微生物之肠杆菌

肠杆菌种属鉴定靶点的选择江苏嘉语生物医药技术股份有限公司陈颖曦内容简介肠杆菌简介肠杆菌检测常用靶点特异性靶点的选择及序列比对文献比对种属缩写与比对菌株数肠杆菌属简介肠杆菌属拉丁学名(Enterobacter

HormaecheandEdwards,1960)直杆状，宽0.6～1.0μm×1.2～3.0μm，符合肠杆菌科的一般定义。革兰氏阴性，周生鞭毛(通常4～6根)运动。兼性厌氧，容易在普通培养基上生长。发酵葡萄糖，产酸产气(通常CO2∶H2=2∶1)。在44.5℃时不能由葡萄糖产气。大多数菌株VP试验阳性，MR试验阴性。一般可利用柠檬酸盐和丙二酸盐作为惟一的碳源和能源。不从硫代硫酸盐产生H2S。多数菌株可将明胶缓慢液化，不产生脱氧核糖核酸酶。最适生长温度为30℃，多数临床菌株在37℃生长，有些环境菌株37℃时生化反应不稳定。广泛分布于自然界，普遍存在于人和动物中。DNA的G+Cmol％为52～60(Bd)。种间和相近属的鉴别见表3-11。模式种：阴沟肠杆菌(Enterobacter

cloacea)，临床致病种为阪崎肠杆菌，阴沟肠杆菌和产气肠杆菌。

肠杆菌分类肠杆菌科埃希氏属爱德华氏菌属柠檬酸杆菌属沙门氏菌属志贺氏菌属克雷伯氏菌属肠杆菌属哈夫尼菌属沙雷氏菌属变形杆菌属耶尔森氏菌属欧文氏菌属克罗诺杆菌属肠杆菌属阴沟肠杆菌*（Enterobacter

cloacea）产气肠杆菌（Enterobacter

aerogenes）阪崎肠杆菌（Enterobacter

sakazakii）(Cronobacter

sakazakii)其他种其他6个种肠杆菌科肠杆菌属克罗诺杆菌属其他属

cloacaeaerogenesamnigenusagglomeransasburiaecancerohenouscowaniidissolvensgergoviaehormaecheiintermediuskobeiludwigiinimipressuralispyrinus

sakazakiimalonaticusturicensismuytjensiidublinensisuniversaliscondimentigenomspecies阪崎肠杆菌（ES）简介阪崎肠杆菌（又称阪崎氏肠杆菌）是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50％以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。阴沟肠杆菌（EC）简介阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出，它是肠道正常菌种之一，但可作为条件致病菌随着头孢菌素的广泛使用阴沟肠杆菌已成为医院感染越来越重要的病原菌，其引起的疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤软组织感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及败血症等，由于阴沟肠杆菌能产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)和AmpC，耐药情况严重，给临床治疗带来了新的挑战。产气肠杆菌（EA）简介产气肠杆菌

（Enterobacter

aerogenes），属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），肠产气杆菌属（Enterobacter）。革兰氏阴性菌，兼性厌氧生物。曾在1963年和一些现属于Enterobacter的菌类被归类为Paracolobactrum

aerogenoides。在希腊字中，aer代表“空气”，genninio代表“产生”，所以其种名aerogenes代表着“产气”的意，产气肠杆菌呈棒状，菌体大小约为长1.2-3.0μm、宽0.6-1.0μm，为革兰氏阴性的兼性厌氧杆菌。不产孢子且具有小的荚膜。其有周鞭毛，可以活动。主要生存于人类和动物的肠道，为人体内的正常菌相，只有在人体虚弱的特殊情况下才偶尔引起疾病。亦生存于水、土壤及腐败物中。肠杆菌种属鉴定常用靶点基因名生理功能扩增片段大小（bp）靶微生物特异性敏感性16S[1-7,28]核糖体RNA100-950ES100%2.3cfu/assay100fg/assay[4]ITS[8-12]核糖体RNA间区500-600ES\EC[22]假阳性[9]102to103cfu/mL[8]ompA[9,11,13-15,29]外膜蛋白A100-500ES假阳性[9]103CFU/mL[15]gluA[9,16,17,18]葡萄糖苷酶600-1000ES100%102cfu/mL[17]dnaG（MMS）[7,18,19]DNA引发酶（大分子合成系统操纵子）<100ES100%6.3×103cfu/mL[7]palE[20]α-葡萄糖苷酶114ES100%400cfu/mL[20]atpD[21]ATP合成酶亚基180EC100%unknow基因名生理功能扩增片段大小（bp）靶微生物特异性敏感性rpoB[23,24]RNAPolymerasesubunitbeta

