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程称为连续灭菌。使用于大规模生产、小颗粒液体培养基，产少量泡沫。运用板式换热器进行连续灭菌的流程图，其流程的能量运用较合理。三空气除菌（一）、空气中的微生物：好氧性微生物的生长繁殖和形成代谢产物都需要消耗氧气。1、大气空气：尘埃+沙土+各种各样的微生物;2、空气中悬浮的微生物一般为：103～104个/立方米;3、空气除菌的目的为除去或杀灭空气中的微生物;4、空气中的微生物：细菌、细菌芽孢、酵母、霉菌、放线菌及噬菌体。空气在引进发酵罐之前必须进行严格解决，除去其中具有的微生物和其他有害成分;（二）、空气除菌方法：1、加热灭菌：可用蒸汽、电能、空气压缩机产生的热量进行灭菌。2、电除尘：具有灰尘和微生物的空气通过高压气流电场，正极电场强度>1000V/cm2 时，气体产生电离，产生的离子使灰尘和微生物等成为载电体，被捕集与电极上。3、介质过滤除菌：经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达成除菌目的。1）绝对过滤：介质的之间的空隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，空气的微生物被滤除。节约能量和时间，操作简便。微孔滤膜（孔径小于0.5nm）；纤维介质：纤维素膜微孔滤膜2）深层过滤：以纤维状（玻璃纤维）+颗粒状（活性炭）介质过滤层用超玻璃纤维，聚乙烯醇等为介质的过滤层3）影响介质过滤效率的重要因素：颗粒性质、介质性质（介质填充长度L、介质填充密度ρ和介质纤维直径φ）和气流速度.4）空气过滤器：A、纤维状或颗粒介质过滤器：特点：过滤层厚度L↑体积V↑压力降△P↑操作麻烦。介质：棉花（上下）、玻璃纤维、活性炭（中）B、过滤纸类过滤器：以微孔滤纸、滤板、滤棒构成的过滤器。特点：阻力、压力减少，强度下降;介质：超细玻璃纤维、聚乙烯醇制成旋风式或套管式;5）、空气过滤除菌的工艺流程空气净化工艺流程图1．空气吸气口；2粗过滤器；3．空气压缩机；4．一级空气冷却器；STh级空气冷却器；6．分水器；7空气贮罐；8．旋风分离器；9．丝网除沫器；10．空气加热器811．总空气过滤器；12分过滤器无菌空气制备控制要点：①提高空气入口洁净度（加粗过滤和增高吸气口高度）②防压缩空气中夹带的油水，影响无菌空气质量（压缩机出口空气要升温至120～150℃）第四章生产菌种的培养与保藏第一节种子制备的过程（菌种的扩大培养）种子制备一般涉及两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处在休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在通过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子扩培的目的：接种量的需要；菌种的驯化；缩短发酵时间、保证生产水平。一、工业对微生物的规定1、能在便宜原料制成的培养基上迅速生长并生成所需的代谢生产物，产量高。2、可以在易于控制的培养条件下，迅速生长和发酵，且所需酶活力高。3、生长速度和反映速度较快，发酵周期短。4、根据代谢控制的规定，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。5、选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体。6、菌种纯粹，其不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。7、菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（涉及抗生素、激素、毒素等），以保证安全。二、工业常用的微生物三、种子制备的过程大体可分为：实验室种子制备阶段;生产车间种子制备阶段实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。四、孢子制备孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。（一）放线菌孢子的制备1、放线菌的孢子培养常采用：琼脂斜面培养基2、培养基成分规定：C：1%；N：0.5%C↑→导致生理酸性环境↑→孢子形成↓;N↑→菌丝繁殖↑孢子形成↓干燥和限制营养是直接或间接诱导孢子形成的因素。3、放线菌斜面培养：T：28℃；5～14天。4、放线菌发酵生产工艺过程节约菌种用量，易控孢子质量菌种→母斜面（孢子）→子斜面（孢子）→摇瓶种子（菌丝）→种子罐→发酵罐防菌种变异5、成分：麸皮、豆汁、蛋白胨、无机盐（二）霉菌孢子的制备1、霉菌的孢子培养成分：大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品。2、霉菌培养条件：T：25～28℃，培养4～14天。（三）、细菌孢子的制备：1、细菌的斜面培养基：多采用碳源限量而氮源丰富的配方。C↑N↑→牛肉膏、蛋白胨2、培养条件：T多37℃；T少28℃；培养1～2天；产孢5～10天五、种子制备生产车间种子制备：实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌运用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，假如是需氧菌，同时还需供应足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。1、一级种子：孢子（或摇瓶菌丝）被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子。2、二级种子：把一级种子转入到体积较大种子罐内发酵，经培养后形成大量菌丝，这样的种子称为二级种子。3、二级发酵：把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。4、三级发酵：把二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。（50吨罐）5、种子罐的作用：重要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达成一定的菌体量，以利于产物的合成。6、种子罐级数：决定菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。种子罐级数取决于：①种子的性质（生长繁殖性能）；②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；③孢子发芽及菌丝繁殖速度；④发酵罐中种子的最低接种量；⑤种子罐与发酵罐的容积比；细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶→种子罐→发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子7、拟定种子罐级数需注意的问题：种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，减少发酵罐的生产率，增长染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。8、种子制备的目的：形成一定数量和质量的菌体。9、发酵目的：获得大量发酵产物。六、种子扩大培养1、菌种扩大培养的目的：就是要为每只发酵罐的投料，提供相称数量的代谢旺盛的种子。2、种子扩大培养的任务：不仅要得到纯而壮的培养菌，并且要获得活力旺盛，足够量的培养物。七、工业微生物的培养类型1、工业微生物的培养方法：静置培养、通气培养静置培养法：将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为嫌气性发酵。通气培养法：其生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌属多，它的生长的环境必须供应空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。2、种子扩大培养阶段1)液体培养法：试管+摇床;2)表面培养法：茄子瓶、克氏瓶、瓷盘;3)固体培养法：三角瓶、培养皿;A、固体培养：曲法培养：浅盘固体培养和深层固体培养（固体曲霉活性高）深层固体通风制曲：在曲房周边用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温度和湿度，灵活调节适应菌种不同的生理需要。B、液体深层培养：由罐底部通气搅拌培养，相称于由气、液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养为深层培养。特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养规定以及不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基中氢离子浓度等条件选择最佳培养条件。（好气性发酵采用此法）C、载体培养：以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类固态基质作为微生物生长的载体，营养成分可严格控制，发酵结束只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。载体规定：材料耐蒸汽加热、药物灭菌、多孔结构有足够表面积，可允许空气流通。D、两步法液体深层培养：应用于酶制剂，氨基酸生产氨基酸两步法：第一步：菌种+培养基→有机酸或氨基酸发酵第二步：在某种酶作用下，把第一步产物转化为所需的产物氨基酸（酶转化法）第二节种子质量的控制种子质量影响发酵水平。种子质量的优劣取决菌种自身的遗传特性和培养条件。一、影响孢子质量的因素及其控制（一）培养基

