真核生物复制课件

ORC：Origin

RecognitionComplex5、真核生物复制的起始“Licensingmechanisms”S期DNA合成MCM：微染色体支持蛋白真核生物复制二DNA链的延长（一）原核生物DNA链的延伸延伸反应：在RNA引物的OH端由DNA聚合酶III，按碱基互补规则延伸。前导链的延长：3’→5’方向这条链做模板链的新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合成（5’→3’）。

真核生物复制随从链的延长5’→3’方向这条链做模板链的新链合成则不能随着复制叉向前移动进行连续合成，只能分段合成一小段，这一小段新合成的DNA链称冈奇片段。每一段新合成的一小段中有RNA，由RNA酶水解，DNA聚合酶I补平，最后由连接酶连接。真核生物复制真核生物复制DNA链延长的要点1)DNA聚合酶不能从头合成新链，只能在3’-OH羟基端延长。复制起始时的3’-OH羟基端是RNA。2)按照碱基互补原则合成新链。3)两条链同时复制，新链的延伸方向是5’→3’，一条链连续合成，称主导链，另一条链不连续合成，称随从链（后随链）。真核生物复制4)复制以双向进行，复制正在进行的部位称复制叉（Replicationfork）,复制叉从起始点沿着DNA移动。真核生物复制真核生物复制（二）SV40的DNA延伸1、前导链的延伸

Pol

合成一段新链在RFC和PCNA协助下，PolPol转换由Pol完成全部前导链的合成2、后随链的延伸真核生物复制真核生物复制复制的基本模式θ型：细菌真核生物复制滚环式φX174D型线粒体DNA真核生物复制Aprotein:Phage编码滚环可形成多联体真核生物复制线粒体DNA复制裸露闭环双链状

D型复制H链：富含GL链：富含CDNA聚合酶γ真核生物复制三复制的终止对于线性DNA复制例如噬菌体等比较简单，复制到分子末端终止。对于环状的大肠杆菌DNA复制和真核生物的DNA复制就比较复杂。

复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代DNA缠绕在一起，需要分开。大肠杆菌：有复制起始点，也有复制终止点。真核生物复制

细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子(terminator)位点，E.coli有7个终止子位点。Tus:Terminusutilizationsubstance真核生物复制真核生物复制真核生物复制

线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短，需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。5

3

3

55

3

3

5端粒DNA：真核生物复制2009诺贝尔生理/医学奖真核生物复制端粒和端粒酶发现大事记1939年，BarbaraMcClintock发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合

1972年，JamesWatson提出染色体复制的末端隐缩问题

1978年，报道四膜虫的端粒序列

1982年，端粒的发现导致人工染色体的发明

1984年，报道酵母的端粒序列

1985年，报道四膜虫的端粒酶活性

1989年，报道四膜虫端粒酶的RNA亚基

1994年，报道酵母端粒酶的RNA亚基

1995年，报道酵母端粒酶活性

1996年，纯化了四膜虫端粒酶的催化亚基,遗传筛选到酵母端粒酶的催化亚基

1997年，证明了四膜虫和酵母端粒酶的催化亚基真核生物复制端粒酶(telomerase)

依赖RNA的DNA聚合酶,其实质是一种逆转录酶。能识别特定的端粒重复序列,以自身RNA的部分序列(5’-CUAACCCUAAC-3’)为模板,合成新的端粒重复序列,使端粒延长，保持染色体的完整不需要DNA模板已知的恶性肿瘤特异性最强的标志，永生细胞生殖细胞，造血干细胞，ips等非肿瘤细胞端粒的缩短与衰老真核生物复制端粒酶以自身的RNA为模板，在3'端合成DNA序列:RNA引物真核生物复制端粒酶的爬行模型真核生物复制真核生物复制母链藉非标准碱基配对回折DNA聚合酶端粒合成完成进一步加工真核生物复制

逆向转录(ReverseTranscription)

