DB37-T 4725.2-2024 动物疫病诊断技术 第2部分：α疱疹病毒

65.020.30CCS

B

4437 DB37/T

—2024动物疫病诊断技术 第

2

部分：α

毒Diagnostic

of

disease—Part

2:

山东省市场监督管理局 发

布DB37/T

4725.2—2024 本文件按照GB/T

—《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是DB37/T

4725《动物疫病诊断技术》的第2部分，DB37/T

4725已经发布了以下部分：——第

2

部分：α

疱疹病毒。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。DB37/T

4725.2—2024 动物疫病的病原制定相应的诊断标准，有利于推动相关动物疫病的监测与管理。DB37/T

4725《动物疫病诊断技术》是针对畜禽养殖场不同动物疫病的致病原，明确动物疫病病原发展。DB37/T

4725

拟由以下部分构成。——第

1

部分：非洲猪瘟。目的在于指导防控山东省内规模化养猪场非洲猪瘟的诊断与防控。——第

2

部分：α

疱疹病毒。目的在于指导防控山东省内畜禽养殖场

α

疱疹病毒的诊断与防控。疱疹病毒（herpes

）是一类有包膜、基因组为双链DNA的病毒。主要分为α疱疹病毒、β疱疹病毒、γ疱疹病毒3种亚型。其中α疱疹病毒对动物的危害程度最大。该病毒感染宿主广泛，包括猪、鸡、牛、马和驴等，在国内外均有分布。IIDB37/T

4725.2—2024

1 范围本文件规定了猪伪狂犬病，鸡马立克氏病，牛传染性鼻气管炎和马鼻肺炎的流行特点和诊断方法。本文件适用于猪、鸡、牛、马、驴

α疱疹病毒的流行病学调查、诊断和检测。2 规范性引用文件文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T

兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 流行特点4.1 猪伪狂犬病由猪伪狂犬病毒（

pseudorabies

virus，）感染猪引起的一种急性传染病。猪是伪狂群中也存在鼻分泌物传播的现象。该病呈季节性流行，常发生在寒冷的季节。4.2鸡马立克氏病由鸡疱疹病毒2Gallid

Alphaherpesvirus

2，Marek’s

virus，MDV传播，另外，污染的饲料和饮水，以及饲养人员流动也可传播该病。2月龄～5月龄的鸡常发。4.3 牛传染性鼻气管炎由牛疱疹病毒1型（

herpesvirus

1，BoHV-1）感染牛引起的一种接触性传染病。病牛和带于秋、冬寒冷季节。4.4 马鼻肺炎由马疱疹病毒1型、4型或8型（Equine

herpesvirus

type，EHV-1/4/8）感染马属动物引起的一种急性、热性传染病。病马或驴和恢复后带毒的马或驴是主要传染源。该病主要通过呼吸道传播，另外，部分带毒的公马或驴可通过交配传播。该病多发生于秋冬和早春。DB37/T

4725.2—20245 诊断5.1 临床诊断5.1.1 猪伪狂犬病潜伏期一般为2

6

天，刚配种的母猪发病时易出现隐形流产；母猪发病早期无显著症状，妊娠母猪分娩前或后1周出现食欲下降甚至废绝，且出现早产，流产，产死胎或弱胎；公猪出现睾丸萎缩，阴囊肿大，精子活力低。哺乳仔猪感染以后出现高热，抽搐，震颤和共济失调等神经症状。5.1.2鸡马立克氏病潜伏期一般34周，根据疱疹病毒侵害部位不同，分为四种类型。5.1.2.1 神经型：患病鸡出现站立不稳，呈“劈叉”姿势，翅膀下垂，低头或斜颈等为典型症状。5.1.2.2 内脏型：常见于

50

日龄～70

日龄的鸡，病鸡精神萎顿，食欲减退，消瘦，羽毛松乱，鸡冠苍白或黑紫色、皱缩，伴有黄白色或黄绿色下痢，常因脱水导致死亡。5.1.2.3 重者失明。5.1.2.4 皮肤型：病鸡常出现毛囊肿大或皮肤结节。5.1.3 牛传染性鼻气管炎潜伏期7

