中国红豆杉内生真菌在7升发酵罐中产紫杉醇的工艺条件研究

中国红豆杉内生真菌在20升的代谢规律研究[摘要]对1株分离自中国红豆杉的内生真菌，在20升发酵罐中进行液体发酵并测定各时期紫杉醇的含量变化。结果表明：该种内生真菌大量合成紫杉醇是在对数生长末期及稳定期，并在111时紫杉醇含量达到最高即可结束发酵[关键词]中国红豆杉；内生真菌；液体发酵；紫杉醇引言红豆杉为红豆杉科(Taxaceae)植物，属于裸子植物亚门的古老树种，是冰川活动时期的孑遗植物，为世界上公认濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，在地球上已有250万年的历史。它的生态环境独特，散生于常绿阔叶林或针阔叶混交林，分布虽广，但数量稀少，种群密度小，自身繁殖力弱，生长速度慢[1]；目前，全球红豆杉属植物仅存11种，我国有4种1变种。即东北红豆杉(Taxus.cuspidata.sieb.et.Zucc)、西藏红豆杉(Taxus,wallichiana.Zucc)、云南红豆杉(Taxus.Tunanensis.Chengef.L.K.Fu)、中国红豆杉(Taxus.chinensis.Rehd)、南方红豆杉(Taxus.chinensis.Var.Mairei)[2]。红豆杉属植物在民间早有应用，如云南红豆杉的种子，枝叶就被作为驱虫、通经、利尿的草药应用[3]。美国国家癌症研究中心(NCL)在1958年开始的抗癌植物筛选工作中发现该属植物的树皮提取物有较强的抗肿瘤活性，1963年，E.Wall和M.C.Wani首先从太平洋红豆杉的树皮和根部分离到抗癌活性较强的纯化合物，随后通过X光衍射确定了其结构为一紫杉烷(Taxane)属萜类化合物，即紫杉醇(Taxol)。1971年，M.C.Wani发表了紫杉烷的化学结构。而具有紫杉烷独特骨架的衍生物及其生物碱类约有100个左右，其中多种成分具抗癌瘤作用，以紫杉醇作用最强[4]。紫杉醇(paclitaxel,商品名taxol)，分子式为C47H51O14N，分子量为853192,为一白色结晶体，熔点为213-216℃；微溶于水，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。紫杉醇分子在1位、2位和7位各有一个暴露的羟基，除1位的羟基由于在紫杉醇的三维立体结构中位置被屏蔽而呈现较不活泼的惰性外，其它位置的羟基都非常活泼，2位易被酰化，7位易发生氧化和异构化，10位上的乙酰基容易失去而形成去乙酰紫杉醇。紫杉醇13位上带有一长的脂侧链，在一定条件下能分解，脱除脂侧链，形成baccatinIII，碱是紫杉醇脂侧链降解反应的催化剂[27]，也就是说，紫杉醇分子结构很容易发生变化。Schiff等后来证实紫杉醇具有独特的抗癌机制，它作用于细胞微管（Microtuble），通过与微管蛋白N端第31位氨基酸和第217～231位氨基酸结合，诱导和稳定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使维管束不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于G2/M期，导致有丝分裂异常或停止，阻止癌细胞增殖，它对黑色素瘤及妇女乳腺癌有较强的抑制作用,已作为新型抗癌药用于临床。1992年12月29日，美国食品和药品管理局(FDA)正式批准了紫杉醇作为妇女卵巢癌患者的抗癌药目前紫杉醇主要是从红豆杉树皮中提取的，红豆杉资源在世界上非常有限，红豆杉科植物生长缓慢，且树皮中紫杉醇含量又低（约万分之二）[7]。加之紫杉醇溶解性差，平均产量约0.015%生产，即每提取lkg紫杉醇需要砍1000～2000棵红豆杉的树皮。据估测（1993年），紫杉醇正式运用于临床以后，全球每年约需200kg以上。按现在的提取率0.03%计算，每年要收集700吨红豆杉树皮来提取，即使将全部的天然资源采伐，也只能满足短期需要。随着该药品应用范围的扩大，所需红豆杉数量将十分可观，这也给红豆杉资源带来严重威胁，直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，必然严重威胁生态平衡，造成对森林和人类环境以及生物多样性不可弥补的损失。并且随着我国对野生红豆杉资源保护措施的不断加强以及对盗伐红豆杉不法行为的严厉打击，利用野生资源生产紫杉醇已无可能，资源已经成为从红豆杉植物中提取紫杉醇的“瓶颈”。