200-700区分C.ssp各种（ES）100%unknowgyrB[25]DNA促旋酶亚基B151区分C.ssp各种（ES）100%unknowZpx[26,27]锌金属蛋白酶350ES100%180fg/PCR[27]阪崎肠杆菌检测靶点分析16S是用于细菌种属鉴定和快速检测最重要靶点之一，其高度的保守性保证该靶点作为检测目标的稳定性和可靠性，但因其过度的保守以至于其种间鉴别能力有限。从以上表格中的各靶点看来，16S是文献中使用的最多的靶点（[1-7,28]），我认为介于16S本身的特点和文献使用的频率，用其作为肠杆菌属和克罗诺杆菌属鉴定的靶标再合适不过；另外从文献[30]看来，有人用16S作为靶点对阪崎肠杆菌进行检测得到了很好的效果（>90%特异性），同时也有特异性较差的靶点引物，如以ITS为靶点的SI-F/SI-R（8%特异性），SG-F/SG-R（特异性>60%)，由此得知，同一靶点的不同引物可以得到迥异的检测效果。从文献[30]中也可以看出：1、16S作为阪崎肠杆菌种的鉴定已有较高的特异性（未达100%），可以推测，作为属的鉴定更是没有问题。2、单一的靶点检测没有可靠性，多位点检测才能确定结果。我建议，用16S作为克罗诺杆菌属、肠杆菌属和其他属细菌的鉴别标志，其他靶点对于阪崎肠杆菌种的鉴定能力相当，未见很差的鉴定效果，所以我推荐用rpoB和gyrB作为阪崎肠杆菌鉴别的靶点。阴沟肠杆菌可以参照文献[22]中利用tDNA和ITS结合的方法进行鉴别。比对种属缩写与比对菌株数种属名缩写16SITS种名缩写16SITSE.cloacaeECL5502E.gergoviaeEG5—E.aerogenes

EAE1432E.hormaecheiEH95—E.amnigenusEAM45—E.intermediusEI3—E.agglomeransEAG64—E.kobei