天左右，根据疱疹病毒侵害部位不同，分为四种类型。5.1.3.1

咽下障碍。5.1.3.2 结膜角膜炎型：病牛出现结膜和角膜充血，眼睑肿大，流泪，角膜浑浊，有坏死性斑点。5.1.3.3 生殖器型：病母牛体温升高，精神沉郁，食欲废绝，外阴肿胀有小脓疱；出现子宫炎导致流产，产死胎。公牛感染出现传染性脓疱型包皮龟头炎，丧失配种能力。5.1.3.4 脑膜炎型：以

6

月龄以内的犊牛易发，体温升高，出现惊厥，共济失调，角弓反张等现象。5.1.4 马鼻肺炎潜伏期2

10

而死亡。孕马或孕驴出现流产，或驴驹死亡。以12岁马或驴多发，3岁后呈隐性感染。5.2 实验室诊断5.2.1 猪伪狂犬病5.2.1.1 样品采集按照NY/T

规定，采集患病猪的鼻拭子、血液、肺脏、淋巴结、脑和扁桃体等组织。5.2.1.2 聚合酶链式反应（）检测与电泳分析鉴于

μL鼻拭子或病料组织的上清液借助商品化试剂盒制备DNAPCR1gE引物用于野毒鉴别，gBA

bp或

。

’）PRV-gE-F368

PRV-gE-RPRV-gB-F480

PRV-gB-RACGGCGACCTGGACG

’）qPRV-gE-F96

bpqPRV-gE-RCTCCTTGRTGACCGTGACGqPRV-gB-FGTCCGTGAAGCGGTTCGTGAT95

qPRV-gB-RACAAGTTCAAGGCCCACATCTACDB37/T

4725.2—2024表1普通

引物信息5.2.1.3实时荧光定量

（）检测鉴于PRV的检测需要区分野毒感染还是由疫苗免疫造成，以纯化的为模板，利用特异性引物分别进行PCR检测（引物序列见表2，gE引物用于鉴别野毒，gB引物用于常规检测），操作步骤按照附录B规定执行。表2 荧光定量

引物信息5.2.1.4野毒分离与检测分析核酸电泳结果，或结果，选取判定为猪伪狂犬病毒阳性的脑，肺脏或淋巴结等病料借助研磨仪匀浆后，经反复冻融3次后，5

000

rpm

10

。收集上清借助0.22

μm滤膜除菌后，接种至猪肾细胞（PK-15）中，同时添加1

000

IU/mL青霉素和1

μg/mL链霉素，设置空白对照组。

℃吸附后1

h，换成

DMEM3

天～5

）。5.2.1.5 数据处理分析5.2.1.5.1 将

PCR

产物借助

1.0%

小分别为

或

480

bp

符合预期，且空白对照没有条带，将阳性片段克隆至

pMD-18T

载体，送生物

NCBI

C

病毒感染阳性，否则判定为阴性。5.2.1.5.2qRT-PCR

结果显示待检测样品

值大于

35

SCt

值小于35

且出现“S”型扩增曲线时判定为阳性。5.2.1.5.3 若

PK-15

细胞出现

CPE，即细胞出现变圆、聚集、拉丝，并最终全部脱落。需进一步收取细胞提取

DNA，借助上述特异性引物，进行

或

qRT-PCR

检测和测序确定，若易感细胞未出现

，应将细胞培养物冻融后盲传

3

代，若盲传后没有

出现，则判定为未分离到病毒。5.2.2 鸡马立克氏病5.2.2.1 采集病料样品采集患病鸡的血液、淋巴组织、脾脏组织或肿瘤细胞或羽髓匀浆等，参考

541要求进行。5.2.2.2 PCR

检测与电泳分析

’）MDV073-F360

MDV073-RGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCqMDV073-F213

qMDV073-RTGCAACAATGCGTTCTTATDB37/T

4725.2—2024将待测病料样品借助试剂盒提取，作为模板，借助特异性引物（序列参见表3）进行PCR检测，具体操作步骤参照附录APCR产物利用1.0%的核酸胶进行电泳分析，目的片段大小为

bp。5.2.2.3 qRT-PCR

以5.2.2.2纯化的为模版，利用特异性引物分别进qRT-PCR检测（序列参见表3），qRT-PCR操作步骤参照附录B。表3 引物信息5.2.2.4 野毒分离与检测2型阳性的病料组织借助研磨仪匀浆后，经反复冻融3次后，5

