微生物成品 (终极版)

黄原胶生产应用研究进展

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黄原胶发酵生产工艺简介发酵生产方法改良黄原胶应用阜丰集团是国内最大的黄原胶生产企业一三二一、黄原胶发酵生产工艺简介

1、黄原胶(xanthangum)黄原胶又称黄胶、汉生胶，黄单胞多糖，是一种由黄单胞菌属发酵产生的胞外多糖。一般由甘蓝黑腐病黄单胞菌以碳水化合物为主要原料，经好氧发酵生物工程技术，切断1,6-糖苷键，打开支链后，再按1,4-键合成直链组成的一种胞外杂多糖。是一种类白色或浅米黄色的粉末，无味、无毒、食用安全，易溶于水黄原胶基本结构黄原胶是一种水溶性生物多糖，基本结构是由重复的“五糖结构单元”组成,相对分子质量(Mr)为2xl06~2xl07，单体包括2个D-葡萄糖、2个D-甘露糖和1个D-葡糖醛酸，具有类似纤维素的一级结构，包括由β-1,4键连接的D-葡萄糖基主链与D-甘露糖和D-葡糖醛酸交替连接的三糖侧链组成，在C6位置带有

乙酰基的D-甘露糖以α-1,3键与主链连接在侧链末端的D-甘露

糖残基上以缩醛形式带有丙酮酸。黄原胶的二级结构是其侧链通过氢键反向缠绕主链形成双螺旋或多螺旋结构,正是由于这些多螺旋体形成的网络结构，使黄原胶具有良好的控制水流动的性质。黄原胶在氯化钠水溶液中主要以多分子缔合状态存在,少量以单分子状态存在,缔合状态的分子呈分段的双股螺旋构象黄原胶高级结构三级结构是二级结构通过非共价键组成的立体网状结构黄原胶独特的理化性质由其二级结构决定，黄原胶具有很强的耐酸、碱、盐、热等特性，具有突出的高粘性和水溶性、独特的流变特性、优良的温度稳定性和pH稳定性、极好的兼容性等独特的理化性质黄原胶的性质2.黄原胶生产1952年由美国农业部伊利诺伊斯州皮奥里尔北部研究所分离得到的甘蓝黑腐病黄单胞菌（Xanthomonascampestris），并使甘蓝提取物转化为水溶性胞外杂多糖而得到黄原胶甘蓝黑腐病单胞菌(Xanthomonascampestris)菌体短杆状，G-，单生，鞭毛，可移动，好氧，无芽孢，宽0.4μm-0.7μm，菌落一般呈黄色，光滑粘稠，产生非水溶性黄单胞菌色素。33生产工艺流程图解黄原胶的生产受到培养基组成、培养条件(温度，pH值，溶氧等)、反应器类型、操作方式(连续式或间歇式)等多方面因素的影响。培养基组成培养基选用天然培养基，以葡萄糖、蔗糖或淀粉等为碳源，以蛋白质、鱼粉、豆粉或硝酸盐为氮源，加KH2PO4、MgSO4、CaCO3等无机盐和Fe2+、Mn2+、Zn2+等微量元素，以及生成促进剂谷氨酸、柠檬酸等。3.1发酵参数接种接种体积一般为反应器中料液体积的5％-10％，接种的次数应随发酵液体积增大而增多菌种培养斜面活化→摇瓶种子→发酵种子培养：将保藏4℃的斜面种子在斜面上活化传代2次，然后将菌苔接入到含50mL种子液的250mL摇瓶中，28℃、180r/min摇床培养24h摇瓶发酵：把5％(v/v)的种子液接入装有100mL培养基的500mL的三角瓶中，温度控制在28℃、转速为180r/min，发酵周期为72h控制条件菌株可在25℃-30℃下生长，最适的发酵温度为28℃，如需提高黄原胶产量，应选择温度在31℃-33℃，而要增加丙酮酸含量就应选择温度范围在27℃-31℃。pH范围在中性时最适于黄原胶的生产，随着产品的产出，酸性基团增多，pH值降至5左右。研究表明控制反应中的pH值对菌体生长有利，但对黄原胶的生产没有显著影响反应器的类型及通氧速率、搅拌速率等都有相应的经验数据，须根据具体条件而定。可参考如下数据：搅拌速率在200-300r/min，空气流速为1L/L·min。操作方式多采用间歇式，但也有采取连续式操作方式3.2分离提纯预处理(调pH值、加热、稀释等)固液分离(过滤、超滤、离心分离等)初步纯化(超滤、沉淀、离心分离等)高度纯化(溶解、超滤、沉淀、离心分离等)制成成品(干燥、粉碎等)预处理（灭菌、分离）预处理时可先用水稀释，再加硅藻土过滤除去菌体；或调pH值6.3-6.9、加热至80℃-130℃、时间10min-20min杀死菌体，再用中性蛋白酶分解菌体，除去菌体后可以降低黄原胶产品的总氮含量。(GB13886-2007:总氮≤1.5%)初步纯化（沉淀）通常将发酵液浓缩至黄原胶浓度为6％左右，再用乙醇沉淀法提取，此法将比直接用乙醇沉淀提取黄原胶节约3～4倍乙醇。当然，发酵液经硅藻土过滤后也可直接用乙醇沉淀法提取，或用盐酸沉淀法提取工业级产品高度纯化（产品分离）精制可采用溶解、超滤、沉淀和分离等方法；黄原胶精制尚没有找到一种经济实用的方法制成成品（脱水干燥）黄原胶粘度大，干燥操作困难，常用的方法有真空干燥法、喷雾干燥法、盘式连续干燥法、滚筒干燥法、沸腾干燥法等。真空干燥法简便易行，可用于生产各种等级的黄原级产品；喷雾干燥法不预处理发酵液、不除菌体，直接进行喷雾干燥，所得产品杂质含量多、颜色深，粘度较小，产品通常为工业级；滚筒干燥法、沸腾干燥法等用于生产食品级黄原胶二、发酵生产方法改良（1）产胶量取发酵液适当稀释后，12000r/min离心10min除去菌体及剩余淀粉，上清液用2倍体积乙醇沉淀黄原胶多糖，50℃真空干燥后称重，并换算成单位重量发酵液中的含胶量。（2）发酵液黏度黄原胶发酵结束后,用Brookfield黏度计03号转子60r/min下测定发酵液黏度值。布氏粘度计粘度测定原理是通过浸入被测液中的转子的持续旋转形成的扭矩来测量粘度值，扭矩与浸入样品中的转子被粘性拖拉形成的阻力成比例，因而与粘度也成比例。1、发酵效果评价指标（3）丙酮酸丙酮酸含量测定釆用2,4-二硝基苯肼比色法