培养基是微生物获得生存的营养来源，对于微生物生长繁殖，酶的活性与产量都有接的影响。生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其重要因素是原材料质量波动。（二）培养温度及湿度1、温度

T↑→菌体代谢活动↑→培养时间↓温度对微生物影响，因菌体表面作用的热平衡关系，热传递至菌体内，对菌体内部所有的结构物质都有作用。生命活动进行的酶反映和生化反映都和温度有关。T=T最适

菌体生长↑

T>T最高生长→菌体死亡

T<T最低生长

→菌体生长克制大多数微生物最适生长温度

：25～37℃

2、湿度：空气相对湿度↑培养基水分蒸发↓→影响菌体生长

北方相对湿度40%～45%

，南方相对湿度35%～42%→孢子质量好↑

真菌对湿度规定↑放线菌对湿度规定↓（三）培养时间和冷藏时间1、孢子培养时间

孢子培养工艺：选择孢子成熟阶段时终止培养

孢子培养时间：应控制在孢子量多，孢子成熟，发酵产量正常的阶段终止培养。2、孢子的冷藏时间：孢子冷藏时间→影响孢子质量;冷藏时间：要短不应长（四）接种量对生长期接种→发酵周期↓→产量↑接种量↑→生产过程↓短→发酵周期↓短→设备运用率↑→

