T-CVMA 161-2024 牛分枝杆菌抗体镧系荧光免疫层析法

T/CVMA161—2024牛分枝杆菌抗体镧系荧光免疫层析法DetectionmethodofMycobacteriumbovisantibodybylanthanidefluorescenceimmunochromatographicassay2024-5-8发布2024-5-8实施中国兽医协会发布I1本文件适用于检测牛血清中牛分枝杆菌抗体，可用于牛结核病的辅2规范性引用文件NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范镧系荧光免疫层析技术lanthanidefluorescBSA：牛血清白蛋白（BovineserumalbumNC膜：硝酸纤维素膜（NitrocellulosemembPVC：聚氯乙烯塑料材料（Polyvinylchlorid2算出血清中牛分枝杆菌抗体检测值（T/C比带入标准曲线的回归公式，换算获得牛分枝杆菌抗体效6.2配制0.2MPB液、10mM按照NY/T541中的规定进行样品处理，血液样品用离心机1000g离心3min，血按照NY/T541中规定进行血清或全血样品的存放与运输。血清样品在2℃~8℃冷藏可保存24h，如需长期保存应置-20℃或-80℃。采8检测方法8.1牛分枝杆菌抗体镧系荧光免疫层析检测卡3避光置于16℃~26℃作用15min后，将检测卡放入镧系荧光分析仪检测，系统自动完成读值。进行牛分枝杆菌抗体实验室检测时，如检测9结果计算便携式镧系荧光分析仪通过LED灯激发并收集检测线（T线）和质控线（C线）上的荧光信号，分析仪系统软件自带计算功能，将荧光信号值转换成数值（T线和C线由T如果检测值显示数据，说明质控线和检测线荧光信号值4A.1质控血清制备A.1.1牛分枝杆菌阳性血清的制备A.1.2牛分枝杆菌阴性血清的制备A.2荧光微球垫的制备A.2.1荧光微球标记牛分枝杆菌复合抗原的制备本品系将牛分枝杆菌的ESAT-6、CFP-10偏爱密码子序列，合成了牛分枝杆菌多表位蛋白融合表达目的基表达载体构建重组质粒pET-28a-ECM，经转化构建成埃希氏大肠杆菌基因工程菌pET-28a-ECM-纯化后的牛分枝杆菌重组蛋白的蛋白浓度。每毫升蛋白浓度均应不低于3mg。0.2MPB洗涤一次，16℃~26℃避光震荡混匀，加入2mgEDC和2mgN-羟基琥珀亚胺对荧光微球活化30min，于16℃~26℃25000g离心30min，加1ml0.2MPB分散，加入0.1mg牛结核分枝杆菌复合抗原，16℃~26℃避光震荡2h，加入封闭剂，16℃~26℃避光震荡30min，25000g离心30min，弃上清，加1ml0.2MPB洗涤标记微球一次。最后用重悬液重悬至2ml，4℃避光保存备用。A.2.2荧光微球质量标准1）镧系荧光微球液体避光保存，在2℃~8℃中呈乳白色。2）纳米粒度仪检测镧系荧光微球粒径280nm～320nm，粒径分布均匀性检验分布半宽度应<4）激发光波长380nm～400nm，发射光波长为615nm。A.2.3荧光微球垫的制备5将荧光微球标记牛分枝杆菌复合抗原稀释5倍后，用h～3h，烘干后于切成7mm于4℃~30℃密封保存备用。A.3包被片材的制备A.3.1包被溶液的制备A.3.1.1质控线（C线）包被溶液膜溶液，置于棕色玻璃瓶中，2℃~8℃保存备用。A.3.1.2检测线（T线）包被溶液包被溶液，置于棕色玻璃瓶中，2℃~8℃保存备用。A.3.2包被片材（T线），用连续点膜机分别将质控线（C线）包被溶液、检测线（T线）包被溶液包被在NC膜上的C封口，贴上标签，于4℃~30℃密封保存备用。A.4样品垫的制备纤维素膜表面，置于37℃(±2℃)烘房过夜干燥，用切条机将其裁切为1.7cm×30cm，A.5检测卡的制备在16℃~26℃及湿度≤30%RH的洁净环境下操作，依次按吸水垫、荧光微球垫、样品垫的顺序将膜相邻处均有1mm～2mm层叠，样品垫一边与PVC底板下沿对齐，并使包被片材上的检测线