在375nm处测吸光度，与已知丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸含量(GB13886-2007)棕红色菌种在发酵中起着重要作用，它是决定发酵产品是否具有产业化价值和商业化价值的关键因素。而自然界分离的菌种往往生产能力很低，不符合发酵工业要求，因此需要通过育种和条件培养打破微生物的正常代谢，使微生物按照人们要求的代谢方向积累代谢产物。

常规的菌种选育包括自然诱变、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种等技术。2、菌种改良紫外线诱变育种技术路线：活化菌种→紫外线诱变→初筛→复筛→亚硝基胍诱变→初筛→复筛→目的菌株出发菌株：实验室保存的野油菜黄单胞菌紫外诱变条件：

15W的紫外灯管，处于对数生长期的细胞

紫外线诱变育种原理：紫外线照射能使DNA链中两个相邻的嘧啶核苷酸形成二聚体造成局部DNA分子无法配对,而影响DNA的正常复制,造成基因突变。紫外诱变对微生物致死率的影响紫外诱变菌株的初筛紫外诱变菌株的稳定性实验UV-32的亚硝基胍诱变亚硝基胍(NTG):黄色结晶状物质，性质不稳定，见光易分解，不溶于水,因此用作诱变剂时需要加入助溶剂溶解诱变机理：亚硝基胍属烷化剂，而烷化剂是突变中一类相当有效的化学诱变剂，这类诱变剂具有1个或多个活性烷基，它们易取代DNA分子中活泼的氢原子，使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变溶液的酸碱影响NTG的诱变效果，当pH6.0时，NTG的烷基化作用最强，因此需配置磷酸缓冲液来调节pH值。出发菌株：UV-32亚硝基胍对微生物致死率的影响亚硝基胍诱变菌株的初筛亚硝基胍诱变菌株稳定性实验通过上述紫外线诱变和化学诱变过程，得到菌株UN-26，在相同条件下，其黄原胶产量比原菌株高39.9%。3.1发酵后期补糖黄原胶的发酵属于菌体生长与产物生成半偶联型。在前期主要是菌体生长期，后期主要为产胶期。较低的C/N利于菌体的生长，而高的C/N较利于黄原胶的合成。前期菌体基本上达到最大值，黄原胶的合成主要在中后期，所以考虑补糖的时间应选在中前期。3、发酵条件改良3.2氧气

