药物分析讲稿：第十章 抗菌药物的分析

第十章抗菌药物的分析-PAGE1-第十章抗菌药物的分析抗菌药物是指对细菌具有抑制和杀灭作用的药物，包括抗生素和合成抗菌药(磺胺类、喹诺酮类等)。抗生素是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。主要由微生物发酵、经化学纯化、精制和化学修饰等过程，最后制成适当制剂。根据化学结构分类，通常习惯将抗生素分为β-内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类)、氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、阿米卡星等)、四环素类(四环素、美他环素等)、大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、罗红霉素等)、多烯大环类(制霉菌素、两性霉素B)、多肽类(多黏菌素、放线霉素等)、苯烃胺类(氯霉素等)、蒽环类(多柔比星、柔红霉素等)和其他抗生素。抗生素与化学合成药物相比，有以下特点：(1)化学纯度较低：有三多。即同系物多，如庆大霉素含有四个主要组分；异构体多，如半合成β-内酰胺抗生素均存在光学异构体；降解物多，如四环素类存在脱水、差向异构体；(2)活性组分发生变异：微生物的株菌的变化、发酵条件均可导致产品质量发生变化，如组分的组成或比例的改变；(3)稳定性差：抗生素分子结构中通常含有活泼基团，而这些基团往往是抗生素的活性中心，如青霉素类、头孢菌素类结构中的β-内酰胺环，链霉素结构中的醛基等均具有稳定性差的特点。抗生素的质量控制方法主要通过鉴别、检查、含量(效价)测定三个方面来判断其质量的优劣。由于抗生素类药物的特点，其分析方法可分为微生物检定法和化学及物理化学法。微生物检定法：是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生素效价的一种方法。测定方法可分为稀释法、比浊法和管碟琼脂扩散法，后两种为抗生素微生物检定的国际通用方法。《中国药典》采用管碟琼脂扩散法，USP采用后两种方法。微生物检定法的优点是灵敏度高、需用量小，测定结果直观；测定原理与临床应用的要求一致，更能确定抗生素的医疗价值；而且适用范围广，既适用于较纯的精制品，亦适用于纯度较差的制品，对已知分子结构或结构不明确的抗生素均能适用。但该法有操作步骤繁多，测定时间长，误差大等缺点。化学及物理化学法：对于提纯的、化学结构已确定的抗生素可用此法测定。本类方法是根据抗生素的分子结构的特点，利用其特有的化学或物理化学性质而进行的。如果是利用某一类型抗生素的共同结构的反应，其测定结果往往只能代表药物的总含量，并不一定能代表抗生素的效价。只有当本法的测定结果与生物效价吻合时，才能用于效价测定。该法操作简便、省时、方法准确，并具有较高的专属性。抗生素活性表示方法：抗生素的活性以效价表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。用单位(U)或微克(ug)表示。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的，如lmg青霉素钠定为1670单位；lmg庆大霉素定为590单位；lmg硫酸卡那霉素定为670单位。一种抗生素有一个效价基准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类进行换算。例如，lmg青霉素钾的单位(u)=1670×356.4／372.5=1598U。以上为抗生素的理论效价，实际样品往往低于该理论效价。早期很多抗生素的质量控制主要采用生物学方法。近年来，随着对抗生素分子结构及理化性质了解的不断深入，以及分离、分析方法的快速发展，化学、物理化学方法用于特定抗生素类分析的专属性已很大程度上得到保证。化学、物理化学方法正逐步取代生物学方法，成为抗生素类药物测定方法的主流。《中国药典》及英、美等发达国家药典对所收载抗生素类药物的原料和制剂的含量测定方法很好地体现了这一变化趋势。但对分子结构复杂、多组分的抗生素，生物学法仍然是首选的效价测定方法。