在我国，紫杉醇的需求量又十分巨大，虽有5个种，但分布量都非常少，因此红豆杉药用和资源保护形成了尖锐矛盾，寻找紫杉醇未来新的生产途径已成为摆在人类面前的一项重大研究课题[8]。近年来国内外主要从3个领域进行紫杉醇生产的研究，即①化学合成法②植物细胞培养法③微生物工程法[9]。近年来，国内外学者进行了大量红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养研究，培养的红豆杉细胞系已超过10个，其中大部分已证实产生紫杉醇，但是离体培养生产紫杉醇实现工业化生产的关键问题难以突破，例如，培养物生物量小，紫杉醇产率较低，生产周期长，并且还需要保持细胞生长与生产特性的稳定等等[9]。Christen首次利用植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后研究吸引了众多的实验室跟进。ESCAgenefc:公司在1992年NCI主持的第二次紫杉醇研讨会上宣布他们用细胞培养法所得产物紫杉醇含量为树皮的2一5倍。中国的甘烦远[11]等发现云南红豆杉细胞在发酵罐中生长速率达到12g/L,紫杉醇含量为0.119%，约为成年树树皮中含量的12倍，为栽培植株的40倍。但是这项技术同样存在一些问题，即培养细胞的褐化问题等，短期内成功应用的可能性较小。目前人们普遍认为，微生物工程法生产紫杉醇是最具潜在能力、最具可能性的一种方法[10]。植物内生真菌（endophyte）是指生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显的病症状的菌，包括那些生活史中某一阶段营表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌（Latentpathogens）和菌根菌。植物内生真菌是一类应用前景非常广阔的资源微生物。植物内生菌的研究始于19世纪中叶，DeBary（1986）首次提出植物内生菌一词“endophyte”，在其后几十年中，先后有几十种牧草中发现了内生真菌，近年来的研究表明，几乎所有植物中都有内生菌的存在，且其种类极为丰富。内生菌主要生长在植物的皮下的组织当中，并且植物内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化，一方面植物体为其提供生长必须的能量和营养，另一方面，植物内生菌又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。植物内生菌的生物学作用主要又固氮作用、进植物生长作用和增强宿主植物抗逆境、抗病虫害等。并且植物内生菌能够产生多种全新的活性物质，作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药卫生领域有这巨大的应用潜力。随着人们对微生物资源的不断开发，微生物研究领域的不断扩展，微生物研究方法的不断创新和改进，内生菌的研究越来越受科研工作者的重视。利用内生真菌液体发酵的方法具有以下六个优点：①微生物作为工业生产的源泉，可在发酵罐中进行，源源不尽的进行生产；②微生物发酵的方法容易扩大化，发酵成本相对较低，利于工业化生产；③微生物生长仅需要常规的培养技术，在收集紫杉醇前，可通过优化发酵条件、改进技术来提高产量；④微生物易于通过基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量；⑤内生真菌生长迅速，易于培养，所用培养基相对较为经济；⑥可望满足市场的需求，降低紫杉醇的价格[11]。1991年，美国蒙拿大植物病理学系Strobel研究小组从药用植物太平洋红豆杉（Taxusbrevifolia）树皮中分离到1株具有合成与宿主相同抗癌药物—紫杉醇内生真菌（Taxomycesandreanae）[12],内生真菌的研究逐渐成为热点。1993年GaryAStrobel[13]等从短叶红豆杉分离筛选的内生真菌，产率为24～50μg/L；1996年又从喜玛拉雅山红豆杉中分离出另一株产紫杉醇的内生真菌，产率为60～70μg/L[14]；1995年，日本NipponsteelCooporation[15]分离出产紫杉醇真菌，产率为40μg/L；1996年，加拿大NovoPharma公司[16]分离出一株产紫杉醇真菌，其产率高达116mg/L，为目前最高水平。