基因诊疗和基因治疗

生物化学与分子生物学基因诊疗和基因治疗第1页第二十五章基因诊疗和基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapy基因诊疗和基因治疗第2页第一节基因诊断GeneDiagnosis基因诊疗和基因治疗第3页基因诊疗优势：①可在源头上识别基因正常是否，属于“病因诊疗”②针对特定基因，特异性强③所用PCR等技术含有放大效应，故灵敏度高④适用性强，诊疗范围广是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表示水平是否正常，从而对疾病作出诊疗方法。基因诊疗定义：基因诊疗和基因治疗第4页、基因诊疗主要对象和样品起源主要是DNA分子，包括到功效分析时，还可定量检测RNA（主要是mRNA）和蛋白质等分子。临床上可用于基因诊疗样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。对象：样品起源：基因诊疗和基因治疗第5页二、基因诊疗技术分类定性分析定量分析基因分型检测基因突变测定基因拷贝数测定基因表示产物量基本流程：基因诊疗基础核酸抽提目标序列扩增分子杂交信号检测核酸分子杂交DNA序列分析技术几个技术联合使用基因诊疗和基因治疗第6页（一）基因缺失或插入诊疗1．DNA印迹法其能够区分正常和突变样品基因型，并可取得基因缺失或插入片段大小等信息。DNA印迹普通能够显示50bp～20kbpDNA片段，片段大小信息是该技术诊疗基因缺点主要依据。2．PCR法裂口PCR（gap-PCR），简便灵敏而更适合用于临床诊疗。该方法思绪是：设计并合成一组序列上跨越突变（缺失或插入）断裂点引物，从扩增片段大小直接判断是否存在缺失或插入突变。基因诊疗和基因治疗第7页（二）基因点突变诊疗1．等位基因特异性寡核苷酸分子杂交检测点突变有效技术是等位基因特异性寡核苷酸（allelespecificoligonucleotide，ASO）分子杂交。基因诊疗和基因治疗第8页2．反向点杂交反向点杂交（reversedotblot，RDB）是改进ASO技术。一次检测能够同时筛查各种突变，大大提升了基因诊疗效率。3．变性高效液相色谱DHPLC技术基本原理是利用待测样品DNA在PCR扩增过程单链产物能够随机与互补链相结合而形成双链特征，依据最终产物中是否出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变。4．DNA序列分析用于基因突变类型已经明确遗传病诊疗及产前诊疗。基因诊疗和基因治疗第9页三、基因诊疗医学应用（一）遗传性疾病诊疗和风险预测基因诊疗当前可用于遗传筛查和产前诊疗。疾病致病基因突变类型诊疗方法α地中海贫血α珠蛋白缺失为主Gap-PCR、DNA杂交、DHPLCβ地中海贫血β珠蛋白点突变为主反向点杂交、DHPLC甲型血友病凝血因子Ⅷ点突变为主PCR-RFLP乙型血友病凝血因子Ⅸ点突变、缺失等PCR-STR连锁分析苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶点突变PCR-STR连锁分析、ASO分子杂交马凡综合症原纤蛋白点突变、缺失PCR-VNTR连锁分析、DHPLC我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊疗基因诊疗和基因治疗第10页（二）多基因常见病预测性诊疗预测性诊疗可为被测者提供一些疾病发生风险评定意见。（三）传染病病原体检测适用情况①病原微生物现场快速检测，确定感染源；②病毒或致病菌快速分型，明确致病性或药品敏感性；③需要复杂分离培养条件，或当前尚不能体外培养病原微生物判定。基因诊疗和基因治疗第11页（四）疗效评价和用药指导PCR等基因诊疗技术已成为临床上检测和跟踪微小残留病灶常规方法。在系统说明人类药品代谢酶类及其它相关蛋白编码基因遗传多态性基础上，经过对不一样药品代谢基因靶点药品遗传学检测，将为真正实现个体化用药提供技术支撑。基因诊疗和基因治疗第12页（五）DNA指纹判定是法医学个体识别关键技术人与人之间一些DNA序列特征含有高度个体特异性和终生稳定性，正如人指纹普通，故称为DNA指纹（DNAfingerprinting）。STR等位基因在家庭中遗传示意图基因诊疗和基因治疗第13页第二节基因治疗GeneTherapy基因诊疗和基因治疗第14页是以改变人遗传物质为基础生物医学治疗，即经过一定方式将人正常基因或有治疗作用DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因治疗方法。它针正确是疾病根源，即异常基因本身。基因治疗定义基因诊疗和基因治疗第15页一、基因治疗基本策略（一）缺点基因准确原位修复基因矫正genecorrection基因置换genereplacement致病基因突变碱基进行纠正用正常基因经过重组原位替换致病基因这两种方法属于对缺点基因准确原位修复，既不破坏整个基因组结构，又可到达治疗疾病目标，是最为理想治疗方法。基因诊疗和基因治疗第16页（二）基因增补不删除突变致病基因，而在基因组某一位点额外插入正常基因，在体内表示出功效正常蛋白质，到达治疗疾病目标。这种对基因进行异位替换方法称为基因添加（geneaugmentation）或称基因增补，是当前临床上使用主要基因治疗策略。基因诊疗和基因治疗第17页（三）基因缄默或失活有些疾病是因为某一或一些基因过分表示引发，向患者体内导入有抑制基因表示作用核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解对应mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因异常表示，从而到达治疗疾病目标。这一策略称为基因失活（geneinactivation）或基因缄默（genesilencing）。基因诊疗和基因治疗第18页二、基因治疗基本程序基因治疗基本过程可分为5个步骤：①选择治疗基因②选择携带治疗基因载体③选择基因治疗靶细胞④在细胞和整体水平导入治疗基因⑤治疗基因表示检测基因诊疗和基因治疗第19页（一）选择治疗基因许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建去除膜结合特征受体），以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子正常基因都可作为治疗基因。简言之，只要清楚引发某种疾病突变基因是什么，就可用其对应正常基因或经改造基因作为治疗基因。基因诊疗和基因治疗第20页（二）选择携带治疗基因载体基因治疗用载体有病毒载体和非病毒载体两大类，多项选择取病毒载体。野生型病毒必须经过改造，剔除其复制必需基因和致病基因，消除其感染和致病能力。当前用作基因转移载体病毒有逆转录病毒（retrovirus）、腺病毒（adenovirus）、腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）、单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）等。基因诊疗和基因治疗第21页1.逆转录病毒载体逆转录病毒属于RNA病毒，其基因组中有编码逆转录酶和整合酶（integrase）基因。逆转录病毒载体有基因转移效率高、细胞宿主范围较广泛、DNA整合效率高等优点。缺点一是有感染性病毒可能；二是增加了肿瘤发生机会。基因诊疗和基因治疗第22页2.腺病毒载体腺病毒属DNA病毒，可引发人上呼吸道和眼部上皮细胞感染。安全性高转染效率高可用细胞范围广缺点基因组较大，构建复杂不能长久表示免疫原性较强，易被排斥优点基因诊疗和基因治疗第23页（三）选择基因治疗靶细胞靶细胞通常是体细胞（somaticcell），包含病变组织细胞或正常免疫功效细胞。1.造血干细胞：造血干细胞（hematopoieticstemcell，HSC）是骨髓中含有高度自我更新能力细胞，能深入分化为其它血细胞，并能保持基因组DNA稳定。2.皮肤成纤维细胞：皮肤成纤维细胞含有易采集、可在体外扩增培养、易于移植等优点。

