3.2基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节基因工程的基本操作程序

第三章基因工程思考问题：1.你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？2.培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？3.将目的基因导入受体细胞苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建4.目的基因的

检测与鉴定基因工程的基本操作程序1.概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。2.实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。一、目的基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因那么，如何筛选目的基因呢？二、筛选合适的目的基因序列数据库（如GenBank）序列比对工具（如BLAST）公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因问题：筛选出来的目的基因，该怎么获得它呢？三、获取目的基因的方法1.人工合成目的基因。2.通过构建基因文库来获取目的基因。3.常用PCR特异性地快速扩增目的基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。DNA合成仪PCR是_______________的缩写，是一项根据___________________的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_________，对____________________进行________的技术；（1）概念聚合酶链式反应DNA半保体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因4.利用PCR获取和扩增目的基因留复制原理操作环境目的优点：PCR扩增仪问题:结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？要点回顾:体内DNA复制模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶复制特点:①边解旋边复制

②半保留复制碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）条件复制原则:子链的延伸方向：5'端→3'端

因为DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。ATP耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物缓冲溶液（一般添加Mg2+）（2）PCR条件:4.利用PCR获取和扩增目的基因四种脱氧核苷三磷酸激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶（2种）

提供相应稳定的pH环境与某些离子；实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。(dNTP)要有一段已知目的基因的核苷酸序列PCR不用解旋酶，用高温代替dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链，细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端思考讨论解旋酶（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）1）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA待扩增的DNA片段第一步：变性3’3’5’5’3’5’3’5’变性90℃思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。PCR反应的过程01目的基因的筛选与获取2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

与两条单链DNA结合。

第二步：复性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’碱基互补配对5’5’思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。3’3’PCR反应的过程01目的基因的筛选与获取3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脱氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端PCR反应的过程01目的基因的筛选与获取PCR反应的过程、产物第一轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。

即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。01目的基因的筛选与获取（1）要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。（2）如果循环n次，则共需消耗

个引物。

则共需消耗

对引物。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2【问题探究1】2n+1－22n－1（3）两种引物都结合在DNA模板链的

端；

脱氧核苷酸连接在引物的

端进行延伸。3’3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2（4）设计引物的依据是？已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。

3’思考下列设计的引物失败的原因？用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交双链；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’【拓展思维】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？PCR技术DNA复制相同点模板原料不同点解旋方式场所酶能量结果DNA的两条母链四种脱氧核苷酸DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子7PCR技术与DNA复制过程比较dNTP（原料）提供细胞内的ATP提供例1下列有关PCR技术的叙述,错误的是 (

)A.每一次循环后目的基因的数量可以增加一倍B.PCR反应过程中需要3个不同的温度范围C.PCR反应过程中加入的酶的显著特性是耐高温D.模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用任务活动D【拓展资料】基因的结构DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遗传效应的DNA片段真核生物基因的表达真核生物的DNA转录形成的mRNA需要在细胞核加工处理成为成熟的mRNA后才能作为下一步翻译的模板。与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子终止子本质：位置：作用：是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于编码区上游；也是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于编码区下游；终止转录本质：位置：作用：原核细胞的基因结构启动子终止子非编码区非编码区编码区能编码特定的蛋白质编码区上游编码区下游启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基编码区的上游编码区的下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）二、基因表达载体的构建1.目的：①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;

2.组成：质粒①启动子基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA②终止子：限制酶切割位点基因的尾端，能终止mRNA的转录③标记基因作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来④复制原点⑤目的基因②使目的基因能够表达和发挥作用目的基因该插入什么位置？基因工程的核心目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入

，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达诱导型启动子：2.组成：基因工程的核心二、基因表达载体的构建1个切口质粒（载体）DNA分子（含目的基因）获得目的基因，带有两个黏性末端（/平末端）DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同种限制酶（或产生相同末端的限制酶）构建过程：【问题探究】请结合下图，回答问题：（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？能问题探讨：1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？活动一：基因表达载体的构建用EcolRⅠ限制酶（识别GAATTC，切割GA之间）切割载体和目的基因。---基因工程的核心问题探讨：1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；②还可以防止目的基因与载体的反向连接。【问题探究】所以如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？双酶切（产生不同的粘性末端）用两种不同的限制酶同时对目的基因和载体进行切割(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上

,其是

识别和结合的部位。

(5)请简要描述基因表达载体的构建过程。

RNA聚合酶用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段,产生末端相同的切口,再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。启动子【问题探究】【实战】图解限制酶的选择（1）不破坏目的基因：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。（3）确保表达载体和目的基因出现相同黏性末端：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；（4）为避免目的基