我国邱德有等从云南红豆杉（TYunnanensis）中分离出1株产紫杉醇的内生真菌，但产率非常低，每升产率只能以纳克计量；周东坡[17]等分离出了3株产紫杉醇的内生真菌，产率也仅为51.06～125.7μg/L。陈建华[18]等从云南红豆杉中分离出230余株内生真菌，经检测有5株表现出产紫杉醇特性，其中2株产率较高，约为1mg/L,是我国目前研究的较高水平。由于这些菌株产紫杉醇量很少，目前尚未投入工业性发酵生产。一般来说，发酵产量的水平要达到1mg/L左右才有工业生产价值[19]。但可通过培养基优化、菌株改良等方法提高产量实现紫杉醇的工业化生产。内生真菌是一类应用前景广阔的微生物资源，用微生物发酵的方法生产紫杉醇，是解决药源问题的有效途径[20]。本文通过对1株分离自陕西留坝的中国红豆杉内生真菌在发酵罐中进行液体发酵，旨在研究中国红豆杉内生真菌在20升发酵罐中产紫杉醇的规律，为开发利用这一珍贵的真菌资源提供参考依据。1材料和方法1.1材料1.1.1供试菌株一株分离自中国红豆杉的内生真菌，编号为K10A；由陕西省资源生物重点实验室食用药用菌菌种保藏中心提供。1.1.2主要仪器设备高效液相色谱仪（惠普HP-1100）、电子天平（FA1604型）、20L光照发酵罐（BIOTECH-3000上海保兴生物设备工程有限公司）、烘箱（LRH-250-GS）、人工气候箱（广东省医疗器械厂）、旋转蒸发仪（RE-52AAA，上海嘉鹏科技有限公司）、循环水多用真空泵（SHZ-95B，郑州杜浦仪器厂）、灭菌锅、超净工作台等。1.1.3培养基母种培养基（马铃薯200.0g,葡萄糖20.0g,琼脂20.0g,H2O1000.00mL,KH2PO35g、MgSO4·7H2O3g、VB110mg、pH自然）；液体培养基（马铃薯200.0g,葡萄糖40.0g,H2O1000.0mL,KH2PO32.0g、MgSO4·7H2O0.5g、(NH4)2SO43.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏0.8g、VB11.2方法1.2.1液体发酵（1）菌种活化在试管斜面接入母种，于28℃下活化培养5～7d（2）液体种制备制备液体培养基，分装于三角瓶中,装液量300mL／500mL，于121.3℃灭菌30min，冷却后将已活化的菌株接入液体培养基中，静置培养后转至振荡培养箱，在28℃，160r/min的振荡培养，培养4d，待长出大量菌丝球后，置于（3）液体发酵设置搅拌轴转速120～210r/min、空气流量1.2L/min、发酵罐内温度28℃、pH6.0；pH电极、溶氧电极及酸碱蠕动泵校准；制备液体培养基14L，由加料口加入发酵罐内，同时加入适量的菜籽油作消泡剂；启动蒸汽发生器对发酵罐内发酵液实罐灭菌，待冷却后放置24h检查各参数确定灭菌是否彻底；将液体种由接种口接入，至此发酵开始。1.2.2紫杉醇萃取每3h抽取发酵液500mL；布什漏斗抽虑过滤发酵液，菌丝体水洗两遍，收集置于烘箱（48℃）烘至恒重；取菌液于65℃旋转蒸发至1/10体积后，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，收集萃取剂相；将菌丝体放入研钵研磨至菌丝体完全破碎，加入一定量乙酸乙酯超声波提取30min3次，收集乙酸乙酯相。合并发酵液和菌丝体乙酸乙酯相，并于60℃旋转蒸发至干，用少量甲醇溶解后定容至10ml，置1.2.3分析检测利用HPLC建立紫杉醇标准曲线：称取紫杉醇标准品0.85mg，用乙醇溶解，定溶至10mL。高效液相色谱(HPLC)测定，条件为：流动相，甲醇：水(v/v)=65∶35，C18柱(4.6mm×150mm,5μm)，流速1mL/min，检测波长228nm.，进样量20μL，单点绘制标准曲线。将上述已用乙醇溶解的紫杉醇提取物经滤膜过滤后上高效液相进行检测。紫杉醇标准品的HPLC色谱图（图2.1），紫杉醇物质的出峰时间在11.001min。图1.0紫杉醇标准品HPLC色谱图Figure1.0FermentationextractsofTax-2HPLC结果与分析产紫杉醇动力学曲线pH随时间的变化关系在发酵过程中，K10A菌代谢产酸，须配置碱液用以维持发酵环境在5.8～6.2的适宜范围；图2.1PH随时间变化关系由图2.1表明，前24小时停留在延滞期，pH下降不明显；到第39h时，pH迅速下降，说明菌丝体进入对数期；第48h，由于菌丝体代谢产酸，pH低于5.8,碱液自动加入，pH迅速在第57h恢复到6.2。