微生物染色镜检法

1、微生物染色镜检法

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微生物细胞含水量一般为80〜90%,菌细胞对光的吸收和反

射与水相近，在光学显微镜下菌体透明，与背景几无反差，故常

借助于染色使菌体吸着染料产生与背景较明显的差别，从而识别

其个体形态和部分结构。

1、1常用染色法

细菌染色分为单染色法和复染色法，前者仅用一种染料，只

能观察形态和排列，后者可鉴别细菌及某些特殊结构。

1、1、1单染色法

1、1、1、1染液：吕氏亚甲蓝染液或稀释石炭酸复红液。

1、1、1、2方法：

操作过程为：涂片一干燥一固定一染色一水洗一干燥一镜

检。

a、涂片：取清洁无油的载玻片一块，在玻片中央滴一滴无

菌水或无菌生理盐水（如用菌液，则不必加水）。以接种环挑取

菌落或待检物，与水充分混匀制成薄涂片（约lcn?的薄层），切

勿浓厚。若是液体待检物挑取2〜3环直接涂抹即可。如同时在

一张载玻片上制作多个涂抹时，可在玻片反面用记号笔划格编

号，在每一小格内各制作一涂抹，接种环用毕应立即在火焰上灭

菌。

b、干燥：在室温中自然风干，或置37c培养箱内待干。

c、固定：除作荚膜和鞭毛染色外，均可用火焰固定，迅速

杀死菌体，并使菌体固定在玻片上。即将标本的一面朝上，迅

速通过火焰2〜3次，使其受热固定。受热温度不可过高，以手

触及玻片背面，以不烫手为宜，温度过高，影响染色效果。有的

不能用加热固定，可改用固定液固定。

d、染色：用吕氏亚甲蓝染液（或稀释石炭酸复红染液）1〜

2滴，覆盖涂抹，染1〜2分钟，倾去染液。

e、水洗：斜置玻片用很细水流的自来水自染色标本的上端

流下，勿使水流直接冲刷在涂片处，直至洗下的水呈无色为止。

f、干燥：已染色好的片子，自然风干或用吸水纸轻轻印在

涂片处将水吸干。

g、镜检：置显微镜下，先用低倍镜找准目标，于涂抹处滴

加香柏油一滴，用油镜检查。

1、1、2革兰染色法：

革兰染色法是一种极有价值的分类染色法，通过染色，可将

全部细菌分成两大类一革兰阳性菌和革兰氏阴性菌。关于染色的

机制，与细胞壁的结构与组成密切相关。革兰氏阳性菌的细胞壁

中肽聚糖含量最高（30%〜60%）,脂含量低（1%〜4%）,经乙醇或

丙酮处理后脱水，可引起肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，以

至甲紫与碘的复合物可保留在菌体内，不被脱去而显蓝紫色。革

兰氏阴性菌的细胞壁中脂类物质含量较高（11%〜22%）,肽聚糖

含量低（约10%）,用乙醇或丙酮处理时，脂类物质被溶解，使

细胞壁的通透性增大，以至结晶紫与碘的复合物脱出细胞外，故

可被沙黄复染液着色而显红色。

1、1、2、1染液：

a、甲紫染液：取结晶紫2.0g,溶解于20ml95%乙醇中；再

取草酸镂0.8g,溶解于80ml蒸储水中；两液混合静置48h后使

用。此染液较稳定，在密闭的棕色瓶内可储存数月。

b、革兰碘液：取碘化钾2g,以5〜10ml蒸播水充分溶解

后，加碘1g,待完全溶解后，加水至300mL此染液较稳定，在

密闭的棕色瓶内可储存数月。

c、脱色液：95%乙醇、或95%乙醇7份与丙酮3份混合液。

d、番红复染液：0.25%番红（沙黄）乙醇液。

取番红（沙黄）0.25g,溶于10ml95%乙醇中，待完全溶解

后，再加蒸储水稀释至100ml。

1、1、2、2方法：

操作过程：涂片一干燥一固定一结晶紫染色一水洗一碘液媒

染一水洗一吸干一95%乙醇脱色一水洗一吸干一番红复染一水

洗一干燥一镜检。

a、涂片：操作同单染色法。

b、干燥：操作同单染色法。

c、固定：操作同单染色法。

d、甲紫染色：将甲紫染液滴加在已固定的涂片上，覆盖涂

抹，染Imin。

e、水洗：斜置玻片，用很细水流的自来水，自染色标本的

上端流下，勿使水流直接冲刷到涂抹处，直至流下的水呈无色为

止。

f、碘液媒染：滴加革兰碘液作用Imino

g、水洗、吸干：水洗同上，沥干。

h、脱色：滴加95%乙醇（或95%乙醇与丙酮混合液）脱色,

侧动玻片，至无紫色脱落为止（约20〜30秒）。

i、水洗：同单染色法。

j、吸干：沥干、或用吸水纸轻轻印在涂抹处，将水吸干。

k、番红复染：滴加番红染液复染30s〜Imin。

1、水洗：操作同单染色法。

m、干燥：操作同单染色法。

n、镜检：操作同单染色法。

1、1、2、3注意事项：

a、待检菌菌龄应为18h〜24h。一般情况下，革兰氏阴性菌

的染色反应较稳定，不易受菌龄长短影响；而革兰氏阳性菌，有

的在幼龄时呈阳性，超过24h可变为阴性。故培养物越陈旧，菌

细胞衰老、死亡，则染色常为阴性，造成错判。

b、涂片以匀薄为佳，切不可浓厚。过于密集的菌体，因洗

脱不匀常呈假阳性。镜检革兰染色反应时，要以分散开的细菌着

色为准。涂片后不宜用火焰烤干，宜自然干燥；若经火焰固定时,

应以温热不烫手为宜，以免菌体受损，致使染色反应应不准。

c、革兰染色操作的关键步骤是脱色的掌握，脱色时间不足,

革兰氏阴性菌可染成阳性菌；脱色过度，革兰氏阳性菌可染成阴

性菌。故应注意掌握，以无紫色脱出时立即水洗。脱色时间按涂

抹厚薄、涂片含水量多少适当掌握。涂抹厚，涂片含水少

（水洗后沥干水分）时，脱色时间稍长；涂抹薄，涂片含水量多

时，脱色时间稍短，在20〜30s内调整。

d、碘液配制后，应装在密闭的棕色瓶内储存，如因储存不

当，部分碘将被挥发或被还原，试液由原来的红棕色变为淡黄色,

以至影响甲紫的作用，故不宜再用。

e、革兰染色能否获得满意的结果，与操作者的经验有很大

的关系。操作没有把握或对染液有怀疑时，应以对照菌同时染色。

方法是在一张载玻片上分三段涂片，中段作待检菌涂片，一端作

革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌涂片，另一端作革兰氏阴性菌大肠

埃希氏杆菌涂片，同一染色步骤，染色后镜检。如对照菌染色反

应准确，则待检菌的染色反应准确。

1、1、2、4革兰染色的结果

通过革兰染色，可将细菌分为两大类：革兰氏阳性菌，镜检

菌体呈蓝紫色；革兰氏阴性菌，镜检菌体为红色。此外，也可以

观察细菌的个体形状、大小、芽抱的有无（芽抱囊呈蓝色或红色,

芽抱囊内的芽抱为无色透明的空白部分，游离的芽抱可着上蓝紫

色或红色的圈）以及芽抱形状、大小、着生的位置等。

2、微生物的生化试验

部门：质保部题目：微4二物的生化试验共13页

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2、1概述

微生物在代谢过程中，由于各自独特的酶系统，其分解与合

成代谢的产物各不相同。这些代谢产物各具不同的生化性质利用

生物化学的方法测定这些代谢产物、代谢方式、条件等来鉴定细

菌的类别、属种、称为生化试验。

2、1、1范围：药品微生物学检验细菌鉴定的生化试验，包

括：糖代谢试验；氨基酸和蛋白质代谢试验；氨源与碳源的利用

试验；酶试验；其他试验。

2、1、2方法：目前在药品微生物学检验中，广泛应用的主