000

离心10

。收集上清借助0.22

μm滤膜除菌后，接种至鸭胚成纤维细胞（DEF）中，同时添加1

IU/mL青霉素和1

000

μg/mL链霉素，设置空白对照组。37

℃吸附后1

h，换成3%

DMEM，放置培养箱3

5

天，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（5.2.2.5 数据处理分析5.2.2.5.1 PCR

产物经

1.0%

DNA

bp

pMD-18T

的序列与

NCBI

公布的标准序列（参考附录

C）同源性大于

2

型感染阳性，否则判定为阴性。5.2.2.5.2 qRT-PCR

结果显示待检测样品

值大于

35SCt

值小于

35，且出现“S”型扩增曲线时判定为鸡疱疹病毒

2

型感染阳性。5.2.2.5.3 若

DEF

细胞出现

，即细胞出现变圆、聚集、拉丝，并最终全部脱落。需进一步收取细胞提取

或

检测和测序确定，若易感细胞未出现

CPE将细胞培养物冻融后盲传

3

代，若盲传后没有

CPE

出现，则判定为未分离到病毒。5.2.3 牛传染性鼻气管炎5.2.3.1 病料样品采集采集鼻拭子，血液，流产胎儿肺脏，生殖道分泌物等病料，按NY/T

541要求进行。5.2.3.2 PCR

将待测病料样品借助试剂盒提取，作为模板，借助特异性引物（序列参见表4）进行PCR检测，具体操作步骤参照附录APCR产物利用1.0%核酸胶进行电泳分析，目的片段大小为479

bp。5.2.3.3 qRT-PCR

以5.2.3.2纯化的为模板，利用特异性引物分别进行qRT-PCR检测（序列参见表4qRT-PCR具体操作步骤参照附录B。

’）EHV-1

GAACCTCAGCCAACCCA792

EHV-1

GCACTTTGCGGACGAACEHV-4

482

EHV-4

EHV-8

316

EHV-8

’）BoHV-1

gB-F479

BoHV-1

gB-RqBoHV-1

97

bpqBoHV-1

DB37/T

4725.2—2024表4 引物信息5.2.3.4 野毒分离与检测1型阳性的组织病料借助研磨仪匀浆后，经反复冻融3次后，5

000

离心

min。取上清用0.22

μm滤膜除菌后，接种至牛肾细胞（MDBK）中，同时加入1

000

IU/mL青霉素和1

000

μg/mL37

℃吸附后1

h3%

DMEM细胞培养液，放置培养箱3

天～5

天，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。5.2.3.5 数据处理分析5.2.3.5.1 PCR

产物借助

1.0%核酸胶进行分析，参照

标准分子量，若待测样品中扩增出片段大小为

479

bp

序的序列与

NCBI

C

95%

1

型感染阳性，否则判定为阴性。5.2.3.5.2 qRT-PCR

结果显示待检测样品

值大于

35SCt

值小于

35，且出现“S”型扩增曲线时判定为牛疱疹病毒

1

型感染阳性。5.2.3.5.3 若

MDBK

细胞出现

胞提取

DNA

或

CPE

3

代，若盲传后没有

CPE

出现，则判定为未分离到病毒。5.2.4 马鼻肺炎5.2.4.1 病料样品采集采集鼻拭子，血液，马或驴的流产胎盘，肺脏和脑等病料组织，按NY/T

541要求进行。5.2.4.2 PCR

将待测病料样品借助试剂盒提取作为模板，借助特异性引物（序列参见表5）进行检测，具体操作步骤参照附录A。将PCR产物利用1.0%核酸胶进行电泳分析，目的片段大小为792

bp，

bp或316

bp。表5表5 PCR

引物信息

’）qEHV-1

gB-F302

qEHV-1

gB-RCCTCCACCTCCTCGACGATGCqEHV-4

gB-FCGCAGAGGATGGAGACTTTTACA78

bpqEHV-4

gB-FCATGACCGTGGGGGTTCAAqEHV-8

gG-F178

qEHV-8

gG-RDB37/T

4725.2—20245.2.4.3 qRT-PCR

以5.2.4.2纯化的为模板，利用特异性引物分别进qRT-PCR检测（序列参见表6），qRT-PCR操作步骤参照附录B。表6 qRT-PCR

表6 qRT-PCR

引物信息EHV-1/4/83次后，5

000

10

0.22μm（RK-13）中，同时加入1

000

IU/mL青霉素和1

μg/mL链霉素，设置空白对照组。37

℃吸附后1

h，换成3%

FBS

MEM，放置培养箱3

天～5

天，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。5.2.4.5 数据处理分析5.2.4.5.1 PCR