由此可见，加入碱液可以使pH维持在一个有利于菌丝体生长代谢以获得紫杉醇最高积累量范围。2.1.2溶氧随时间变化关系图2.2溶氧与发酵时间的关系图2.2表明，随着发酵的进行，发酵液中的溶氧呈下降趋势。从接种到发酵进行到第24小时，溶氧基本维持在70%左右，说明K10A内生真菌进入一个新环境处于生长延滞期并一直延续到第36h；从第36h～60h可见溶氧曲线迅速下降，说明K10A内生真菌已经完全适应了新的环境并迅速繁殖进入对数期，此时菌丝体浓度逐渐达到最大，大量菌丝体需消耗大量的溶氧，使的发酵液中的溶氧迅速减少；当发酵进行到第66小时的时候，发酵液中溶氧仅为3.4%，提高转速及空气流量溶氧提升效果不明显，观察发酵液，菌丝体密度非常大，发酵液粘度阻力变大，致使空气气泡不能最大限度的与发酵液接触传递氧气。从第69h开始，K10A内生真菌进入稳定期，溶氧继续小幅度下降，其原因是：(1)高密度的菌丝体需要消耗大量的氧气；（2）高密度菌丝体增大了发酵液的流动阻力使空气不能充分与发酵液混合接触；(3)发酵液中的次生代谢产物如多糖的产生增加了发酵液的黏度，阻碍了氧在发酵液中的传递。2.1.3紫杉醇积累与时间关系图2.3紫杉醇与发酵时间的关系由图2.3可以看出，紫杉醇的积累量与溶氧消耗菌丝体生长呈一定线性关系；结合溶氧图，延滞期（0～36h）以及对数生长前中期（36～57h）都没有紫杉醇的产生积累；但在对数生长期后期紫杉醇开始大量合成，在稳定期（60～90h）合成速度达到最快；可以判断，K10A内生真菌进入稳定期后才会大量合成紫杉醇等次生代谢产物；但紫杉醇的合成会对自身细胞产生某种程度的生理毒性，而抑制菌丝体的生长[21]；随着细胞内紫杉醇浓度的升高，也会阻遏紫杉醇进一步合成（102～108h）；发酵至111h时，紫杉醇含量不再增加；因此可以确定，K10A内生真菌的发酵罐液体发酵在111h时可以结束发酵。3小结利用内生真菌来合成紫杉醇是近年来开展的紫杉醇资源研究的方法之一，尚处研究初级阶段。本实验是通过对中国红豆杉内生真菌进行实罐连续发酵来确定发酵过程中紫杉醇含量的积累变化规律；最终确定该种内生真菌大量合成紫杉醇是在对数生长末期及稳定期，并在111h时紫杉醇积累达到顶峰结束发酵。本实验使用20L发酵罐进行实罐发酵，发酵环境比三角瓶摇床培养更接近于工厂大规模发酵罐实罐发酵；利用内生真菌来发酵生产紫杉醇是近年来解决紫杉醇资源短缺的一条综上所述能为中国红豆杉内生真菌在工业发酵放大生产中提供理论依据。参考文献[1]中国科学院微生物研究所《菌种保藏手册》编写组.菌种保藏手册[M].北京:科学出版社,1980,114.[2]田成国,吴键.红豆杉抗癌有效成分的研究[J].贵州师范大学学报,1999,17(4):19～21.[3]张炯炯.红豆杉植物资源的开发利用[J].生物学杂志,2000,8(4):30～31.[4]周东坡,平文祥,孙剑秋等.紫杉醇产生菌分离的研究[J].微生物学杂志,2001,3(21):18～19.[5]王润玲,陈涓.紫杉醇的研究及应用进展.中药学,1997,28(增刊):5～7.[6]KingstonDGI,MolineroAA,RimoldiJM.Thetaxanediterpenoids[A].In:HerzW,KirbyGW,MooreRE,etal,eds.Progressinthechemistryoforganicnaturalpraoducts[C],NewYork:SpiringerVerlag,1993,61:31～60.[7]方起程,方唯硕.紫杉醇的研究进展[J].中草药,1997,28(增刊):1～5.[8]王海燕,李运曼,刘国卿.紫杉醇抗癌机制研究进展[J].药学进展,1999,23(4):209.[9]王正平.天然抗癌药物—紫杉醇[J].应用科技,2004,31(1):56～58.[10]丁如贤,王昊.红豆杉的生物工程研究进展[J].药学实践杂志,2000,18(5):274～276.[11]林福呈,刘小红,王洪凯等.紫杉醇及其产生菌的研究现状与展望[J].微生物学报,2003,43(4):534～538.[12]StierleA,StrobeiG,StierleD.TaxolandT