要仍是常规方法。这些方法，大体归纳为如下儿种类型。

2、1、2、1在培养基中加入某种底物与指示剂，经接种，

培养后观察培养的PH值变化。例：各种糖、醇发酵试验、甲基

红试验和尿素酶试验。

2、1、2、2在培养物（或培养基）中加入试剂，观察它们

同细菌代谢产物所生成的颜色反应。例如乙酰甲基甲醇生成（V

-P）试验、靛基质试验。

2、1、2、3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在，例氧

化酶试验和血浆凝固酶试验。

2、1、2、4根据细菌对理化条件和药品试剂的敏感性，观

察细菌的生长情况，如氟化钾试验，温度生长试验。

2、1、3生化试验注意事项

2、1、3、1待检菌应是纯种培养物，纯培养物系单一菌细

胞繁殖的后代，因此待检菌必须是取自经过分离，纯化的培养物。

否则，所观察的生化反应可能是两种或多种菌的混合反应，造成

试验紊乱，无法得出正确的鉴定结果。因此，当生化试验结果紊

乱时，应重新分离，纯化菌株后，再做试验。

2、1、3、2待检菌应是新鲜培养物：生化试验的待检菌，

最好采用18-24hrs的新鲜培养物，此时细菌群体细胞的生理特

征比较一致。培养时间过长或陈旧的培养物，细胞衰退，生理特

征也会发生改变。常可影响鉴定结果的准确性。

2、1、3、3严格遵守观察反应的时间：观察生化反应结果

的时间，应根据试验项目的要求确定并严格遵守。药品微生物检

验方法中规定的生化试验观察结果的时间，多为24或48hrs,这

是根据一般实际情况确定的，时间过短或过长，不能观察到正确

结果。观察试验反应结果，往往需加入试剂，加入试剂的时间也

应根据各试验的具体要求，注意掌握，不适时地（反应物尚未出

现或者消失）加入试剂，就不会得出正确的结果。但反应物出现

的时间常受到许多条件的影响（如培养基原料、制备方法、接种

量等），加入试剂的时间很难强求一致，因而必须按照各试验的

规定要求，适时加入。

2、1、3、4应做必要的对照试验：培养基，试剂和试验方

法等，可直接影响试验结果。故每批培养基配成后，均应以阳性

及阴性菌株测试，符合要求时，方可用于正式试验。对一些反应

不够确定，或影响因素甚多的试验，须在每次试验的同时，

做阳性和阴性菌株对照试验。

2、1、3、5注意提高阳性检出率：为了提高检出率，至少

应以2—3个待检的疑似菌落，分别进行试验。菌落挑取数愈多,

阳性检出率相对愈高。

2、2常用的生化试验方法

2、2、1糖（醇）代谢试验

2、2、1、1甲基红试验（M）

肠杆菌科细菌均可发酵葡萄糖，在磷酸盐葡萄糖蛋白陈水培

养基中，经培养过夜后，均可发酵产生酸性代谢产物使培养基

PH下降，故最初均可使甲基红试剂变色而呈现阳性反应，但继

续培养后，不同种属的肠道菌便会出现不同的情况：甲基红试验

阳性菌产生更多的酸，并克服培养基中磷酸盐的缓冲作用，使培

养液的PH值下降至4.5或更低，而甲基红试验阴性菌则进一步

代谢，使发酵产物通过脱竣作用产生中性乙酰甲基甲醇，结果使

培养液最终PH回升至接近中性（PH5.4以上）。大肠埃希氏杆菌

及其他甲基红试验阳性菌在试验中产生大量的酸：乳酸、琥珀酸、

醋酸和甲酸，保持高氢离子浓度，故甲基红试验为阳性反应。产

气杆菌等菌也产酸，由于中性乙酰甲基甲醇形成，故生成的酸类

较少，甲基红试验为阴性反应。

A、试剂：甲基红指示剂。

B、培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白陈水培养基。

C、方法：取待检菌的新鲜纯培养物，接种于磷酸盐葡萄糖

蛋白陈水培养基中，于37℃培养2—5天，48hrs取出部分培养

液，按每ml培养液加指示剂一滴的量加入甲基红指示剂，立即

观察结果，呈红色或桔红色，为阳性反应；呈桔黄色或黄色为阴

性反应，若为阴性反应，余下的培养液应继续培养至5天，再加

指示剂测定。

D、注意事项：

a、培养时间应不少于48hrs,过早地滴加指示剂，常不能得

出正确结果。

b、培养基中蛋白陈可影响试验结果。对配就的培养基，应

用甲基红阳性菌利阴性菌做对照试验。

C、加入甲基红指示剂后，应立即观察结果，放置过久，红

色会消退。

2、2、1、2乙酰甲基甲醇生成试验（V—P试验）

细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，某些细菌可使丙酮酸脱竣形成

乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中，乙酰甲基甲醇可被空气中的氧气

氧化成二乙酰（丁二酮）。二乙酰再与蛋白豚中精氨酸的股基作

用，生成红色化合物。在培养基或试剂中加入精氨酸或肌酸，肌

酊可增加股基含量，试验中加入a蔡酚是作催化剂，使反应的颜

色增强，提高反应的敏感性。

A、培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白陈水培养基

B、试剂：

6%a—蔡酚乙醇溶液，40%氢氧化钾（或40%氢氧化钠）

C、方法：取待检菌的新鲜培养物，接种于磷酸盐葡萄糖蛋

白陈水培养基中，于36℃培养48hrs,于每2nli培养液中加入

a一蔡酚乙醇试液1ml,混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml充

分摇摇，在4小时内出现红色为阳性，黄色（与试剂颜色相同）

或出现类似铜色为阴性反应。

D、注意事项：

a、阳性反应必须在与空气充分接触的情况下完成。故加入

试剂后必须充分振摇，方可促使反应出现。

b、加入试剂的须序不能颠倒，须首先加入a—茶酚试液再

加入氢氧化钾试液，否则，可能产生假阴性或弱阳性反应，加入

40%氢氧化钾液量要准确，不可多加，否则，它可能与a—蔡酚

反应出现铜色，不易与弱阳性反应区分。

C、一般情况下，本试验与甲基红试验呈相反结果，VP阳性

菌，甲基红试验为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌有的并无此

规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌，常VP试验和甲基红

试验同时为阳性。

2、2、1、3MUG葡萄糖醛酸甘酶试验：

细菌的葡萄糖醛酸甘酶在碱性条件下，作用于-4一甲基伞形

酮一B-D葡萄糖醛甘（MUG）的B葡萄糖醛酸甘键，使其水解,

释放的4一甲基伞形酮在365nm紫外线灯下产生蓝白色荧光。

97%的大肠埃希氏杆菌，10%的沙门菌以及少量的志贺菌具有葡

萄糖醛酸甘酶。中国药品生物制品检定所组织测试不同来源的

591株大肠埃希氏杆菌，MUG阳性率为94.7%。

A、培养基：MUG培养基。

B、方法：取待检菌的固体培养物，或胆盐乳糖增菌液或营

养肉汤培养液0.2mL接种至MUG培养基中，置36±1℃培养5

—24hrs,分别于5小时■与24小时时，将培养管置365nm紫外灯

下约5cm处，以未接种培养物的MUG培养基管作空白对照，观

察有无蓝白色荧光。空白对照管应无蓝白色荧光，试验管出现蓝

白色荧光为阳性反应，反之为阴性。然后加数滴靛基质试液于