产物借助

1.0%核酸胶进行分析，参照

标准分子量，若待测样品中扩增出片段大小为

792

bp，482

bp

或

316

NCBI

C

95%病毒

1

型，马疱疹病毒

4

型或马疱疹病毒

8

型感染阳性，否则判定为阴性。5.2.4.5.2 qRT-PCR

结果显示待检测样品

值大于

35SCt

值小于

35S

1

4

型或马疱疹病毒

8

型感染阳性。5.2.4.5.3 若

RK-13

细胞出现

CPE，即细胞出现变圆、聚集、拉丝，并最终全部脱落。需进一步收取细胞提取

PCR

或

出现

，应将细胞培养物冻融后盲传

3

代，若盲传后没有

出现，则判定为未分离到病毒。5.3综合判定若患病动物（猪，鸡，牛，马或驴）出现呼吸困难，流产和神经症状等，则可判定为疑似α疱疹病毒感染，需借助PCR，荧光定量进行检测，最后结合病原分离和测序等方法进行确诊。

Mix1010

10

20DB37/T

4725.2—2024

附录 A（规范性）聚合酶链式反应（）检测与分析方法A.1 命名聚合酶链式反应

chain

reaction，PCR)，又称为无细胞分子克隆系统，简称PCR。A.2 原理体外聚合酶促合成特异95

55

和适温延伸（72

℃）等3个步骤反复的热循环构成。体系包含聚合酶，引物，模板等，常设定为30个循环。A.3试剂或材料A.3.1 商品化Taq

premixA.3.2 对应靶基因的特异性引物。A.3.3实验室用水参考GB/T

6682。A.3.4 不同病原模板。A.3.5 0.2

mL透明PCR管。A.3.6 Agarose琼脂糖。A.3.7 标准分子量maker。A.4 仪器设备A.4.1 普通仪器。A.4.2 核酸电泳仪。A.5 试验步骤配制体系参照表GB/T

668295

℃预变性3

min；95

℃

60

s，55

℃

30

s，72

℃

60

s，30个循环。72

℃延伸

min，4

℃保存。PCR用1.0%核酸胶进行分析，待电泳结束，借助凝胶成像系统观察电泳结果。表A.1表A.1

PCR

体系配制

SYBR

qPCR

1010

10

20DB37/T

4725.2—2024

附 录 B（规范性）实时荧光定量

（）检测B.1 命名实时荧光定量（Quantitative

real

time

chain

reaction，）称定量即时聚合酶链锁反应。B.2 实验原理qRT-PCR是一种在扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（）循环后产物总量的方法，通过内参或者外参法对待测样品中的特定序列进行定量分析的方法。B.3 实验试剂与耗材SYBR

Green

qPCR

MixGB/T6682，不同病原DNA模板，透明八联管。该实验所需要的仪器：荧光定量PCRB.4 实验步骤配制体系参照表GB/T

668295

℃预变性30

s；95

℃

s，60

℃

30

s，40个循环。溶解曲线：95

℃

15

s，60

℃

60

s，95

℃

15

s，借助定量PCR仪分析系统观察结果。表B.1表B.1

qRT-PCR

体系配制DB37/T

4725.2—2024

附录 C（资料性）PCR

和

qRT-PCR

目的基因序列C.1 猪伪狂犬病毒

参考序列(大小为

TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGC.2 猪伪狂犬病毒

参考序列(大小为

96

bp)

(用于鉴别野毒)CTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCAYCAAGGAGC.3 猪伪狂犬病毒

基因参考序列(大小为

(用于常规检测)AGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTGATCTCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCAAGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCTGCGAGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGAGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCGGTCGCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGCCGTC.4 猪伪狂犬病毒

引物参考序列(大小为

95

bp)

(用于常规检测)GTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTC.5 禽疱疹病毒

2

型

MDV073

PCR

参考序列(大小为

bp)ATTTGATTCAGATTTTGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCATTCTCTGACTCCACGGATAGAATAGTACGGGGTCGTTGTACAAGAACCCGTTTTTTATTCAAATGCTCCCCCAATATATTTGGGTTTTGTCTTTCGGCCAGCATTAATGCGCGAACGGAATGTACAACAGCC.6 禽疱疹病毒