代谢产物↑多→动力消耗↓少接种量↓→生产过程↑长→发酵周期↑长→代谢废物↓少→设备运用率↓→动力消耗↑多二、影响种子质量的因素及其控制1、培养基营养成分适合种子培养的需要;2、种龄与接种量种龄：种子培养时间。种龄↑菌体量↑

种龄最适=对数生长期。细菌种龄：7～24h；霉菌种龄：16～50h

；放线菌种龄：21～64h接种量：移入的种子液体体积和接种后培养液体积的比例。接种量＝移入种子的体积/接种后培养液的体积通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%高产措施：大接种量+丰富培养基。霉菌的发酵接种量10%，抗生素发酵接种量7%～15%～25%3、温度：最适生长温度：25～37℃4、pH值

pH值：培养基的氢离子浓度，对微生物的生命活动有显著影响。各种微生物都有自己生长与合成的最适pH。培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。5、通风和搅拌通气：供大量氧。搅拌：新鲜氧气与培养液混合→氧溶解↑+有助于热互换+有助于营养物质和代谢物的分散。6、泡沫和消泡泡沫↑氧的吸取↓CO2排除↓生理代谢正常进行↓;7、染菌的控制8、种子罐级数的决定三、种子质量的控制措施种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此一方面必须保证生产菌种的稳定性，另一方面是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。菌种稳定性的检查无（杂菌）检查四、种子质量标准1，细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）;单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还规定有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。2，生化指标：种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。3，产物生成量：在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，由于种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟限度。4，酶活力：种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。五、种子异常分析:菌种生长速度，过快或过慢;菌丝结团;菌丝粘壁;实例1：：啤酒酵母的扩大培养一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。1.实验室扩大培养2，车间扩大培养第三节生产发酵罐的无菌接种生产规模发酵罐的接种，涉及两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐;从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中;从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种;从种子罐接种第四节菌种保藏与复壮一、菌种保藏（一）菌种保藏的原理菌种保藏目的：提高菌种存活率和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原有的优良生产性能。菌种保藏基本原理：根据菌种的生理、生化特性，人为地发明条件使菌种的代谢活动处在不活泼状态。（二）菌种保藏方法斜面低温保藏法：酵母菌;石蜡油封保藏法：酵母菌;砂土管保藏法：细菌，霉菌，防线菌;硅胶保藏法：细菌;冷冻干燥法：细菌，防线菌;液氮超低温冻结法：细菌，真菌;1、定期保藏法:2、液体石蜡法: 3、砂土管保藏法：4、冷冻干燥保藏法：5、液氮保藏法：二、菌种的衰退与复壮（一）菌种的衰退1，菌种衰退：菌种通过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。重要是菌种遗传特性的改变和生理状况的改变。2、菌种退化：群体中退化细胞在数量上占一定比例后，所表现出菌种生产性能的下降。3，菌种退化的因素：基因突变;变异菌株性状分离;诱变的单菌落是由—个以上孢子或细胞形成;菌落由—个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞;单核孢子发生突变时，双链DNA上仅—条链上某个位点发生变化;连续传代;其它因素;菌种保藏不妥;生长条件不满足（培养基组成、培养条件）;防止菌种退化的措施控制传代次数;选择合适的培养条件;选择合适的保藏方法;菌种稳定性检查;分离复壮;选择合适的培养基;避免有害因素;（二）、菌种的复壮1、菌种复壮：使衰退的菌种重新恢复本来的优良特性。2、复壮措施：对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化淘汰衰退的个体（1）纯种分离：（自然分离法）把衰退菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，通过扩大培养可以恢复菌种的原有性状。（2）淘汰衰退的个体：芽孢产生菌经高温（80℃）解决，则不产芽孢的个体被淘汰。（三）选择合适的培养条件：添加剂加入形成综合培养基1、一定培养条件进行单细胞分离纯化；2、用高剂量UV（紫外线）和低剂量NTG（亚硝苯甲醛脲）联合对退化菌株进行解决通过复壮寄主体和淘汰已衰退个体等方法。第五章