MUG管内，液面呈玫瑰红色为靛基质试验阳性，呈试剂本色为

靛基质试验阴性。

C、注意事项：

a、试验用试管和培养基应事先检测，在365nm上紫外灯下

无荧光产生者，方可使用。

b、本试验与靛基质试验可同时测定，即观察荧光后再加入

靛基质试液观察靛基质反应，若皆为阳性反应即可判定待检菌为

大肠杆埃希氏杆菌。

2、2、2氨基酸和蛋白质代谢试验。

2、2、2、1靛基质试验（I）

含有色氨酸酶的细菌，能分解蛋白陈中的色氨酸形成靛基质

（口引喙）。靛基质无色，当加入对二甲氨基苯甲醛试剂后，形成

可见的红紫色醍式化合物，即玫瑰靛基质。本试验常用于肠杆菌

种属鉴别，大肠埃希氏杆菌98%为阳性反应，产气克霉伯菌，沙

门菌为阴性反应。

A、试剂：靛基质试液（柯凡克试剂）

B、培养基：胰蛋白陈水培养基

C、方法：取待检菌新鲜纯培养物，接种至胰蛋白陈水培

养基中，于36℃培养24—48hrs,沿管壁加入靛基质试液数滴，

液面呈玫瑰红色为阳性反应，无红色为阴性反应。

D、注意事项：

a、所用蛋白陈应含有丰富的色氨酸。胰蛋白陈中色氨酸含

量较高，故宜选用。

b、靛基质试液应密闭于棕色瓶中，冰箱保存。放置过久颜

色变深，不宜适用。试剂的质量，应以已知阳性及阴性菌测试。

c、色氨酸酶活性的最适PH为7.4〜7.8,PH降低，靛基质产

生减少，可能出现假阴性或弱阳性反应，故培养基应为7.4〜7.6。

不宜用含葡萄糖的培养基进行试验，因产生靛基质的细菌都能发

酵糖类，致使培养基酸度增加。

d、为加强颜色反应，可于培养液中加1ml乙醛或二甲苯，

摇匀，使靛基质提取至其中，待乙酸（或二甲苯）浮至液面，再

加入靛基质试液。

e、在培养24hrs观察结果时，宜先取出2ml培养液谪加靛

基质试液观察，若为阴性再继续养至48hrs再检查。

2、2、2、2明胶液化试验：

明胶是一种胶原蛋白，不具有•般蛋白质加热凝固的特性，

其水溶液在24c以下为凝固状态。明胶可被细菌的胶原酶（蛋

白分解酶）分解为氨基酸，分解后的明胶，凝固力降低。低于

20℃时不再凝固，呈液化状态。

本试验为细菌鉴定的常规试验法。铜绿假单胞菌、荧光假单

胞菌，腐败假单胞菌等为阳性反应，肠杆菌科细菌很少液化明胶

（阴性）。

A、培养基：明胶培养基

B、方法：用接种针取待检菌纯培养物，穿刺接种于明胶培

养管内，于36℃培养24hrs,取出置冰箱内10〜30分钟，观察结

果，如明胶呈液体状态为阳性反应，呈凝固状态为阴性反应。

C、注意事项

a、明胶的质量与用量试验影响很大，以能在20c时凝固成

稳定胶冻者为佳，培养基试验时，应分别用阳性菌株对照。

b、明胶在20℃以下时为固体，而在35℃以上时为液体，故

经培养后判断结果，必须先放在冰箱内冷却一段时间。观察结果

时，当培养基还处于温热状态时，切勿摇动，否则培养基表层的

液化现象，可被其与培养基混合而被掩盖，造成假阴性。

2、2、3碳源和氮源利用试验

2、2、3、1枸椽酸盐利用试验（C）：

枸椽酸盐培养基是合成培养基，不含蛋白豚和糖类，枸椽酸

钠是唯一碳源，磷酸二氢铁为无机镂盐。能利用枸椽酸盐作为碳

源的细菌，同样也能利用镂盐作为唯一氮源，可在枸椽酸盐培养

基上生长，枸椽酸钠被分解成碳酸钠与水，使培养基PH值升高,

漠麝香草酚蓝指示剂显蓝色。

本试验主要用于肠杆菌科细菌鉴定。埃希氏菌属，志贺菌属,

爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常

为阳性、枸椽酸杆菌利某些变形杆菌阳性。止匕外，铜绿假单胞菌,

洋葱假单胞菌和嗜水气单胞菌亦为阳性。

A、培养基：枸椽酸盐培养基。

B、方法：取待检菌的新鲜纯培养物，接种于枸椽酸盐培养

基上，于36℃培养48〜72小时，培养基斜面有菌落生长，培养

基由绿色变为蓝时为阳性反应，无菌落生长，斜面仍为绿色为阴

性反应。

C、注意事项

a、为防止其他培养基成分混入本培养基中导致假阳性，应

注意在制备培养基前，将琼脂用流水冲洗3天，再用蒸储水洗净

烘干备用；在接种时宜将培养物制成生理盐水悬液接种；用同一

培养物接种一组生化管时，宜先接种本培养基，接种其他培养基

后一定要用火焰灭菌接种环，再接种本培养基。

b、制备培养基时，应调整PH至规定值，若PH偏高，则与

阳性反应结果混淆而不易判断。

c、接种量应适当，过少可发生假阴性，接种量过量时可导

致假阳性。

2、2、4酶类试验

2、2、4、1氧化酶试验：氧化酶或称细胞色素氧化酶，是

细胞色素呼吸酶系统的终端呼吸酶，能直接利用氧分子作为受氢

体，将底物上脱下来的氢与氧结合成水。作氧化酶试验时，此酶

并不直接与氧化酶试剂反应，而是首先使细胞色素C氧化，然后

此氧化型细胞色素C再使对苯二胺试剂氧化，使之成为红色到暗

紫色的醍式化合物，原法采用四甲基对苯二胺。

本试验主要用于奈瑟球菌属鉴别，区别假单胞菌科与氧化

酶阴性的肠杆菌科细菌。

A、试剂：1%;盐酸二甲基对苯二胺溶液。

B、方法：取洁净的滤纸块置平皿内，用细玻璃或细木棍挑

取新鲜待检菌的菌苔或菌落少许，涂于滤纸上，滴加1%盐酸二

甲基对苯二胺试液一滴（或先滴加试剂再涂菌苔），菌苔立即呈

现玫瑰红色，继而变深，并于30秒内呈现深蓝色为阳性反应，

不变色为阴性反应。

C、注意事项

a、有时菌苔（落）本身显红色，不易观察反应，可再滴加

l%a一蔡酚乙醇溶液1—2滴，如出现蓝色，即可判断阳性，出

现变色的时间要求与上述方法相同。

b、含葡萄糖培养基的菌落，不宜做氧化酶试验，因葡萄糖

发酵可抑制氧化酶的活性，造成假阴性反应。

c、待检菌应避免同铁、锲等金属接触，故不宜用银信合金

丝制成的接种环（针）挑取菌苔（落）。

d、试验菌落须新鲜，陈旧者反应不可靠。

e、试剂宜新鲜配制，并储存于密闭玻塞瓶中，如颜色变成

红褐色，不可使用。

f、反应需在有氧条件下进行，勿将试剂滴加过多，以免妨

碍菌苔与空气接触，造成假阴性。

g、二甲基对苯二胺盐酸盐亦称对氨基二甲基苯胺盐酸盐购

买时须注意。四甲基对苯二胺盐酸盐比二甲基对苯二胺盐酸盐更

为敏感，但价格昂贵且不稳定，二甲基对苯二胺盐酸试剂不论是

粉剂还是溶液，均很稳定，可用于本试验。

2、2、4、2硝酸盐还原产气试验

有些细菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，并将亚硝酸盐进一

步分解为氮气，观察有无产气现象即为硝酸盐还原产气试验。本

试验常用于鉴别铜绿假单胞菌和其他假单胞菌，前者为阳性反

应。

a、培养基：硝酸盐陈水培养基。

b、方法：取待检菌的新鲜纯培养物，接种至硝酸盐陈水培

养基内，置36℃培养24hrs观察结果。在培养基的小倒管内有气

泡产生者，为阳性反应；无气泡产生者为阴性反应。

c、注意事项：本试验用培养基中加有亚硝酸盐，并放置小

倒管专为观察产气反应，与鉴定一般细菌用的硝酸盐还原试验培

养基不同，切勿混用。

2、2、4、3血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶是一种能使血浆凝固的酶类物质。致病性葡萄球

菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着

于细菌表面，形成凝块。葡萄球菌产生的凝固酶有两种，一种是

与细胞壁结合的结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，

使发生沉淀，可用玻片法测出；另一种是由菌体生成释放于培养

基中，叫做游离凝固酶，它能使血浆中凝固酶反应因子（CRF）

形成类似凝血酶的物质，间接地使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，

可由试管测出。

A、试剂：血浆

血浆制备:先将采血用注射器及针头，含5%枸椽酸钠的0.9%

氯化钠溶液灭菌后备用。以无菌手续自家兔心脏采血9ml,迅速

加至装有含5%枸椽酸钠的0.9%氯化钠溶液1ml的灭菌离心管

内，充分混合数分钟后，以1500转/分离心15min分离血浆用

灭菌吸管取血浆移至灭菌试管中，置冰箱中备用。

注意：取血后应及时分离血浆，已出现凝块的血液，或发现

有纤维蛋白析出的血浆不可使用。制备好的血浆应以阳性菌株测

试，并作空白对照，合格者方能使用。人血浆亦可采用。

B、方法：

a、玻片法（结合凝固酶）：取洁净的载玻片一张，在玻片两

端分别滴上灭菌生理盐水和未经稀释的血浆各一滴。取待检菌

18-24hrs肉汤培养液或琼脂培养物一接种环，加至生理盐水中，

制成浓菌悬液，再取此菌悬液一环，与血浆混合均匀，观察结果。

在5min内混菌的血浆出现团块或颗粒状凝块，而在盐水中呈均

匀混浊时，即为阳性反应。在血浆中呈均匀混浊时，则为阴性反

应。同时做阳性菌利阴性菌对照试验。

b、试管法（游离固酶）：取灭菌小试管3支，各加血浆一无

菌水（1：1）0.5ml,其中一支加入待检菌生理盐水悬液或肉汤

培养液0.5ml为试验管；另一支加阳性对照菌生理盐水悬液或营

养肉汤培养0.5ml作阳性对照管；再一支加生理盐水或营养肉汤

培养基0.5ml作阴性对照管，三管同时放36℃培养箱中培养3小

时后，每隔Ihrs观察一次结果，观察时不要振动或摇动试管，

轻轻将试管倾斜至横放，检查各管是否凝固或有凝块，阴性对照

管应无凝固或凝块，阳性对照管应凝固或有凝块，试验管出现凝

块或明显的纤维蛋白状物为阳性，其中凝块遍及整个试管为强阳

性，若4hrs时无凝块或凝固现象，应继续培养至24hrs再行检查,

若无凝固或凝块判为阴性反应。若阳性对照管无凝固或凝块现

象，或阴性对照管出现凝固或凝块，表明血浆不可靠，试验结果

无效，应重新制备血浆，再进行试验。

C、注意事项

a、试管法和玻片法的结果可能不一致，玻片法仅是•个初

步检验方法，其阴性或可疑结果都必须做试管法来确定。

b、玻片法试验时，待检菌悬液以较浓者为宜，否则易出现

假阴性。

c、试验时，待检菌应取自普通琼脂或血琼脂，含选择性抑

菌剂的培养基易使葡萄球菌发生变异。

d、有些金黄色葡萄球菌菌株能产生大量纤维蛋白溶酶，使

出现的凝块溶解，造成假阴性。故须每隔Ihrs观察一次结果特

别是在接种后的前数小时。

e、待检菌的培养物必须新鲜，陈旧的培养物（超过24hrs）

或生长不良的细菌，凝固酶活性低，可能测不出。

2、2、4、4绿脓菌素试验

铜绿假单胞菌能产生一种绿色的水溶性色素，这种色素能扩

散到培养基中，使培养基呈现绿色，并根据其溶解于氯仿而被提

取，遇酸呈红色的特性得到证明。本试验对鉴别铜绿假单胞菌与

其他假单胞菌具有重要价值，铜绿假单胞菌以绿脓菌素为其特征

反应，而其他细菌无。

A、培养基：绿脓菌素测定用培养基。

B、试剂：氯仿，盐酸(lmol/L)