3.肌细胞：肌细胞有特殊T管系统利于注射质粒DNA经内吞作用进入。环状质粒不整合入基因组DNA，能在肌细胞内较长时间保留。

基因诊疗和基因治疗第24页（四）将治疗基因导入人体将外源基因直接注入体内相关组织器官，使其进入对应细胞并进行表示。基因递送genedelivery间接体内疗法exvivo直接体内疗法invivo将需要接收基因靶细胞从体内取出，在体外培养，将携带有治疗基因载体导入细胞内，筛选出接收了治疗基因细胞，繁殖扩大后再回输体内，使治疗基因在体内表示对应产物。基因诊疗和基因治疗第25页基因导入细胞生物学法非生物学法病毒载体所介导基因导入，是经过病毒感染细胞实现，其特点是基因转移效率高，但安全问题需要重视。用物理或化学法，将治疗基因表示载体导入细胞内或直接导入人体内，操作简单、安全，不过转移效率低。基因诊疗和基因治疗第26页（五）治疗基因表示检测不论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表示。被导入基因表示状态能够用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导入基因是否整合到基因组以及整合部位，能够用DNA印迹技术进行分析。基因诊疗和基因治疗第27页三、基因治疗临床应用现实状况1.单基因遗传病基因治疗只受一对等位基因影响而发生疾病属于单基因遗传病，设计基因治疗方案相对轻易，比如镰刀状红细胞性贫血、α-地中海贫血、血友病等。基本方案是经过一定方法把正常基因导入到病人体内，表示出正常功效蛋白。基因诊疗和基因治疗第28页2.针对多基因病基因治疗由多个基因相互作用结果，并受环境原因影响