通气与搅拌第一节

工业发酵过程中氧的需求一、微生物对氧的需求氧是生物体生存的重要元素。即是细胞的组成成分和各种产物的构成元素，又是生物能量代谢的必需元素。

微生物吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方式表达。概念1：呼吸强度是单位重量干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以QO2表达，单位为mmolO2/（g干菌体h）概念2：耗氧速率是单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以γ表达，单位为mmolO2/L·h呼吸强度可以表达微生物的绝对耗氧量（相对需氧量），微生物在发酵过程中的耗氧速率取决于微生物的呼吸强度和单位体积液体的菌体浓度。γ=QO2·Xγ：微生物耗氧速率，mmolO2/L·h；QO2：菌体呼吸强度，mmolO2/g·h;X：发酵液中菌体浓度，g/L;（一）供氧与微生物呼吸及代谢产物的关系发酵的不同阶段对龄菌生长旺盛，呼吸强度大，但种子培养阶段由于菌体浓度低，总的耗氧量也较低；晚龄菌的呼吸强度弱，但在发酵阶段由菌体浓度高，耗氧量大，培养基丰富的，耗氧量也大。（二）微生物的临界氧浓度微生物的耗氧速率受发酵液中氧的浓度的影响，各种微生物对发酵液中溶氧浓度有一个最低规定，这一溶氧浓度叫“临界氧浓度”，以C临界表达。好氧微生物的临界氧浓度一般为0.003～0.05mmol/L,需氧量一般为25～100mmol/(L·h)。种子培养阶段→菌体浓度↓→耗氧量↓→培养基营养消耗↓发酵阶段→菌体浓度↑→耗氧量↑→培养基营养消耗↑C长临：微生物生长阶段的呼吸临界氧浓度;C合临：微生物产物合成阶段的临界氧浓度;幼龄菌：生长旺盛↑→呼吸强度↑;晚龄菌：生长旺盛→至呼吸强度↓;呼吸强度与溶氧的关系（三）溶解氧控制的意义1、氧的溶解度↓，采用高浓度发酵，丰富培养基，提高通气、搅拌的氧溶解度，改善供氧条件。2、呼吸强度供应↓，引起菌种不可逆损失或导致细胞代谢转向所不需要化合物的产生，菌体新陈代谢与氧气、呼吸有关，通风、搅拌调节，影响发酵周期长短和代谢产物生成的高低。3、了解菌生长和代谢产物形成阶段最适需氧量，合理供氧。4、了解发酵过程中，菌和高产发酵产物的临界氧浓度，找出菌生长和发酵产物形成最高需氧量，合理供氧。5、有效、经济维持发酵液溶氧浓度→增长通气搅拌→控制氧溶解二、氧在液体中的溶解特性在好氧发酵中，对微生物供氧的传递过程是空气中的氧（氧溶液体的传递速度）→液体中的溶氧（氧由液体至微生物的传递速度）→微生物体内的氧（氧的运用速度）至产物。若外界条件如温度、压力等不再变化时，气体在液体中的浓度就不再随时间而变化，此时的浓度即为该条件下的气体在溶液中的饱和浓度。溶解氧的饱和浓度C*单位mmolO2/L.ppm.大气压表达影响氧饱和浓度的重要因素：（一）温度（二）溶液的性质（三）氧分压三、影响微生物需氧量的因素（一）微生物种类和生长阶段（二）培养的组成（三）培养液中溶解氧浓度的影响（四）培养条件（五）CO2的影响，（菌体代谢的产物CO2浓度与菌呼吸有关）第二节氧在溶液中的传递一、氧的传递途径与传质阻力在需氧发酵的供氧过程中，一方面是气相中的氧溶解于发酵液中，然后传递到细胞内的呼吸酶位置上被运用。这些传递过程又可分供氧和耗氧两个方面。供氧是空气中的氧气从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩散到液体主流中。耗氧是氧分子自液体主流通过液膜，菌丝丛、细胞膜扩散到细胞内。氧在传递过程中必须克服一系列阻力，才干被微生物运用。这些阻力重要归纳起来有如下几种：氧传递的各种阻力的示意图1、供氧方面的阻力（1）氧膜阻力（1/K1）：为气体主流及气—液界面间的气膜阻力，与空气情况有关。（2）气液界面阻力（1/K2）：与空气情况有关，只有具有高能量的氧分子才干透到液相中去，而其余的则返回气相。（3）液膜阻力（1/K3）：为从气—液界面至液体主流间的液膜阻力，与发酵液的成分和浓度有关。（4）液流阻力（1/K4）：液流阻力也与发酵液的成分和浓度有关，通常这不作为一项重要阻力。因在液体主流中氧的浓度是假定不变的，这只有在适当搅拌情况下才是这样。2、耗氧方面的阻力（1）细胞周边液膜阻力（1/K5）：与发酵液成分和浓度有关。（2）菌丝丛或团内的扩散阻力（1/K6）：与微生物种类、生理特性状态有关。单细胞的细菌和酵母，不存在这种阻力，对于菌丝这种阻力最为突出（与耗氧能力有关）。（3）细胞膜的阻力（1/K7）：与微生物的生理特性有关。（4）细胞内反映阻力（1/K8）：是指氧分子与细胞内呼吸酶系反映的阻力，与微生物种类、生理特性有关。a、液膜阻力→影响氧溶于水;b、菌丝丛阻力→影响菌体Y耗氧率能力显著;c、细胞内反映阻力（1/K8）可由三种因素产生:（1）培养基成分与酶作用失活；（2）生理条件如温度、pH值不适于酶的反映;（3）代谢产物的积累不能从反映中及时移去;二、气体溶解过程的双膜理论双膜理论的气液接触气体溶于液体是一个复杂的过程，至今尚未在理论上完全清楚，现在应用的假说是一个双膜理论。这个假说的过程是：氧先由气相扩散到气液两相的接触界面，再进入液相，界面一侧为气膜，另一侧为液膜。氧由气相扩散到液相必须穿过这两层膜。氧从空气扩散到气液界面这一段的推动力是空气中氧的分压与界面处氧分压之差，即P-Pi，氧穿过界面溶于液体，继续扩散到液体中的推动力是界面处氧的浓度与液体中氧浓度之差，即Ci-CL。与两个推动力相相应的阻力是气膜阻力1/KG和液膜阻力1/KL。