2

型

MDV073

qRT-PCR

参考序列(

213

bp)GTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCAC.7牛疱疹病毒

1

型

gB

基因

参考序列(大小为

479

TACGACTCGTTCGCGCTCTCGACCGGGGACATTATCTACATGTCGCCCTTTTACGGGCTGCGCGAGGGCGCGCACCGCGAGCACACCAGCTACTCGCCGGAGCGCTTCCAGCAGATCGAGGGCTACTACAAGCGCGACATGGCCACGGGCCGGCGCCTCAAGGAGCCGGTCTCGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCACGTGACGGTAGCCTGGGACTGGGTGCCCAAGCGCAAAAACGTGTGCTCGCTGGCCAAGTGGCGCGADB37/T

4725.2—2024GGCGGACGAAATGCTGCGAGACGAGAGCCGCGGGAACTTCCGCTTCACGGCCCGCTCGCTCTCGGCGACCTTTGTGAGCGACAGCCACACCTTCGCGTTGCAGAATGTGCCGCTGAGCGACTGCGTGATCGAAGAGGCCGAGGCCGCGGTCGAGCGCGTCTACCGCGAGCGCTACAACGGCACGCACGTGCTGTCGGGCAGCTTGGAGACGTACCC.8 牛疱疹病毒

1

型

gB

基因

参考序列(大小为

97

bp)CTGGCACACGACGGACGATGTGTACACGGCGCTGGGCTCGGCGGGGCTCTACCGCACGGGCACCTCTGTGAACTGCATCGTGGAAGAAGTGGAGGCGC.9 马疱疹病毒

1

型

gB

基因

参考序列(大小为

792

GAACCTCAGCCAACCCAAGATGGTGTGCATAGAGAACAAATTCTACATCGCTTGCACAAACGAGCAGTGGAGGCAACGGCAGGTACCGATTCTTCCAACGTCACCGCCAAACAGCTGGAGCTCATCAAAACCACGTCGTCTATCGAGTTTGCCATGCTACAGTTTGCATACGATCACATCCAATCCCACGTCAATGAAATGCTAAGTAGAATAGCAACTGCGTGGTGTACCCTCCAAAACAAAGAGCGGACCCTATGGAACGAAATGGTGAAGATTAACCCGAGCGCCATAGTCTCCGCAACCCTTGACGAGCGAGTTGCAGCGAGGGTCCTGGGGGACGTGATAGCTATAACGCACTGCGCCAAAATAGAGGGCAACGTGTACTTGCAAAACTCCATGCGCTCGATGGACAGTAACACGTGCTACTCCCGCCCCCCCGTAACATTTACAATTACTAAGAATGCAAACAACAGAGGGTCGATAGAAGGCCAGCTGGGAGAGGAGAACGAGATTTTCACGGAGCGCAAGCTGATCGAGCCGTGCGCCCTCAATCAGAAGCGCTACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTACGTTTACTACGAGAACTACACGTTCGTCCGCAAAGTGCCCCCCACGGAAATCGAGGTTATCAGCACGTACGTTGAACTAAACTTGACCCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTCTGCCCCTGGAGGTGTACACGCGGGCTGAGCTGGAGGACACCGGCCTGCTAGACTACAGCGAAATACAGCGCCGCAACCAGCTCCACGCTCTCAGGTTTTC.10 马疱疹病毒

1

型

gB

基因

参考序列(大小为

bp)GCCATACGTCCCTGTCCGACAGATACAATGACAGGGTTCCGGTTTCGGTGGAGGAGATCTTCGGTCTCATCGACAGTAAGGGAAAATGTTCGTCAAAGGCCGAGTACCTCAGAGATAACATCATGCACCACGCGTACCACGACGACGAGGACGAGGTGGAGCTTGATTTGGTGCCGTCCAAGTTTGCAACTCCGGGGGCCAGAGCCTGGCAGACCACCAACGATACTACGTCTTACGTGGGGTGGATGCCATGGAGGCACTACACGTCAACGTCTGTCAACTGCATCGTCGAGGAGGTGGAGGC.11 马疱疹病毒

4

型

gB

基因

参考序列(大小为

482

TTGCCGCAACTCGCTCGTCAAGAGTGGCGGAAAC