GB/T 42364-2023 传染性无乳症诊断技术（正式版）

ICSCCSB41传染性无乳症诊断技术国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T42364—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。ⅡGB/T42364—2023传染性无乳症(contagiousagalactia,CA)是绵羊和山羊的一种传染性疾病，是世界动物卫生组织capricolum,Mcc)和腐败支原体(Mycoplasma本文件的制定参考了WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2022),并结合了我国相关技术研究新成果。1GB/T42364—2023传染性无乳症诊断技术本文件适用于绵羊和山羊传染性无乳症的诊断。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CA:传染性无乳症(contagiousagalactia)EDTA·Na₂:乙二胺四乙酸二钠盐(ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt)MTA:改良Thiaucourt's琼脂(modifiedThiaucourt'sagar)Ma:无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)Mcc:山羊支原体山羊亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum)Mmc:丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.capri)Mpf:腐败支原体(Mycoplasmaputrefaciens)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)PPLO:类胸膜肺炎微生物(pleuropneumonialikeorganisms)2GB/T42364—2023主要表现为乳房炎型、关节炎型和角膜结膜炎型3种类型，常见混合性临床表现。有时伴有肺炎和5.2.2乳房炎型病程2周～8周或更长，多见于腕关节及跗关节，其他关节较少。初期跛行，关节无明显变化。病情加重可见关节肿胀及周围皮下水肿。后期患病关节逐渐僵硬，不能站立。羔羊可发生肺炎和败血至晶状体脱出。乳腺断面呈多室性腔状，腔内充满凝乳样物质，呈绿色或白色。乳房实质内有豌豆大小的结节分符合5.1中流行特点之一、5.2中临床症状之一以及5.3中剖检病变之一的发病羊，可判定为疑似传染性无乳症。3实验室检测或置一70℃以下冻存。无菌采集羊颈静脉血，室温先倾斜30℃下静置2h～4h,待凝血析出血清后，3500r/min~7病原分离与鉴定4GB/T42364—20237.3.1样品稀释：取接种材料0.5mL加至4.5mLMTB培养基中，标记为10-管，连续做10倍系列稀释至10-³管。7.3.2接种：从上述3个梯度稀释样品中各取0.5mL分别接种至4.5mLMTB中，取0.2mL分别接种MTA平皿；MTB培养物置37℃培养，MTA培养物置含5%CO₂培养箱37℃培养。7.4.1接种物连续观察7d,每日检查支原体生长情况：7.4.2若7d后MTA和MTB培养基均未见疑似支原体生长：——从MTB培养物分别取0.5mL接种至新的4.5mLMTB中进行盲传；按照7.4.1进行观察处取滤过液0.5mL按照7.3.1接种观察。7.4.4若MTA培养基上出现煎蛋样菌落，则切取单个菌落(含琼脂块),倒置在一个新的MTA培养基的琼脂表面，轻轻移动琼脂块进行克隆纯化；连续2次克隆纯化后，对单个菌落培养物按照第8章进行鉴定。7.5结果判定获得克隆纯化的支原体并经普通PCR方法检测为4种支原体任一阳性，判为病原分离鉴定阳性。8普通PCR方法8.1.1.2PCR扩增仪。8.1.2.1灭菌生理盐水(0.85%氯化钠溶液)。8.1.2.2市售动物组织基因组DNA提取试剂盒。8.1.2.32×PCR反应预混合液(含Taq酶)。8.1.2.4DNAMarker。