单位接触界面氧的传递速率为：推动力P-PiCi-CLNA=————=————=————=KG（P-Pi）=KL(Ci-CL)(6—1)阻力1/KG1/KLNA:单位接触界面的氧传递速率，KmolO2/m3·h；P、Pi：气相中和气、液界面处氧分压，MPa；CL、Ci：液相中和气、液界面处氧的浓度，KmolO2/m3；KG：气膜传质系数，Kmol/m2·h·Mpa；KL：液膜传质系数，Kmol/m2·h·Kmol/m3或m/h通常情况下，不也许测定界面处的氧分压和氧浓度，所以式（6-1）不能直接用于实际。为了计算方便，并不单独使用KG或KL，而改用总传质系数和总推动力，在稳定状态时：NA=KG（P-P*）=KL（C*-CL）（6-2）KG：以氧分压差为总推动力的总传质系数，Kmol/m2h·Mpa；KL：以氧浓度差为总推动力的总传质系数，m/h；P*：与液相中氧浓度C相平衡时氧的分压，MPa；C*：与气相中氧分压P达平衡氧的溶解度，Kmol/m3。三、氧传质方程式传质系数KL并不涉及传质界面积。传质设备均不也许存在间壁，须用两相直接接触的内界面来代替间壁面积进行计算。所谓内界面事实上是难于测定的，最佳考虑一种传质系数能涉及内界面，方便于实际应用，内界面以a表达，单位为m2/m3,即单位体积的内界面。在气、液传质过程中，通常将KLa作为一项解决，叫做体积溶氧系数或体积传质系数。溶氧速率方程为：N=KLa（C*-CL）=KGa（P-P*）=KLa（P-P*）/H（6-6）N：单位体积液体氧的传递速率，Kmol/m3·h；KLa：以浓度差为推动力的体积溶氧系数，h-1；KGa：以分压差为推动力的体积溶氧系数，Kmol/m3·h·MPa；CL：溶液中氧的实际浓度，Kmol/m3；C*：与气相中氧分压P平衡时溶液中氧浓度，Kmol/m3；P：气相中氧的分压，MPa；P*：与液相中氧浓度C平衡时的氧分压，MPa；H：亨利常数，m3·MPa/Kmol；KLa、KGa称为体积溶氧系数。当供氧等于耗氧时，（即N>r）N=KLa（C*-CL）=QO2X（6-7）移项后得：QO2XQO2XKLa=—————或CL=C*－（6-8）C*-CLKLaKLa：通气效率，用来衡量发酵罐通气状况，KLa↑表达通气条件富裕；否则表达贫乏。QO2:微生物的呼吸强度，即单位菌体细胞（干重）单位时间内的需，[[mmol/g(干重)·h];X:菌体细胞的浓度，（g/L）.第三节发酵液的流变学固相：菌丝体（菌丝团）+微生物代谢产物+不溶性的营养物质；液相：可溶性营养物（盐类+代谢产物）；气相：无菌空气+CO2+低分子易挥发物质+调pH值的氨气；液流类型;粘度：表达液体流动限度的重要物理参数.流体动力粘度：剪应力T与剪切速度v之位比称~。牛顿流体：剪应力变，速度变，黏度不变.非牛顿型型流体：操作条件改变，黏度不等于常数.牛顿型液体：水+低分子量化合物溶液+均相溶液+细菌、酵母液.用水解糖液、糖蜜等原料做培养液的细菌、酵母醪；用淀粉、豆饼粉配料的低浓度细菌醪或酵母醪接近于牛顿型流体。非牛顿型液体：高分子溶液+胶体+霉菌、放线菌发酵液+含淀粉的培养基.霉菌、放线菌醪、固形物发酵液→粘度↑。常见的某些发酵液具有明显的非牛顿流体特性对发酵过程的影响极大。第四节影响供氧的重要因素一、搅拌搅拌：把气泡打坏，强化流体的湍流限度，使空气与发酵液充足混合，气、液、固三相更好地接触，一方面增长溶氧速率，另一方面使微生物悬浮混合一致，促进代谢产物的传质速率。搅拌作用：形成小气泡，增大比表面积;液体涡流运动，增长气液接触时间;料液湍流运动，促进传质;使菌体分散，避免结团;1、机械性搅拌可增长溶氧系数（KLa、KGa）（1）、搅拌→空气大气泡→变小气泡→增长接触面→接触时间↑;（2）、搅拌→涡流运动→气泡螺旋上升→气泡运动路线↑长→气液接触时间↑;（3）、搅拌→湍流运动→气泡液膜厚度↓→液膜阻力↓→KLa值↑;（4）、菌体分散→结团↓→接触面↑→氧传递↑;2、搅拌器的型式：直径、转速、组数、间距罐内相对位置都对氧传递率有影响。（1）、搅拌器按液流分为：轴向式+径向式径向式轴向式通用式发酵罐搅拌液体流型l一挡板；2一搅拌叶；3一发酵罐发酵罐搅拌器一般采用径向涡轮式搅拌器特点：直径小，转速快，搅拌效率高，功率消耗较低。搅拌器间距<2d→非牛顿型发酵液;搅拌器间距=（3-4）d→牛顿型发酵液（2）、挡板：挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增长溶解氧。通常，挡板宽度取(0.1~0.2)D，装设6~4块即可满足全挡板条件（3）、转速n和叶径d：当功率不变时，即n3d5=常数，低转速，大叶径；高转速，小叶径能达成同样的功率，然而n、d对溶氧有不同情况的影响。（菌丝粘度大，易结团）→非牛顿发酵液→大叶径，低转速，多组搅拌器（菌丝粘度小，易分散）→牛顿型发酵液→小叶径，高转速，多组搅拌器（4）、搅拌组数对溶氧的影响（H/D）：粘度↑组数↑二、空气线速度空气线速度较小时，KLa随线速度的增长而增长；空气线速度增长至一定限度后，如不改变搅拌速度，则会减少搅拌功率，使KLa减少，甚至发生“过载”现象。三、空气分布管：改变气泡的大小，从而改变气泡的比表面积。四、氧分压五、发酵罐内液柱高度V↑→通风效率↓；H/D=3，效果好，通风效率↑→H/D↑;H/D=1～2时，KLa可增长40%2～3时，KLa可增长20%六、发酵的体积七、发酵液的物理性质第六章发酵工艺的控制第一节发酵过程的重要控制参数一物理参数温度指发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。温度→酶反映速度+氧溶解度+氧传递速率+菌体生长速率+产物合成速率有关2．压力

