GBT 33584.6-2017 海水冷却水质要求及分析检测方法 第6部分：异养菌的测定（正式版）

海水冷却水质要求及分析检测方法第6部分：异养菌的测定2017-05-12发布2017-12-01实施IGB/T33584《海水冷却水质要求及分析检测方法》分为6个部分：——第5部分：溶解固形物的测定；——第6部分：异养菌的测定。本部分为GB/T33584的第6部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家海洋局提出。本部分由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本部分起草单位：国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所、浙江国华浙能发电有限公司。Ⅱ在以海水为水源的海水冷却水系统中易于滋生微生物污垢沉积等危害，因此，在系统运行过程中常需测定微生物量，用以评估系统生物污染程度，以及所采用的生物防治技术的有效性和经济性，其中最常测定的是黏液形成菌总数。但在黏液形成菌的测定过程中，需采用成套的黏泥采集装置，样品为生物黏泥样，样品状态为含水固体，须经研磨后定量稀释测定，导致这种采样方式在实践中受到限制，且研磨、稀释黏泥样品后再进行测定，也增加了测定步骤和污染机率，使得黏液形成菌的检测很难日常化。本部分测定的异养菌是一类生活于海水冷却水中的浮游细菌，其存在和数量可以直接反映海水冷却系统的生物污染程度。本部分舍弃黏泥采集装置，直接采集水样测定异养菌数，简化了采样和制样步骤，使得异养菌的测定得以日常化，提高了海水冷却水的运行管理水平。1海水冷却水质要求及分析检测方法第6部分：异养菌的测定GB/T33584的本部分规定了海水冷却水质要求和采用平皿计数法测定海水冷却水中异养菌的方法原理、试剂与材料、仪器与设备、分析测定、菌落计数、菌落总数的计算和报告方式。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。异养菌heterotrophicbacteria利用有机物分子作为能源的微生物。菌落形成单位colony-formingunit;CFU采用平皿计数法测定的菌落数量。蔓延菌落spreadingcolony在琼脂培养基表面呈弥漫生长的菌落。4水质要求海水冷却水主要水质指标应符合表1的规定。表1海水冷却水主要水质要求允许值钙离子(Ca²+)mg/L镁离子(Mg²+)mg/L锌离子(Zn²+)mg/L氯化物(Cl-)mg/L2表1(续)允许值mg/L溶解固形物异氧菌注1:Ca²+、Mg²+、Cl-、SO、异氧菌的允许值引自GB/T23248—2009的6.1.2和6.1.3。注2:Zn²+的允许值引自GB8978—1996中表4第二类污染物最高允许排放浓度一级标准。注3:溶解固形物的允许值依据实际海水冷却工程最大浓缩倍数N=2.5倍确定。待测水样经适当稀释后，倾注接种到的营养琼脂中，于有氧条件下，在29℃±1℃下培养72h水样中的单个异养菌将在营养琼脂上形成肉眼可见的单菌落。统计每个平皿的菌落数，根据其对应的稀释倍数和接种量，即可换算出待测水样中的异养菌数。6试剂与材料除非另有说明，在分析中化学试剂仅使用分析纯试剂和GB/T6682规定的三级水。6.1氯化钠。6.4氯化钙。6.6碳酸氢钠。6.7牛肉膏。6.9磷酸氢二钾。6.10琼脂。6.12盐酸溶液：1+11。6.13硫代硫酸钠：将硫代硫酸钠置于称量纸上，转入无菌箱(室)或超净工作台(7.1)内，并均匀地摊放在离紫外线灯的垂直距离30cm处灭菌30min备用。6.14陈海水：取天然海水避光保存3个月以上，使用时取其清液或经0.45μm滤膜过滤的滤液。CO₃加入到1L水中，混匀后备用。(6.14)或人工海水(6.15)和500mL蒸馏水配制的混合水中，加热溶解(如用含杂质较多的琼脂配制时，应趁热用四层医用脱脂纱布过滤),用热水补充至1000mL后，用氢氧化钠溶液(6.11)或盐酸溶液(6.12)调节pH值至7.2±0.2,并分装于三角瓶(7.9)中，于121℃±1℃下蒸汽压力灭菌20min,冷却后备用。3于121℃±1℃下蒸汽压力灭菌20min,冷却后备用。6.19牛皮纸。6.20医用脱脂纱布。7仪器与设备7.1无菌箱(室)或超净工作台。7.2蒸汽压力灭菌器。7.3恒温培养箱。7.4电热干燥箱7.5电热恒温水浴锅。7.6天平：称量范围0g～220g,感量0.01g。7.11试管：直径18mm,长度180mm,配硅胶塞。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。7.12培养皿：直径90mm。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却7.13刻度吸管或移液器和枪头：1000μL、1mL～10mL。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌7.14采样瓶：广口玻璃瓶或聚丙烯塑料瓶，1000mL。