C、方法：取待检菌营养琼脂新鲜培养物，接种在绿脓菌素

用琼脂斜面上，置36℃培养24小时，若出现绿色，在试管内加

氯仿3-5ml搅拌充分振摇，使培养物中的色素提取在氯仿液中，

待氯仿提取液呈蓝绿色时，用毛细吸管将其转至另一试管中，并

在该液中加盐酸约1ml振摇后静置片刻，上层盐酸液中呈现粉红

色，即为阳性反应，无粉红色出现阴性反应。

D、注意事项

a、绿脓菌素为铜绿假单胞菌特征性产物，但亦有不产生绿

脓菌素者，故不能以本试验阴性作为否定铜绿假单胞菌的唯--依

据。

b、绿脓菌素的产生除菌株差异外，与培养基成分密切相关,

如蛋白豚、琼脂及化学试剂，其品牌需事先经测试后选用。

2、2、4、541℃生长试验

细菌在一定的温度范围内才能进行其生命活动，不同种属的

细菌，其生长温度不尽相同，假单胞菌属中的一些种，如铜绿假

单胞菌、产碱假单胞菌、类鼻疽假单胞菌等能在41℃生长，而

荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌等其他假单胞菌属细菌则不能生

长。设定41c温度进行培养，便可将他们区别开来。

A、培养基：营养肉汤或营养琼脂斜面。

B、方法：取待检菌营养琼脂培养物一接种环，接种于营养

琼脂斜面，立即置于事先已调控至41c水浴中培养24—48hrs,

观察斜面有无菌苔生长，生长者为阳性反应；未生长者为阴性

反应。

C、注意事项

a、所用温度计应事前标定。

b、接种后立即置于41℃水浴箱中，水浴箱液面应浸没整个

斜面的试管部分。水浴能在最短时间内使培养基与水温平衡，较

之电热培养箱为好，特别在冬季。

3、微生物限度检查法

部门：质保部题目：微4E物限度检查法共33页

编号：Q/Cr-JS1403—2012新订：替代：V起草：

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部门审阅：QA审阅：批准：执行日期：

日期：日期：日期：

颁发部门：分发部门：质保部、中心化验室颁发份数：份

微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微

生物污染程度的一种检查方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、

酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度C级背景下的A级单向流

空气区域进行。

供试品应随机抽样，如遇异常或可疑的样品，必须取有疑义

的样品，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3

倍量，供试品在检验前不能开启，在检查前及检查中应防止供试

品污染菌受损、致死或繁殖。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶

口周围）外观看出发霉、变质的药品，可直接判为不合格，无需

再抽样检查。

检查的全过程均应严格遵守无菌操作，严防再污染。

除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30〜

35℃,霉菌、酵母菌培养温度为23〜28℃。细菌、霉菌（酵母

菌）计数和控制菌检查，均应做对照试验。

检验结果的报告以lg、1ml、10g、10ml或lOcn?为单位报

告，特殊品种可以最小包装单位报告。

3、1供试品的检验量

每批供试品检验量一般为10g或10ml,且均须取自2个以

上的包装单位。

3、2供试品的取样

3、2、1散剂

3、2、1、1取两袋以上包装，拭擦外表并经紫外线照射后,

转入无菌室。

3、2、1、2在开袋前，将各包装颠倒混合，使内部药物混

匀。

3、2、1、3用碘酊及75%乙醇擦拭各袋开口处。

3、2、1、4剪开袋口，从各袋中取出部分样品，置无菌称

量纸上，称取10g作为供试品。

3、2、2软膏剂、凝胶剂

3、2、2、1取两支以上供试品包装单位，擦试外表并经紫

外线灯照射后，转入无菌室。

3、2、2、2用碘酊及75%乙醇消毒管口区域外表。

3、2、2、3用无菌剪刀剪除封口。

3、2、2、4将管内药物挤出适宜灭菌的容器内，另将软管

置天平盘上先行称量再用减量法计量，亦可将容器置天平盘上除

重后再称量，称取10g供试品。

3、2、3洗剂

3、2、3、1取两瓶（袋）以上供试品包装单位，擦试外表

并经紫外线灯照射后，转入无菌室。

3、2、3、2用碘酊及75%乙醇消毒瓶口区域外表。

3、2、3、3用无菌剪刀剪除封口。

3、2、3、4将瓶（袋）内药物挤出适宜置灭菌的容器内，

用增量法称取10g供试品。

3、2、4栓剂

3、2、4、1取20颗以上供试品包装单位，擦试外表并经紫

外线灯照射后，转入无菌室。

3、2、4、2用碘酊及75%乙醇消毒瓶口区域外表。

3、2、4、3用无菌剪刀剪除封口。

3、2、4、4将泡罩内药物挤出适宜置灭菌的容器内，用增

量法称取10g供试品。

3、2、5原辅料

原辅料与制剂不同，数量多，包装大，应参照有关规定抽样。

大包装原辅料按件计量，不以批量计，检验量仍按10g或10ml

取量。

在抽取样品时，应保证抽样供试品及大包装原辅料样品不受

污染。无菌原料须在严格的无菌条件（无菌抽样间）下取样，所

用器具须经灭菌并须无菌操作。

3、3稀释剂

各剂型及原辅料的供试样品，一般均需用稀释剂处理后作为

供试液。常用稀释剂有：

3、3、10.9%无菌氯化钠溶液：

配制：称取氯化钠9g溶于1000ml蒸储水中，分装每瓶

300〜400ml,于121c高压蒸汽灭菌20min,备用。

3、3、2PH6..8无菌磷酸盐缓冲液

配制：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250mL加0.2mol/L的氢

氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml,摇匀，过滤，分装，灭菌。

3、3、3PH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液

配制：称取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠

4.30g、蛋白月东1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,分装，灭菌。

3、4供试液的制备

按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成

供试液。

3、4、1散剂供试品（足光散）供试液的制备。

以无菌操作称取样品10g,直接置于含玻璃珠若干粒的

250〜300ml灭菌锥形瓶中，加稀释剂100ml,充分振摇均匀，必

要时借助保温（不超过45℃）助溶。

3、4、2软膏剂、凝胶剂供试品供试液的制备

本公司软膏剂、凝胶剂，其基质均是水溶性的，能与稀释剂

均匀混合，以无菌操作取样10g,置于含玻璃珠若干粒的250-

300ml锥形瓶中，加稀释剂100ml,充分摇匀即可。

3、4、3洗剂供试品（复方酮康晚发用洗剂）供试液的制备

以无菌操作取样10g,置于含玻璃珠若干粒的250-300ml

锥形瓶中，加稀释剂100ml,充分摇匀即可。

3、4、4栓剂供试品供试液的制备

称取供试品10g,置灭菌锥形瓶中，加适量PH7.0无菌氯化

钠-蛋白豚缓冲液,置45c水浴保温10分钟，使溶，加入无菌聚山

梨酯805〜8m1,振摇使之乳化，再加pH7.0无菌氯化钠-蛋白豚

缓冲液（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀。

3、5细菌数的测定

3、5、1平皿菌落计数法

3、5、1、1设备、仪器、器皿及用具。

a、设备

净化工作台，恒温培养箱（30—35℃）,恒温水浴，电热干

燥箱（250-300℃）,电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器。

b、仪器、器皿

显微镜（1500X）、电子天平或药物天平（感量0.1g）.酸

度计。

锥形瓶（250-300ml,或内装玻璃珠若干），研钵（陶瓷制

直径10-12cm）、培养皿（9cm）、量筒（100ml）、试管（18mmX18m量

及塞、吸管（1ml分度O.OKlOml分度0.1）、注射器（20或30ml）、