甘蓝黑腐病黄单胞杆菌是好氧菌，溶氧量在黄原胶发酵中有着非常重要的作用。

溶氧浓度会影响到黄单胞杆菌的生长速率、黄原胶的生成率以及质量。

随着发酵过程中黄原胶含量的增加，发酵液浓度增大，氧含量显著降低，影响黄原胶的持续合成针对氧含量问题，可采取以下措施：3.2.1转基因技术

可在表达载体中插入细菌血红蛋白基因,构建了新的基因工程菌,提高菌株结合氧的能力,进一步提高黄原胶的产量。

转入的细菌血红蛋白能够结合环境中的氧气，在细胞内创造更高水平的氧浓度，这样可以促进细胞的生长，显著地增加细胞对氧的吸收，并且增加产量。3.2.2氧载体（携氧剂）

▲通过在发酵液中引入一种新的液相(与发酵液互不相溶)，以减少气液传氧阻力，从而提高氧气的传质速率，这种液相一般具有比水更高的溶氧能力。例如：加入大豆油使黄原胶产率有明显提高，与未加大豆油的对照组相比，黄原胶产率由1.64%增加到2.41%（加入6%大豆油）。随着大豆油加入量的增加，产率反而下降，这可能是因为虽然氧载体能提高溶氧能力，但由于培养基失水较多，影响产率另外，表观粘度的不断增加会影响氧传质系数由于黄原胶的粘连性极好，在发酵中后期，发酵液粘度非常高。物料的混合及氧的分散能力大大下降，导致供氧不足，发酵无法进行。要获得优质的黄原胶产品，必须先除去发酵终产物中的菌体。通常要将发酵液稀释几倍，然后离心除去菌体，这样必然导致沉淀分离黄原胶时的乙醇含量增加。▲可以采用无菌体的发酵液——酶液发酵合成黄原胶。一级培养是为了获得较大生物量的胞外酶而不生成黄原胶。由于黄原胶会影响胞外酶的分泌及菌体的分离，因而采用少量的碳源及较低的碳氮比。第二步由于是采用一级培养产生的胞外酶作用底物合成黄原胶，因此可采用无氮培养基进行发酵。3.3发酵方式改良2酶液发酵VS普通法可以看出，发酵前期普通法粘度增加较快，而后两者几乎同时到达最高点，粘度相差不大酶液发酵：一级培养25小时，5000r/min分离除菌后进行发酵3.4.1醇种类对醇沉淀黄原胶的影响

传统使用单一有机溶剂作为沉淀剂，尝试采用不同比例的乙醇和异丙醇的混合溶剂来提取。3.4提取方法改良提胶率随着醇用量的增加而提高，当醇量为发酵液体积3倍时提胶率最高,当醇量继续增加，提胶率降低。3.4.2醇用量对醇沉淀提取黄原胶的影响3.4.3无机盐对醇沉淀提取黄原胶的影响

将各添加剂按等摩尔电荷加入已经预处理好的发酵液中,加入混醇(乙醇:异丙醇=3:l),离心30min(4000r/min)。添加5种无机盐，结果如图3.4.4发酵液稀释倍数对醇沉淀提取黄原胶的影响

发酵72h后，发酵液十分粘稠，

如果直接进行预处理，硅藻土不

能将菌体、色素及其他杂质完全

吸附，而且还可能吸附部分胶体，导致损失。所以在预处理时，就

要进行一定的稀释，降低胶液的

粘度三、黄原胶的应用

发展历程：1988年8月卫生部颁布了食品级黄原胶的卫生标准，并将黄原胶列入食品添加剂名单，1992年制定了食品添加剂黄原胶的国家标准(GB13886-92)，2007年又出台了新的国标(