洗净后经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却7.16放大镜(3×)或菌落计数器。8分析测定8.1样品的采集8.1.1采用采样瓶(7.14)在海水冷却水的给水总管或回水总管处采集约500mL样品，在取样过程中，应避免瓶口和颈部受杂菌污染。采样前用酒精灯灼烧管口，并放水5min后再采集。中加入灭菌的硫代硫酸钠(6.13),硫代硫酸钠的加入量为每升水样约加入0.1g。若确定水样不含余8.1.3水样采集后，应立即进行测定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱(7.7)中冷藏保存，存放时间不宜超过24h。经冷藏保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，在培养箱(7.3)中29℃±1℃下活化4h～5h,再进行测定。8.2水样的稀释与接种8.2.1将水样摇匀，采取无菌操作方法，按10倍稀释法对水样进行系列稀释，直至需要的48.2.2采取无菌操作方法，将不同稀释度的水样分别接种到无菌培养皿(7.12)中，每个稀释度重复接种3皿～5皿，每皿接种1mL,每接种一个稀释度更换一支无菌吸管或枪头(7.13)。然后倾注入15mL~20mL已融化并冷却至45℃±1℃的灭菌培养基(6.16),并立即轻轻旋摇培养皿，使水样与培养基充分混匀。测定一个水样从接种到灌入培养基不得超过20min。8.2.3另取一组无菌培养皿(7.12),采取无菌操作方法，接种1mL无菌稀释水(6.17)并倾注灭菌培养基(6.16)作为空白对照。8.3培养待培养皿中的培养基固化后，倒置平皿，在培养箱(7.3)中于29℃±1℃培养72h。9菌落计数9.1培养结束后，取出培养皿，用肉眼观察(若菌落太小，采用放大镜或菌落计数器观察),记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以CFU表示。9.2计数时，根据平皿上的菌落形态，按下述情况处理：a)当无蔓延菌落生长时，对每个平皿上的菌落计数。每个稀释度的菌落数采用一组平皿的平均数；b)同一稀释度下，当部分平皿出现较大片状菌落生长时，应选择无片状菌落生长的平皿计算该稀释度的菌落数；c)同一稀释度下，当所有平皿均出现不同程度的片状菌落，应选取片状菌落不到平皿面积的一半，而其余一半多的平皿中菌落分布又很均匀的平皿进行计数，即对分布均匀的半个平皿计数，计数结果乘以2,代表一个平皿菌落数；d)同一稀释度下，当所有平皿均出现超过平皿面积一半的片状菌落时，该稀释度的平皿不应计数；e)当平皿上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。10菌落总数的计算和报告方式10.1若空白对照培养皿出现菌落，表明测定过程中有污染，本次测定无效。10.2选择平均菌落数在30CFU～300CFU之间的稀释度，进行计算。若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表2例1)。10.3若有两个稀释度，其生长菌落数均在30CFU～300CFU之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2,应报告两者平均数(见表2例2);若大于2则报告其中稀释度较小的菌落数(见表2例3);若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数(见表2例4)。10.4若所有稀释度的平均菌落数均大于300CFU,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表2例5)。10.5若所有稀释度的平均菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表2例6)。10.6若所有稀释度均无菌落生长，则以“小于1乘以最低稀释倍数”报告(见表2例7)。10.7若所有稀释度的平均菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分大于300CFU而另一部分小于30CFU时，则选择最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表2例8)。10.8若所有平皿均密布菌落，则不宜用“多不可计”报告，而宜在稀释度最高的各平皿上，任意计数51cm²中的菌落数，求出每平方厘米内的平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm²,再乘以其稀释倍数报告。10.9若所有平皿上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。10.10菌落总数修约原则如下：b)菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字(见表2报告方式栏)。表2