8.1.2.5上样缓冲液。5GB/T42364—20238.1.2.71%琼脂糖电泳凝胶，按照B.2的方法配制。8.1.2.8PCR引物(浓度均配制成20μmol/L),引物信息详见表1。病原引物名称引物序列(5′→3)靶基因退火温度/℃延伸时间/s产物大小/bpMaMAGAUVRC1-LCTCAAAAATACATCAACAAGOuvrCMAGAUVRC1-R5CTTCAACTGATGCATCATAAMmcMMMLC2-LCAATCCAGATCATAAAAAACCTMMMLC2-RCTCCTCATATTCCCCTAGAAMecMCCPL1-LAGACCCAAATAAGCCATCCAMCCPL1-RCTTTCACCGCTTGTTGAATGMpfMputlAAATTGTTGAAAAATTAGCGCGACMput2CATATCATCAACTAGATTAATAGTAGCAC心20min后，弃上清液，收集沉淀用于提取基因提取基因组DNA。提取的基因组DNA,应立即进行PCR反应或一20℃保存。扩增时均应设立阳性、阴性对照。阳性对照分别以携带4种支原体靶基因质粒作为模板，制备方法按照附录C;阴性对照以无核酸酶水作为模板。95℃预变性5min;94℃变性30s,按表1中4种支原体对应的温度退火30s,72℃延伸1min或30s,35个循环；72℃终延伸5min,4℃保存。将5μL的6×上样缓冲液加入PCR产物中(包括被检样品，阴、阳性对照样品),混匀后各取5μL6GB/T42364—20238.3结果判定8.3.1试验成立条件阳性对照有对应的特异性扩增条带(Ma:1624bp,Mmc:1049阴性对照无任何扩增条带。电泳图例见附录D中图D.1。bp,Mcc:1356bp,Mpf:316bp),且8.3.2结果判定方法符合8.3.1的条件，被检样品有任一特异性扩增条带，判定为检出传染性无乳症病原核酸。样品无对应扩增条带，判定为未检出传染性无乳症病原核酸。9荧光PCR方法9.1材料准备9.1.1仪器与器材9.1.1.1超净工作台。9.1.1.2实时荧光定量PCR仪。9.1.1.3荧光PCR反应管。套滤芯吸头。9.1.2.1市售无核酸酶水。9.1.2.2市售动物组织基因组DNA提取试剂盒。9.1.2.3荧光PCR预混液。9.1.2.4荧光PCR正向引物、反向引物及探针，详细信息见表2。表2荧光PCR检测传染性无乳症病原的引物及探针引物名称引物序列(5'→3′)产物大小/bp检测对象polC正向引物GCGCATGCTACCGCTTATGTMa反向引物CTAGCATAAAATGCCAAAGGTTCA探针VIC-ATGGCACTATGAATAGC-MGB正向引物CAAAAAGARCGTGTTGGWCGTAMmc/Mcc/Mpf反向引物CCAACAGCTGCAGCAATATC探针FAM-CGTACTGAAATTGAAGAAG-MGB9.2试验程序9.2.1核酸提取同8.2.1。7GB/T42364—20239.2.2.1.1检测Ma的反应体系：按照附录E中E.1在荧光PCR反应管中配制。每次反应均设置阳性对照和阴性对照。以携带MaPolC基因的质粒作为阳性对照，制备方法按照附录F,以无核酸酶水作9.2.2.1.2检测Mmc/Mcc/Mpf的反应体系：按照E.2在荧光PCR反应管中配制。每次反应均设置阳性对照和阴性对照。以携带Mmc/Mcc/Mpf任一支原体FusA基因的质粒作为阳性对照，制备方法按照附录F,以无核酸酶水作为阴性对照。95℃预变性10min;95℃变性15s,60℃退火延伸60s,40个循环，在每一循环的60℃时收集荧光信号。阳性对照的Ct值≤35.0且出现特异性扩增曲线，阴性对照应没有Ct值或Ct值>35.0且无特异性符合9.3.1的条件，当用polC引物或fusA引物检测样品任一Ct值≤35.0,且出现特异性扩增曲线，判定为传染性无乳症病原核酸阳性；被检样品无Ct值或Ct值>35.0时，则判定为传染性无乳症病8GB/T42364—2023(规范性)A.1MTB培养基配制MTB培养基所需试剂如下：——100mL/L的25%鲜酵母浸液；——5mL/L的5%醋酸铊溶液；——5mL/L的0.4%酚红。将21gPPLO肉汤溶于700mL去离子水中，116℃高压灭菌30min,其余成分混合溶解后用装试管或三角瓶等，2℃~8℃保存备用。