发酵过程中发酵罐维持的压力;P罐压=+（常压）。防外界空气的杂菌侵入+保纯种培养;P罐压变化→影响氧溶解度＋CO2+菌体代谢;P罐压＝0.2×105～0.5×105;3．搅拌转速(r/min)指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每分钟的转速来表达发酵罐的容积(L)31030502005001000050000搅拌转速范围(r/min)200~2023200~1200150~1000100~80050~40050~30025~20025~1604．搅拌功率（KW）指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所消耗的功率（KW/min）。它的大小与液相体积氧传递稀疏Ka有关。5．空气流量（V/(V·min)指每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，也是需氧发酵的控制参数。它的大小与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制：0.5～1.0V/V*min)范围内6．粘度（Pa·S）粘度：可以作为细胞生长或是细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。通常用表观粘度表达之，它的大小可改变氧传递的阻力，又可表达相对菌体浓度。7．浊度（％）浊度：能及时反映单细胞生长状况的参数。8、料液流量（L/min）：控制液体进料的参数。二、化学参数1．pH（酸碱度）发酵液的pH值是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反映的综合结果。pH的高低与菌体生长和产物合成有关2.基质浓度（g/mg%）基质浓度指发酵液中糖，氮，磷与重要营养物质的浓度。发酵液中的变化：影响产生菌的生长＋产物的合成＋代谢产物产量3．溶解氧浓度（PPm或饱和度，％）溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。浓氧浓度一般用绝对含量（ppm）来表达，氧在培养液中饱和度的百分数（％）表达。4．氧化还原电位（MV）