本章主要讨论β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类药物的物理、化学性质，鉴别反应、杂质检查以及含量测定的原理与方法。第一节β-内酰胺类抗生素这类抗生素包括青霉素类和头孢菌素类。它们的分子结构中均含有β-内酰胺环，因此该类抗生素统称为β-内酰胺类抗生素。一、结构与性质(一)结构青霉素类和头孢菌素类分子中都含有一个游离羧基和酰胺侧链。青霉素类分子的母核为6-氨基青霉烷酸(6-APA)，头孢菌素类的母核为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，它们分别由氢化噻唑环或氢化噻嗪环与β-内酰胺环并合而成。R和R1的不同，构成了不同的青霉素和头孢菌素。代表性药物有青霉素钠、氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄，头孢唑啉等。(二)性质1、酸性与溶解度青霉素类和头孢菌素类分子中的游离羧基具有相当强的酸性(大多数青霉素的pKa在2.5～2.8之间)，能与无机碱或某些有机碱形成盐。它们的碱金属盐易溶于水，而有机碱盐却易溶于甲醇等有机溶剂，难溶于水。青霉素类的碱金属盐水溶液遇酸则析出游离酸的白色沉淀。2、旋光性青霉素类分子中含有三个手性碳原子，头孢菌素类分子中含有两个手性原子，故都具有旋光性。利用这一性质，可对这两类药物进行定性和定量分析。3、紫外吸收特性青霉素类分子的母核无共轭系统，但其侧链酰胺基团上R基如具有苯环或共轭系统，则可产生紫外吸收。如青霉素G在257nm、264nm波长处具有最大吸收。头孢菌素类由于母核部分具有O=C−N−C=C结构，R取代基具有苯环等共轭系统，故在260nm处有强紫外吸收。如头孢呋辛钠水溶液在274nm处有最大吸收。4、β-内酰胺环的不稳定性β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中心，其性质活泼，是分子结构中最不稳定的部分，其稳定性与含水量和纯度有很大关系。干燥条件下青霉素类和头孢菌素类药物均稳定，室温下密封保存可贮存3年以上，但它们的水溶液很不稳定，随pH和温度而有很大变化。青霉素水溶液在pH6～6.8时较稳定。本类药物可与酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子(铜、铅、汞和银)等作用，发生水解和分子重排，导致β-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性。青霉素的β-内酰胺环被破坏或发生分子重排后。产生青霉噻唑酸、青霉酸、青霉醛、青霉胺、α-青霉噻唑酰基羟胺酸和青霉烯酸等一系列的降解产物。降解反应如图l0-l所示。二、鉴别试验(一)色谱法(二)光谱法(三)钾、钠盐的焰色反应(四)呈色和沉淀反应1、在稀盐酸中生成白色沉淀青霉素钾和青霉素钠加水溶解后，加稀盐酸2滴，即析出难溶于水的游离酸白色沉淀。这些沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、三氯甲烷、乙醇或过量的盐酸中溶解。《中国药典》据此对这两种药物进行鉴别。2、羟肟酸铁反应3、硫酸-硝酸呈色反应4、与斐林试剂反应本类药物含有类似肽键结构，可产生双缩脲反应，开环分解，使碱性酒石酸铜盐还原显紫色。5、特殊反应利用R或R1基团的官能团反应，可以对一些特定的抗生素进行鉴别。三、抗生素类药物中高分子杂质检查四、含量测定青霉素类和头孢菌素类的含量测定可采用微生物法和理化测定法。《中国药典》多采用高效液相色谱法进行含量测定。第二节氨基糖苷类抗生素的分析本类抗生素都是以碱性环己多元醇为苷元与氨基缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素，其结构具有许多共性。这类抗生素主要有链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、阿米卡星、奈替米星、西索米星、依替米星。本章以链霉素和庆大霉素为例，讨论它们的鉴别和检查方法。一、链霉素(一)化学结构与性质1、化学结构链霉素的结构为一分子链霉胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷。其中链霉双糖胺是由链霉糖与N-甲基-L-葡萄糖胺所组成。链霉胍与链霉双糖胺间的苷键结合较弱，链霉糖与N-甲基-L-葡萄糖胺间的苷键结合较牢。2、性质(1)溶解度：链霉素的硫酸盐易溶于水，不溶于乙醇、三氯甲烷。(2)碱性：链霉素分子中有3个碱性中心(式中有*号处)，其中两个链霉胍上的强碱性胍基(pKa=11.5)，第3个是葡萄糖胺上的甲氨基(pKa=7.7)。因此，可与无机酸或有机酸形成可溶于水的盐，临床上多用其硫酸盐。(3)水解性：链霉素的水溶液以pH5～7.5最为稳定，过酸或过碱条件下均易水解失效。由于链霉胍与链霉胺间的苷键要比链霉糖与甲基葡萄糖胺间的苷键弱得多，在酸性条件下，链霉素先水解为链霉胍和链霉双糖胺，进一步得N-甲基-L-葡萄糖胺。弱碱性也能使链霉素水解为链霉胍及链霉双糖胺，但随后链霉糖部分分子重排为麦芽酚。生成麦芽酚是链霉素特有反应。(4)紫外吸收：特性链霉素在230nm处有紫外吸收。(二)鉴别试验1、麦芽酚反应麦芽酚为α-甲基-β-羟基-γ-吡喃酮，是链霉素在碱性溶液中，链霉糖经分子重排、环扩大形成六元环、然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍所生成。麦芽酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。此反应为链霉素的特有反应。因此被中、日、美、英等国家药典采用。《中国药典》对所收载的硫酸链霉素的鉴别方法是：取本供试品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠试液0.3ml，置水浴上加热5min，加硫酸铁铵溶液(取硫酸铁铵0.1g加0.5mol／L硫酸溶液5ml使溶解)0.5ml，即显紫红色。2、坂口反应硫酸链霉素水溶液加氢氧化钠试液水解生成链霉胍，链霉胍和8-羟基喹啉(或α-萘酚)作用，冷却后加次溴酸钠试液，生成橙红色化合物。此为链霉素水解产物链霉胍的特有反应。《中国药典》采用该方法对硫酸链霉素及注射用硫酸链霉素进行鉴别：取供试品约0.5mg，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml与0.1％8-羟基喹啉的乙醇溶液lrnl，放冷至约15℃，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。3、硫酸盐反应本类药物多为硫酸盐，利用硫酸盐能与氯化钡试液生成白色硫酸钡沉淀，各国药典对硫酸链霉素进行鉴别。4、茚三酮反应链霉素具有氨基糖苷结构，具有羟基胺类和α-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物：鉴别：取供试品水溶液(1→100)5ml，加茚三酮试液lml及吡啶0.5ml，加热10min时，溶液呈紫色。5、N-甲基葡萄糖胺反应链霉素经水解，产生N-甲基葡萄糖胺，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，在对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液(Ehrlich试剂)作用下，多羟基断开，生成红色缩合物：(三)有关物质的检查(四)含量测定《中国药典》采用微生物检定法测定链霉素原料及制剂的含量。《中国药典》中检查方法如下：精密称取本品适量，加灭菌水定量制成每1rnl中约含1000单位的溶液，照抗生素生物检定法(附录ⅨA)测定。二、庆大霉素第三节四环素类抗生素的分析四环素类抗生素在化学结构上都具有氢化并四苯环，因此被称为四环素类或四环素族。一、结构与性质(一)结构四环素类抗生素是氢化并四苯的衍生物，由A、B、C、D四个环组成。母核上共有下列官能团：C-4位上的二甲胺基[-N(CH3)2]、C-2位上的酰氨基(-CONH2)、C-10位的酚羟基(-OH)；有两个含有酚基和烯醇基的共轭双键系统(结构式中虚线内所示部分)。分子中的取代基R、R1、R2及R3不同，构成不同的四环素。常见四环素类抗生素的结构见表10-1。(二)性质1、酸碱性与溶解度四环素类分子中的酚羟基和烯醇型羟基显弱酸性；二甲胺基显弱碱性；因此，四环素类抗生素是两性化合物。