EK2—E.asburiaeEAS185—E.ludwigii

EL76—E.cancerohenousECA52—E.nimipressuralis

EN3—E.cowaniiECO28—E.pyrinus

EP4—E.dissolvensED6—种属名缩写16SITSgyrBrpoB

C.sakazakii

CS69273018C.malonaticusCMA20—21C.turicensisCT28—32C.muytjensiiCMU27—31C.dublinensisCD27—53C.universalisCU--—1—C.condimentiCC1—11C.genomspeciesCG———1肠杆菌属16S序列比对550株阴沟肠杆菌16S序列比对阴沟肠杆菌16S进化树克罗诺杆菌属16S比对692株阪崎肠杆菌16S序列比对50株阪崎肠杆菌16S和同属其他种的16S比对结果克罗诺杆菌属16S进化树阪崎肠杆菌16S进化树（gene,P1-P20）50株阪崎肠杆和同属其他种16S进化树文献中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)16S引物PrimernameSequence（5→3）TargetingmicrobeLocationProductsize(bp)sF1[1]sR3TAACAGGGAGCAGCTTGCTGCTCTGCGGGTAACGTCAATTGCTGCGGTCS75-104488-510426sF1[1]sR5TAACAGGGAGCAGCTTGCTGCTCTGAAGGCACTCCCGCATCTCTGCACS75-1041050-1072960sF1[1]sR6TAACAGGGAGCAGCTTGCTGCTCTGAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGACS75-1041182-12061031sF4[1]sR5CAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAAAGGCACTCCCGCATCTCTGCACS495-5181050-1072560F[2][3]RCAAGTCGAACGGTAACAGGGGTCCCCCACTTTGGTCCGCS62-84201-21814916S1-F[4]16S1-RACACTGGAACTGAGACACGGCGTATTACCGCGGCTGCTGCS327-346538-556229Saka-1[5]Saka-2bACAGGGAGCAGCTTGCTGCCS79-991046-1064952PrimernameSequence（5→3）TargetingmicrobeLocationProductsize(bp)Esak2[6][8]Esak3CCCGCATCTCTGCAGGATTCTCCTAATACCGCATAACGTCTACGCS不匹配920Esakf[7][8]EsakrGCTYTGCTGACGAGTVGGCGGATCTCTGCAGGATTCTCTGGCS不匹配929克罗诺杆菌属和肠杆菌属ITS比对7株阪崎肠杆菌ITS序列比对结果阪崎肠杆菌7株、产气肠杆菌2株、阴沟肠杆菌2株ITS序列比对结果克罗诺杆菌属和肠杆菌属ITS进化树克罗诺杆菌属和肠杆菌属ITS进化树阪崎肠杆菌ITS进化树文献中克罗诺杆菌属和肠杆菌属ITS引物PrimernameSequence（5→3）TargetingmicrobeLocationProductsize(bp)SG-F[1]SG-RGGGTTGTCTGCGAAAGCGAAGTCTTCGTGCTGCGAGTTTGCS357-376640-665282Pf[2]PrCCGGAACAAGCTGAAAATTGAGTCTTCGTGCTGCGAGTTTGCS560-580640-665unknowSGF[2]SGRGGGTTGTCTGCGAAAGCGAATCTTCGTGCTGCGAGTTTGCS357-376640-664unknowF[3]RCAAGGCATCCACCGTGAAGTCGTAACAAGGEC不匹配245-259unknowCS为阪崎肠杆菌，EC为阴沟肠杆菌克罗诺杆菌属各种gyrB比对NCBI上选择30株阪崎肠杆菌的gyrB序列和15株同属的种的gyrB序列进行比对30株阪崎肠杆菌gyrB序列比对克罗诺杆菌属各种gyrB进化树克罗诺属各种gyrB比对进化树阪崎肠杆菌gyrB进化树文献中克罗诺菌属gyrB的引物PrimernameSequence（5→3）TargetingmicrobeLocationProductsize(bp)SpeCronsaka-F1[1]SpeCronsaka-R1AGGTAAAATCCACCAGCAAACCAGAATATCGTATTCAAACTCCS411-431541-561150SpeCrondubl-F2[1]SpeCrondubl-R1CGCCTATCCACCCGAACATTCGCATCAGACGGGTTTTCCAC.

dublinensis701-720不匹配unknowgyrB1-F[2]gyrB1-RATCATCATCATGACCGATGCGCTTGCCTTTCTTCACTTTCS1477-1496不匹配unknow以上引物Location是参照克罗诺属各种gyrB序列比对结果（非单纯阪崎肠杆菌gyrB比对结果）.克罗诺杆菌属rpoB比对克罗诺菌属中选取阪崎肠杆菌18株的rpoB与本属其他种共8株的rpoB序列进行比对。18株阪崎肠杆菌rpoB序列比对克罗诺杆菌属rpoB进化树属的进化树阪崎肠杆菌（种）的进化树文献中克罗诺菌属各种rpoB的引物PrimernameSequence（5→3）TargetingmicrobeLocationProductsize(bp)Csakf[1]csakrACGCCAAGCCTATCTCCGCGACGGTTGGCGTCATCGTGCS1523-15422059-2076553Cmalf[1]CmalrCGTCGTATCTCTGCTCTCAGGTTGGTGTTCGCCTGAC.malonaticus1624-16411893-1910286Cturf[1]CturrCGGTAAAAGAGTTCTTCGGCGTACCGCCACGTTTCGCCC.turicensis1544-15632193-2210666Cdublf[1]CdublrGCACAAGCGTCGTATCTCCTTGGCGTCATCGTGTTCCC.dublinensis1617-12352055-2072455Cmuyf[1]CmuyrTGTCCGTGTATGCGCAGACCTGTTCGCACCCATCAATGCGC.muytjensii1766-17852076-2095329Cgenomf[1]CgenomrACAAACGTCGTATCTCTGCGAGCACGTTCCATACCGGTCC.genomospecies1619-16382145-2163544以上引物均为种特异性引物，Location是以克罗诺菌属rpoB比对文件为参照定位的，并且用鼠标选中对应种的序列后，才能查到该引物的位置。CS为阪崎肠杆菌。参考文献[1]AngelikaLehner,Taurai

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sakazakii

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sakazakii

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Cawthorn,SharonBotha,R.Corli

Witthuhn.EvaluationofdifferentmethodsforthedetectionandidentificationofEnterobacter

sakazakiiis