培养基的氧化还原电位是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。5．产物的浓度（mg/ml）是发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数决定发酵周期长短的根据6．废气中的氧浓度（Pa）废气中氧含量与产生菌的耗氧率和Ka有关。从废气中的氧和CO2可算出产生菌的耗氧率。呼吸菌和发酵罐的供养能力。7．废气中的CO2就是产生菌呼吸放出的CO2。测定CO2浓度计算可算出产生菌的呼吸熵，了解产生菌的呼吸代谢规律。三．生物参数1．菌丝形态菌丝形态改变是生化代谢变化的反映。种子质量、代谢变化及发酵周期决定菌丝形态。2.菌体浓度

菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一。菌体浓度大小（变化速度） 影响菌体生化反映＋表观粘度+溶氧浓度→ 决定补料量＋供氧量第二节发酵过程中的代谢变化发酵过程按进行过程有三种方式：分批发酵(Batchfermentation)、补料分批发酵(Fed-batchfermentation)、连续发酵(Continuousfermentation)一、分批发酵（第一类型）：1、分批发酵的定义：是指在一封闭系统内具有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。2、分批发酵的特点：微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。3、分批发酵的优缺陷优点：操作简朴；操作引起染菌的概率低；不会产生菌种老化和变异等问题缺陷：非生产时间较长、设备运用率低。4、分批发酵的生长曲线单细胞微生物丝状真菌和放线菌5、典型的分批发酵工艺流程：二、补料分批发酵（第二类型）：1、补料分批发酵：又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。2、补料分批发酵的优缺陷优点：使发酵系统中维持很低的基质浓度；和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题。缺陷：存在一定的非生产时间；和分批发酵比，半途要流加新鲜培养基，增长了染菌的危险。3、补料分批发酵的类型：补料方式：补料成分：控制方式：连续流加单一组分流加反馈控制不连续流加多组分流加无反馈控制多周期流加三、连续发酵（第三类型）：1、培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出具有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。2、连续发酵的优缺陷优点：能维持低基质浓度；可以提高设备运用率和单位时间的产量；便于自动控制。缺陷：菌种发生变异的也许性较大；规定严格的无菌条件；3、连续发酵的类型恒化培养：使培养基中限制性基质的浓度保持恒定恒浊培养：使培养基中菌体的浓度保持恒定4、连续发酵的代谢曲线从分批培养出发，无论在哪个时候开始加入新鲜培养基过渡到连续操作，达成一定的菌体浓度及限制基质浓度则培养系统一定能成为稳定状态。四、初级代谢的代谢变化初级代谢：是生物细胞在生命活动过程中所进行的代谢活动，其产物即为初级代谢产物。发酵中的菌体、基质和产物三者变化的基本过程是：菌体进入→ 发酵罐后→菌生长（繁殖）→达成一定菌浓度。基质：发酵时间（上升）→