遇酸及碱，均能生成相应的盐。这类抗生素是结晶性物质，具引湿性。其盐酸盐溶于水，并溶于碱或酸性溶液中，而不溶于三氯甲烷、乙醚等有机溶剂。四环素类抗生素的游离碱在水中的溶解度很小，其溶解度与溶液的pH有关，在pH4.5～7.2之间时难溶于水；当pH高于8或低于4时，水中溶解度增加。其盐类在水中会水解，当溶液浓度较大时，会析出游离碱。2、不稳定性四环素类抗生素对各种氧化剂(包括空气中的氧)、酸、碱都是不稳定的。干燥的四环素类游离碱和它们的盐类在避光条件下保存均稳定，但其水溶液随pH的不同会发生差向异构化、降解等反应，尤其是碱性水溶液，特别容易氧化，颜色很快变深，形成色素。(1)差向异构化性质：四环素类抗生素在弱酸性(pH2.0～6.0)溶液中，其A环手性C-4原子构型改变，发生差向异构化，形成差向四环素类(ETC)。反应是可逆的，达到平衡时溶液中的差向化合物的含量可达40％～60％。某些阴离子如磷酸根、枸橼酸根、醋酸根离子的存在，可加速这种异构化反应。四环素、金霉素很容易差向异构化，产生差向四环素和差向金霉素(具有蓝色荧光)，其抗菌性能极弱或完全消失；而土霉素、多西环素、美他环素，由于C-5上的羟基和C-4上的二甲胺基形成氢键而较稳定，C-4上不易发生差向异构化。(2)降解性质：①酸性降解：在酸性条件下特别是在加热情况下，四环素类抗生素C-6上的醇羟基和C-5口上的氢发生反式消去反应，生成脱水四环素(ATC)。和四环素一样，金霉素在酸性溶液中也能生成脱水金霉素。脱水四环素分子中，共轭双键的数目增加，色泽加深，对光的吸收程度也增大。橙黄色的脱水金霉素或脱水四环素，分别在435nm及445nm处有最大吸收。利用这一性质，可对金霉素或四环素进行比色测定。脱水四环素也可形成差向异构体，称差向脱水四环素(EATC)。②碱性降解：碱性溶液中，C-6上的羟基形成的氧负离子，向C-11发生分子内亲核进攻，经电子转移，C环破裂，生成无活性的具有内酯结构的异构体，四环素变成异四环素。3、旋光性四环素类抗生素分子中具有不对称碳原子，因此有旋光性，可用于定性、定量分析。各国药典测定该类抗生素的比旋度，如《中国药典》规定盐酸土霉素在盐酸(9→1000)溶液的比旋度为-1880~-2000，盐酸四环素的比旋度为-2400~-2580(0.01mol／L盐酸溶液)。4、与金属离子形成配位化合物本类抗生素分子中含酚羟基和烯醇基，能与金属离子形成不溶性的盐类或配位化合物。如与钙离子、镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐，与铁离子形成红色配位化合物，与铝离子形成黄色配位化合物。形成的有色配位化合物可用于鉴别或用紫外-可见分光光度法测定含量。二、鉴别试验(一)浓硫酸反应四环素类抗生素遇硫酸立即产生颜色，以此可区别各种四环类抗生素。如盐酸多西环素遇硫酸显黄色；盐酸四环素遇硫酸显深紫色，再加三氯化铁溶液变红棕色；盐酸金霉素遇硫酸显蓝色，渐变为橄榄绿色，加水lml后显金黄色或棕色。本类抗生素分子结构中具有酚羟基，在酸性溶液中遇三氯化铁试液即显色。上述的盐酸四环素遇硫酸显深紫色，再与三氯化铁试液反应呈棕红色的原理即如此。(二)氯化物反应四环素类药物均为盐酸盐，可以与硝酸银试液反应，从而鉴别。(三)紫外-可见分光光度法本类抗生素分子内含有共轭双键体系，在紫外光区有吸收。《中国药典》因此将紫外吸收的特征作为盐酸土霉素、盐酸美他环素的鉴别项目。(四)高效液相色谱法(五)薄层色谱法三、特殊杂质的检查四、含量测定四环素类抗生素的含量测定，各国药典多采用高效液相色谱法。第四节喹诺酮类抗菌药的分析喹诺酮类药物具有抗菌谱广、抗菌作用强、使用安全、细菌对其不易产生耐药性、易于制造等优点，自1962年发现第一个喹诺酮类抗菌药萘啶酸以来，许多学者致力于这类药物的开发研究，特别是近十余年得到了迅速的发展。20世纪70年代中期，上市了第二代喹诺酮类药物，如吡哌酸等。20世纪80年代初开始了第三代氟喹诺酮类的研究，至今已开发和正在开发的有五十多种，目前临床应用的有诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氧氟沙星、司帕沙星与氟罗沙星等。这些药物的抗菌作用与疗