上世纪之初发现肿瘤RNA病毒。64年，Temin报道了抑制DNA合成的放线菌素D能抑制鸡肉瘤RNA病毒的繁殖。据此提出鸡肉瘤RNA病毒的繁殖须经过形成DNA的阶段。真核生物复制70年Temin和Baltimore两个实验室同时从(鸡)劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中发现，在逆转录病毒病毒颗粒中存在着一种以RNA为模板合成DNA的酶，称为RNA指导的DNA聚合酶。遗传信息从RNA流向DNA，即以RNA为模板合成DNA称为逆向转录，因此催化这一反应的酶又称逆转录酶。真核生物复制逆向转录酶

由逆转录病毒基因组中pol基因编码。是一种多功能酶。有以RNA为模板和以DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶活性。需要RNA或DNA做引物；有核糖核酸酶H的活性（在逆转录酶的C端），能从3’→5’和从5’→3’水解RNA，使RNA与DNA的杂交体分离。真核生物复制逆向转录过程

真核生物复制

三逆向转录酶的生物学意义

1用于合成cDNA.建立cDNA文库(cDNALibrary)，获得基因或探针。

2与PCR连用RT-PCR

互补DNA（complementaryDNA,cDNA）真核生物复制

第四节DNA复制的调控DNA复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，DNA复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。无论原核还是真核细胞中DNA复制都只发生在细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，DNA必须也只能复制一次。真核生物复制一大肠杆菌复制的调节1、起始体（orisome，起始复合物，蛋白质-oriC复合物）的装配

参与形成orisome的组分：DnaA,Hu,IHF，Fis，Dpi，IciA，Cnu，Hha，Rob，SeqA，ArcA相互作用：Fis,IHF调节

DnaA-ATP与oriC

的结合，HU调节DnaA,IHF结合到oriC,并增强DnaA解链能力。真核生物复制2、防止复制再次起始(1)DnaA活性的抑制

DnaA-ADPDnaA-ATP无活性RIDA有活性RIDA：regulatoryinactivationofDnaA

真核生物复制oriC(2)降低游离形式的DnaA水平DnaA结合位点datA区在复制后极短时间内降低DnaA水平可以结合300分子的DnaA真核生物复制(3)隔离oriC

oriCGATCCTAG甲基化未甲基化摸板链新合成链SeqA特异识别,并结合于半甲基化oriC的GATC序列,使oriC被隔离,防止复制再次发生真核生物复制二真核生物复制起始调控1、DNA复制起始的调控2、细胞周期监控点机制主要调控复制的起始真核生物复制(一)、DNA复制起始的调节1、复制起始点的选择复制起始点数量的调控真核细胞有多个复制起始点，起用多少起始点决定于S期的长短。

S期短，起始点多。S期长，起始点少。遗传性起始点：DNA上的起始元件功能性起始点：实际起始点遗传性起始点多于功能性起始点真核生物复制酵母：自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequeences,ARS)酵母细胞3号染色体上有14个遗传性复制起始点，只有6个功能性复制起始点。将Ura4基因处的强复制起始点突变后，在其附近的弱复制起始点就成为强复制起始点。

Ura4：乳清苷酸脱羧酶

真核生物复制高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。CHO细胞核蟾蜍卵细胞抽提物损坏CHO细胞核或

裸露DNA

非随机起始，同正常随机起始CHO细胞

复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关真核生物复制2、复制起始调控机制（1）复制的允许机制（Licensingmodel）

（2）蛋白激酶的调控真核生物复制

（1）复制的允许机制（Licensingmodel）

一个细胞周期中DNA复制发生一次且只能发生一次

蟾蜍卵细胞

Licensingcontrol

复制外源细胞核真核生物复制真核生物复制复制后，LicensingFactor失活，失活的LicensingFactor不能再次启动复制。核膜破裂后（细胞分裂后），新的LicensingFactor进入核，启动下一周期的DNA复制。真核生物复制（2）蛋白激酶的调控真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶：

CDK和Cdc7-Dbf4激酶(1)、前复制起始复合物的形成组成成分：ORC(OriginRecognitionComplex)

含6种蛋白质，Cdc6，RLF（ReplicationLicensingFactor,复制允许因子）。(2)、CDK激活前复制起始复合物

复制前复合物受蛋白激酶的调控，或变成起始复合物，起始复制，或在复制过程中转变成复制后复合物，就再也不能启动复制。

CDK（CyclinDependent),Cdc7-Dbf4激酶，蛋白激酶A，蛋白磷酸酶2A，都参与复制的起始，在不同阶段起作用。真核生物复制前复制起始复合物（pre-replicativecomplex，pre-RC)（在遗传性复制起始点装配）