注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃或搪瓷消毒缸（带盖）。

玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管上端距

0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，装入吸管筒内或牛皮

纸口袋中。锥形瓶、量筒、试管均加棉塞或硅氟料塞，若用振荡

器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污

染瓶塞），再用牛皮纸包扎。玻璃器皿均于160C干热灭菌2hrs

或高压蒸汽灭菌121℃20min、烘干备用。

c、用具

大、小橡皮乳头(置干净带盖的容器中并应定期用5%来苏

溶液浸泡)；无菌衣、帽、口罩.、手套(洗净后，配套，用牛皮

纸包严)灭菌，备用。

接种环、酒精灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌镶

子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号

笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖(12cm)、实验记录纸。

3、5、1、2培养基、稀释剂。

培养基：营养琼脂培养基。

稀释剂：ph7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液。

3、5、1、3操作步骤

a、试验前的准备包装

(1)将所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管

(1ml、10ml)、量筒，稀释剂及供试品等移至无菌室内。每次试

验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作

间，将全部外包装(牛皮纸)去掉，编号。

(2)开启紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30mino

操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换

工作鞋。再用0.1%苯扎澳镀消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴

无菌衣，帽、口罩、手套。

(3)操作前先用乙醇棉擦手，再用碘伏棉球或乙醇棉球擦试

供试品瓶、管、袋等开口处周围。待干后用灭菌的手术剪刀将供

试品瓶、管、袋启封、启封后先检查瓶盖内侧及管口周围有无生

霉、长螭的迹象，对肉眼可见疑似者，用放大镜或显微镜观察，

若经证实为生霉、长螭即可判断为不合格，无须继续检验。

b＞操作

(1)供试品取样见“3、2”。

(2)供试液的制备见“3、4”。

(3)供试液的稀释(10倍递增稀释法)。

取3—4支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂。另取1ml

灭菌吸管吸取1：10均匀供试液1ml加入装有9ml灭菌稀释剂的

试管中，混匀即成1：100供试液。以此类推，根据供试品污染

程度可稀释至1：1()3、或1：10\一般取1：]0、1：1()2、[：

1()3三级稀释液检验。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。

(4)注平皿：

在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管吸取每级稀

释液各1ml置每个灭菌平皿中，每稀释级注2〜3个平皿。另取1

支1ml吸管吸取稀释剂各1ml注入2个平皿中，作为阴性对照。

(5)倾注培养基：

将预先配制好的培养基(营养琼脂)熔化，冷至约45℃时,

倾注上述各个平皿约15ml,以顺时针或反时针方向快速转动平

皿(勿使培养基溢出)，使供试液与培养基混匀，放置，待凝。

(6)培养：将已凝固的平板倒置于30〜35c培养箱中，培养

3天。

(7)菌落计数：

将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼用标记

笔点计，以透视光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时借助

于放大镜、菌落计数器和显微镜观察。

细菌菌落形态特征：常为白色、灰白色或灰色、亦有淡褐色、

淡黄色(如培养基中加入0.1%TTC试剂，菌落为红色)。

菌落边缘整齐或不整齐。有放射状、树枝状、锯齿状、卷

发状。菌落表面有光滑、粗糙、皱折、突起或扁平。

菌落大小差别很大，同一平板上可出现针尖大小至大于

10mm菌落。外观多样，小而突起或大而扁平，或云雾状，不规

则。

c、菌落数报告的规则

细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平

均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告(取两位有效数

字)的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、

1ml或lOcn?供试品中所含的菌数。

如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有

菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的

值报告菌数。

3、5、2薄膜过滤法

3、5、2、1采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um,

直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应

的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的

充分被截留o滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,

应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量

的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用

前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品

溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要

用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml.。总冲洗量不

得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

3、5、2、2取相当于每张滤膜含1g、1ml或lOcn?供试品

的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g、

1ml或10cm之所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml

进行试验。用Ph7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液或其它适宜的冲

洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证:冲洗

后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养

基或酵母浸出粉豚葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至

少制备一张滤膜。

3、5、2、3阴性对照试验取试验用的稀释液1ml,照上

述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

3、5、2、4培养和计数培养条件和计数方法同平皿法,

每片滤膜上的菌落数应不超过100个。

3^5、2^5菌落报告规则以相当于1g、1ml或lOcm?