5%醋酸铊溶液(5mL/L)可用硫酸黏菌素(37.5mg/L)A.2MTA培养基配制MTB培养基所需试剂如下：——100mL/L的25%鲜酵母浸液；——5mL/L的5%醋酸铊溶液；——20万IU/L的青霉素；-—5mL/L的0.4%酚红。NaOH调节pH至7.6～7.8,倾倒平皿或斜面等，2℃~8℃保存备用。5%醋酸铊溶液(5mL/L)可用9B.1TAE电泳缓冲液(pH8.0)——57.1mL的冰乙酸。B.21%琼脂糖电泳凝胶制备1%琼脂糖电泳凝胶所需试剂如下：——1g的琼脂糖；——12.5μL的2×PCR预混合液(含Taq酶);以上总体积25pL。(规范性)PCR阳性对照的制备C.1仪器4对引物，浓度均为20pmol/μL,包括Ma引物(MAGAUVRC1-L/MAGAUVRC1-R)、Mm和LB培养基。C.3.1Ma引物序列上游引物MAGAUVRC1-L:5'-CTCAAAAATACATCAACAAGC-3′C.3.2Mmc引物序列下游引物MMMLC2-R:5'-CTCCTCATATTCCCCTA下游引物MCCPL1-R:5'-CTTTCACCGCTTGTTGAATG-3′C.3.4Mpf引物序列下游引物Mput2:5'-CATATCATCAACTAGATTAATAGTAGCAC-3'C.4阳性质粒的构建和鉴定C.4.1PCR扩增和产物回收为：95℃预变性5min,35个循环(94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min),最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定扩增得到大小为1624bp的目的基因片段。C.4.1.2MmcPCR扩增和产物回收以MMMLC2-L和MMMLC2-R为引物，以提取到的丝状支原体山羊亚种DNA为模板，扩增条件为：95℃预变性5min,35个循环(94℃变性30s,49℃退火30s,72℃延伸1min),最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定扩增得到大小为1049bp为：95℃预变性5min,35个循环(94℃变性30s,51℃退火30s,72℃延伸1min),最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定扩增得到大小为1356bp以Mputl和Mput2为引物，以提取到的腐败支原体DNA为模板，扩增条件为：95℃预变性5min,35个循环(94℃变性30s,40℃退火30s,72℃延伸30s),最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定扩增得到用商品化胶回收试剂盒分别回收纯化C.4.1获得的PCR产物，将纯化DNA片段分别与pMD平板上，37℃培养12h～16h。挑取单一的白色菌落至含有氨苄青霉素的液体培养基中，于37℃、200r/min振荡培养至ODso值(波长600nm处的光密度值)1.0～1.2,取菌液2mL～5mL,利用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。将序列测定正确的质粒分别命名为pMD-19T-1624、pMD-19T-1049、pMD-19T-1356和pMD-19T-316,作为4种支原体PCR阳性对照。质粒和含有重组子的阳性菌分别保存于—20℃和一80℃。GB/T42364—2023(资料性)检测样品电泳参照图传染性无乳症(CA)4种病原PCR检测结果阳性参照图如图D.1所示。2000bp750bp500bp250bp1——Ma阳性对照；3——Mmc阳性对照；4—Mmc阴性对照；5——Mcc阳性对照；7-—Mpf阳性对照；图D.1样品检测电泳图荧光PCR反应体系E.1检测Ma的荧光PCR反应体系配制检测Ma的荧光PCR反应体系所需试剂如下：——10μL的实时荧光定量PCR预混液；——8.5μL的无核酸酶水；——5μLDNA模板。E.2检测Mmc/Mcc/Mpf的荧光PCR反应体系配制检测Mmc/Mcc/Mpf的荧光PCR反应体系所需试剂如下：