CDK起始复合物（ReplicativeComplex,RC)（在功能性复制起始点形成）在G1期向S期过渡期间，CDK活性很高。真核生物复制CDK同时又是防止在同一细胞周期中DNA复制再次发生的因素,阻止复制起始复合物的组装。CDK对某些起始因子磷酸化,调控其在细胞内水平。真核生物复制（二）复制检查点机制

识别DNA损伤或DNA复制阻断，通过复杂的信号转导途径，阻断细胞周期，启动修复机制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞周期。真核生物复制在长期进化过程中，细胞形成一套保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制，即细胞周期检查点真核生物复制检查点：(1)G1S期检查点查看DNA有无损伤DNAdamagecheckpoint

细胞周期暂时减慢或停止。查看DNA复制的进度DNAreplicationcheckpoint

限制DNA复制速度(2)G2M

管理染色体的正确分配Spindleassemblycheckpoint真核生物复制第五节DNA损伤与修复DNA损伤类型和产生原因点突变

DNA聚合酶复制错误产生真核生物复制碱基自发的突变：甲基化分析真核生物复制缺失或插入核苷酸的缺失或插入碱基的缺失真核生物复制化学修饰氧化，甲基化，烷化真核生物复制DNA分子交联顺铂，丝裂酶素真核生物复制DNA分子断裂DNA单链断裂DNA双链断裂：射线，重金属，病毒整合，DNA重排真核生物复制真核生物复制DNA损伤的修复核苷酸修复

dGTP氧化产生8－氧代dGTP8oxodG8－氧代dGTP三磷酸脂酶水解该酶突变：A：T－C：G突变高100－10000倍真核生物复制dGTP真核生物复制直接修复O6－甲基鸟嘌呤－DNA甲基转移酶（MGMT）真核生物复制光修复真核生物复制3.碱基切除修复DNA转葡糖基酶

真核生物复制4.核苷酸切除修复真核生物复制5.错配修复真核生物复制真核生物复制DNA链断裂的修复非同源末端连接non-homologousend-joining真核生物复制同源重组修复homologousrecombination真核生物复制7.大肠杆菌SOS修复LexA，RecA修复完成后，DinI蛋白抑制RecA作用

真核生物复制真核生物复制Yeasttwohybrid真核生物复制DNA损伤修复的调控机制真核生物复制（1）G1期checkpoint，确保DNA损伤不被复制。这一阶段，DNA损伤激活蛋白激酶ATM，ATR和c－ABL，导致P53的磷酸化，并进一步上调P21WAF1表达水平。P21可以结合cyclin-CDK从而调节细胞周期。同时DNA损伤诱导Cdc25A的泛素化和降解，从而阻止细胞周期进行；（2）S期checkpoint，主要是当DNA损伤在G1期没有能够进行修复时防止DNA复制；（3）G2期checkpoint，主要功能是当细胞在S期晚期或者G2期DNA受到损伤时，阻止细胞分离，从而防止DNA损伤传递到子代细胞中；（4）M期checkpoint，细胞在M期染色质将发生固缩形成纺锤体结构，在后期姐妹染色体发生分离。当染色体受到损伤时，细胞停滞在M期，染色体重新恢复到染色质，从而使细胞有机会对DNA损伤进行修复后再进入M期。真核生物复制DNA损伤与细胞凋亡DNA损伤ATM/ATR丝/苏氨酸激酶CHK1，CHK2，P53等抗凋亡基因凋亡相关基因线粒体膜通透性升高，细胞色素C释放，激活Caspase细胞凋亡真核生物复制外源性因素：UV，射线，化学试剂等内源性因素：线粒体呼吸链产生活性氧

reactiveoxygenspecies（ROS），NO50000个损伤/天×细胞DNA损伤修复与疾病真核生物复制细胞的保护机制小分子如谷胱甘肽清除自由基超氧化物歧化酶（SOD）：清除羟基自由基等缺失导致肿瘤发生真