供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以VI报告菌

数（每张滤膜过滤lg、1ml或10cn?供试品），或＜1乘以稀释

倍数的值报告菌数。

附：培养基稀释法：

取低稀释供试液（原液或1：10供试液）2份，每份各1ml,

分别注入5个或5个以平皿中（每皿0.2ml或V0.2ml）,每个平

皿倾注营养琼脂约15mL混匀，凝固后，倒置，30〜35C,培养

72hrso

5个或5个以上的平板点计的菌落之和，即为每1ml菌落数,

共得2组数据。以2份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释

倍数报告。

3、5、3结果报告

3、5、3、1菌落数在100以内时，按实有数据报告。

3、5、3、2菌落数大于100时，取两位有效数字，第三位

按修约规则处理。

3、5、3、3复试

供试品细菌数一次检验不合格，应重新取二倍量供试品，依

法做单项复试两份，以三次结果的均值报告。若3次结果的平均

值不超过该品种项下的规定，判供试品符合规定；否则，判供试

品不符合规定。

3、5、4注意事项

3、5、4、1培养基及其制备方法：

培养基的成分及原材料的选择对细菌计数测定结果会造成

很大误差，其中陈、琼脂以及pH值对实验影响较大，每次实验

应特别注意。制备培养基时应注意：

a、培养基不应有沉淀，如发生沉淀，应趁热过滤。

b、制备后的培养基应及时灭菌，不应放置，避免细菌繁殖。

c、培养基的分装量一般不得超过容器具1/3,最多不超过

容器2/3,以免灭菌时溢出。

d、制备妥的培养基应在冷暗处保存，放置时间不能过长。

锥形瓶装的琼脂培养基，保存时间最长不能起超过3星期，以免

水分散失及染菌。

e、已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再用，更

不要反复加热熔化。

f、勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成分过度受热

而破坏最好用微波炉熔化琼脂培养基,其优点是受热均匀、方便、

省时。

3、5、4、2操作技术

a、供试品检验过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具

时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不能用口吹吸。

b、如在无菌室操作，使用乙醇灯时，切勿在火焰正上方操

作，以免将供试品内细菌杀死。

c、在净化工作台上操作时，应避免双手来回出入工作台，

而在无菌室操作时，应避免操作者来回出入无菌室。

d、不溶于水的供试品必须助溶后再进行试验，以免造成实

验误差。

e、供试品稀释时，注意每一稀释度换1支吸管（原吸管不

要吹洗）。

f、使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任何容器（瓶

口、试管口）或用具。

g、在做10倍递增稀释时，吸管插入稀释液内不低于2.5cm,

反复冲洗10次，吸液高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管贴

于容器内壁吸取1ml。靠近液面（但勿接触液面）缓缓地吹出全

部供试液至第二个容器中（即第一级稀释液所用吸管勿接触第二

级稀释液）。将吸管放入消毒筒内。

h、经验证明，两级稀释与两个平板多不能如实反映染菌量,

误差较大。宜采用三三制，即稀释三级。每级稀释液采用三个平

皿。

i、取供试液注平皿时，要取均匀的供试液。如取上清液或

沉淀物对试验结果必然有影响。

j、注皿时培养基应在45±1℃,高于45c时易造成细菌受

损或致死，低于45℃易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴

保温效果较好。

m、倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和

皿盖上，以免影响实验结果。

n、从供试品稀释，注平皿，倾注培养基，全部操作应在Ihrs

内完成，避免由于时间过长，导致细菌细胞繁殖或死亡。

3、5、4、3结果判断

a、在进行菌数计数时，应仔细观察。勿漏计细小的，琼脂

内和平皿边缘生长的菌落，同时应注意细菌菌落与供试品中颗

粒，沉淀物，气泡等的鉴别。必要时用放大镜或低倍显微镜直接

观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间5-7

天，细菌菌落常会生长增大而加以鉴别。

b、供试品稀释液中常含有不溶性原辅料，培养基注皿后亦

可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多难与菌落相鉴别

的有形物，为了方便菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的稀释

液增加注皿1—2个，计数，或用0.001%TTC营养琼脂注皿，经

培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来（菌落为红色）。

c、如同一稀释级二个平板菌落数超出一倍以上，不应计数,

菌落蔓延成片也不应计数。

3、5、4、4异常情况处理。

a、菌落蔓延：培养基中，由于一些菌落蔓延生长而影响另

一些菌落生长，甚至掩盖了另一些菌落，干扰计数。

细菌菌落蔓延生长主要原因是有动力（鞭毛）和培养环境湿

度过大造成，即平板表面湿度过大，给动力菌造成泳动的条件，

促使形成蔓延菌落机会增多。

防止菌落蔓延的方法如下：

①、加TTC：于倾注培养基前，在每1000ml营养琼脂内加

入灭菌1%TTC溶液1ml（最终浓度为0.001%,混匀后倾注平皿）。

②、开盖干燥：将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化

工作台上，开机1—2小时后合盖，再放入培养箱中。

③、换陶瓦盖：将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的

陶瓦盖。

b、异常菌数报告法：

一般情况下，以营养琼脂平板计数细菌数，玫瑰红钠琼脂平

板计数霉菌、酵母菌数。在特殊情况下，如营养琼脂平板生长了

霉菌、酵母菌，且多于玫瑰红钠琼脂平板的菌落数，则以营养琼

脂平板的霉菌、酵母菌数报告；反之，如玫瑰红钠琼脂平板生长

了细菌，且多于营养琼脂平板的菌落数，则以玫瑰红钠琼脂平板

