实验二 红曲发酵

红曲发酵及红曲色素的提取生命科学学院生物工艺学实验：实验二实验目的1、了解红曲菌液体菌种的制备方法,为红曲发酵实验准备液体种子。2、了解固体发酵的工艺过程,在实验室中小规模制备红曲。3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。实验原理1、红曲红曲又称红曲米，其发明至今己有一千多年的历史，它是以稻米蒸熟后接种红曲菌(Monascus)发酵制成的，可直接作为天然色素来使用，安全性高。置入红曲霉菌优质的成熟稻米PremiumGrownRice第一次杀菌1stSterilization植入菌种Inoculation固态发酵SolidStateFermentation二次杀菌过程2ndSterilization干燥Drying研磨Grinding红曲制造过程实验原理2、红曲的主要成分及作用1）红曲色素：黄色素、橙色素和紫红色素2）活性酶3）洛伐他汀等4）抑菌物质：桔霉素(Citrinin)等

实验原理3）红曲霉菌红曲菌是腐生真菌，生长的最适pH为3.5-5，能耐pH3.5，尤嗜乳酸。生长温度为26-42℃，最适温度为32-35℃；能耐10%乙醇。能合成生物素、泛酸、尼克酸硫胺素、核黄素等。还能产生色素、乙醇、琥珀酸及少量乳酸、醋酸等。红曲菌的液化型α-淀粉酶的活性弱，而糖化型β-淀粉酶的活性较强，故可用来生产红色麦芽糖。红曲菌的蛋白酶的活性较高。实验材料及培养条件1、菌种：红曲霉菌2、培养基（液体）蔗糖3%，(NH4)2SO40.3%，K2HPO40.1%,KCL0.05%,MgSO40.05%，FeSO40.001%，酵母浸粉0.5%，PH自然3、固体发酵培养基大米培养基：加水浸泡20h，（100℃,灭菌5min）实验过程1、察氏液体种子培养配制制液体培养基。500mL三角瓶中装液体培养基150mL,包扎后0.1MPa灭菌20分钟；液体培养基灭菌冷却后,每瓶中接入1/4支红曲斜面菌苔(注意无菌操作)；接种后置30℃恒温摇床中180rpm摇瓶培养3天。2、固体培养基制备及接种1）浸米:25℃以上浸米5—8h,大米吸收水分约在28%～30%。2）蒸米:将浸好的米用清水淋去米浆水,沥干,即可蒸米。上汽火力要强,待全部圆气以后，蒸煮3～5min,出饭率在135%,饭粒呈玉色,粒粒疏松,不结团块。蒸米不能熟透。

3、摊凉接种

4、固态发酵32～33℃保温保湿培养。每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”,使曲粒吸收一定水分,以利菌丝逐渐向内生长。5、红曲色素提取：1）取200g固体发酵之红曲,在植物粉碎机中将其粉碎；2）将红曲粉放于500mL三角瓶中,加入提取液(丙酮:水=80:20)300mL；3）室温下浸提1天,每隔2小时摇动一次,过滤；4）沉淀用同样提取液洗涤2次,每次100ml,合并滤液；5）在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮(尚有水分)；6）用lmol/LHCl

调残留液(约l00mL)的pH至3.0,加至分液漏斗中；7）用150mL醋酸乙酯分次抽提；红曲色价测定（每天测一次，绘制色价曲线）1）称取红曲米样品0.5g,放入带有刻度的lO

mL

具塞试管中；2）加入80%的乙醇8mL,摇匀,

60℃水浴保温萃取0.5h；3）取出冷却,用普通定性滤纸过滤入lO

mL

量筒中,用80%乙醇洗涤残渣2次,合并滤液,并用80%乙醇定容至10mL；4）以80%乙醇作对照,在505nm波长下,用lcm比色皿测定样品的吸光度。5）计算:红曲色价(以lg样品计)=A505×lO×2注意：