的细菌数报告。如营养琼脂平板生长的霉菌、酵母或玫瑰红钠琼

脂平板生长的细菌菌落超过该品种微生物限度规定时，经复试2

次，如3次结果的平均值仍超过规定，应判定供试品不合格。

3、6霉菌、酵母菌数的测定（平板菌落计数法）。

3、6、1设备、仪器、器皿及用具。

霉菌培养箱（或生化培养箱），其他设备、仪器、器皿及用

具与细菌数测定相同，但用生化培养箱代替霉菌培养箱时，由于

生化培养箱没有保持箱内湿度的功能，这对于霉菌、酵母菌的培

养有一定影响（一般霉菌在湿度低于75%时即不生长），因此，

应在生化培养箱底部放置一小盘水，以保持一定的湿度。

3、6、2培养基、稀释剂

培养基：玫瑰红钠琼脂培养基。

稀释剂：ph7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液。

3、6、3操作步骤

霉菌酵母菌数测定一般与细菌数测定同时进行，按规定取两

个以上包装的供试品，并视供试品的污染程度制备1：10、1：

100,1：1000三级稀释度的供试液。分别注入平皿，每个稀释

级做2〜3个平板。另取一支1ml吸管吸取稀释剂各1ml注入2

个平皿中，作为阴性对照，每皿加约15ml已熔化并保温45℃的

玫瑰红钠琼脂培养基，加毕立即摇匀，待凝固后倒置于23〜28℃

培养箱中培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要

时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数报告。

3、6、4计数

一般情况下，玫瑰红钠平板点计霉菌或酵母菌数，如在该平

板上生长的细菌菌数多于营养琼脂平板上生长的菌数时，则应同

时点计细菌数，并将该菌数作为供试品的细菌数报告。

3、6、5菌落报告的规则

选择平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告（取

两位有效数字）的依据，以最高平均数乘以稀释倍数的值报告

lg、1ml或10cm?供试品中所含菌数。其报告规则同细菌数报告

规则。

3、6、6不得按计数规则报告的情况。

3、6、6、1阴性对照平板有菌生长，表明培养基已被污染。

3、6、6、2各稀释级平板上生长的菌落数不符合10倍递增

稀释规律，菌数显示混乱。

3、6、6、3同一稀释级的两个平板上生长的菌落数均在15

个以上，但菌数相差一倍以上。

3、6、6、4菌落蔓延生长覆盖整个平板无法计算数。

出现以上情况，该次实验数据不得计数报告。

3、6、7结果报告

结果报告与“3、5、3条”相同。

3、6、8复试

供试品检测，霉菌或酵母菌数不合格的，应重新倍量取量，

平行复试两次，取三次测定数据的算术平均值报告。如初试时

霉菌或酵母菌数已超过标准规定3倍以上可不予复试，直接取初

试数据报告。

3、6、9注意事项

3、6、9、1细菌与酵母菌落的区别。

细菌和酵母菌都是单细胞的微生物，有的嗜酸性细菌可在玫

瑰红钠平板上生长，由于两者菌落形态具有类似的特征，如较湿

润、光滑、易挑起，菌落正、反面及边缘、中心的颜色较一致，

质地均匀等。但酵母菌菌落单个者一般较大，生长在琼脂表面者

凸起较高、无光泽，呈边缘整齐的正圆形，乳酪状，菌落表面培

养物极易被挑起。生长在琼脂内的菌落有的呈铁饼形、三角形。

酵母产生的色素较单一，通常为白或奶油色。少数为红色或黑色。

产生假菌丝的种类，细胞易向外围蔓延，边缘粗糙不齐。直观不

能判别的可供助显微镜检，根据细胞大小、细胞群体中的出芽生

殖情况及形成假菌丝的形态，便可以加以识别。

3、6、9、2注意酵母菌形成的假菌丝与霉菌丝的区别：

酵母菌的假菌丝实际是酵母菌在行无性繁殖时产生的特性

形态，即芽硝子到正常大小时不与母细胞分离而再继续出芽生殖

所形成的。假菌丝中子细胞与母细胞之间仅以极狭窄面积相连，

两细胞之间呈现藕节一样的细胞，而霉菌有隔菌丝的横隔处两细

胞宽度是一致的。

3、6、9、3霉菌菌落计数时，平板不宜反复翻动，以防止

霉菌弦子在翻动时散落并长成新的菌落而影响计数。

3、7大肠埃希菌检查法

大肠埃希菌检查法采用MUG—Indole大肠埃希氏杆菌检查

法，即将MUG与Indole试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅

以IMVic试验。

3、7、1仪器、设备及用具：

仪器、设备及用具同“3、5、1、1条”。

3、7、2试液、指示液

0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠一蛋白月东缓冲液、

pH7.2无菌磷酸盐缓冲液，靛基质（Indole）试液、甲基红指示液;

a一蔡酚乙醇试液；40%氢氧化钾溶液、甲紫染液、革兰碘液、

95%乙醇、番红复染液。

3、7、3培养基：

胆盐乳糖培养基（BL）、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、

4一甲基伞形酮葡萄糖甘酸培养基（MUG）、曙红亚甲蓝琼脂培养

基（EMB）或麦康凯琼脂培养基（MacC）、蛋白陈水培养基、磷

酸盐葡萄糖月东水培养基、枸椽酸盐培养基。

3、4、4对照用菌液

取大肠埃希氏杆菌［CMCC（B）44102］的营养琼脂培养基的新

鲜培养物少许（1白金耳）、接种至9ml营养肉汤培养基于30-35

°C培养18-24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1：1（A

使对照菌液加入量含菌50〜100个（一般为0.1ml）,同时用营养

琼脂平板计数（以确定菌液浓度个/ml）o

3、7、5检验程序图解

.

革兰

枸椽

靛

基

染

氏

盐

酸

质

试

镜

色

验

试

验I

C检

30-35℃24-48hrs

报告

3、7、6操作方法

3、7、6、1供试液的制备:见“3、4条”。

3、7、6、2增菌培养：

取胆盐乳糖培养基（BL）3瓶，每瓶各100ml。2瓶分别加入

供试液10ml,其中一瓶加入对照菌50〜100个作为阳性对照。第

3瓶加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。36±1℃培养18-

24小时（必要时可延长至48hrs）。阴性对照应无菌生长。

3、7、6、3MUG葡萄糖醛酸甘酶试验。

摇匀上述BL增菌培养液，以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增

菌培养液、供试品阳性对照培养液，阴性