第4章 抗体制药(三)课件

第六节抗体诊断试剂抗体诊断的理论基础是抗体与抗原之间的特异性反应。在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬和中和毒素等作用。在血清学检验中，表现为凝聚。第4章抗体制药(三)免疫学的迅速发展使诊断技术不断更新，抗体用于诊断，体现在三类诊断药物中：①血清学诊断中使用的抗体制剂(体外诊断)②免疫标记用的抗体制剂(体外诊断)③体内导向诊断的抗体药物(体内诊断)第4章抗体制药(三)血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌诊断和血型鉴定。常用的方法是凝集。优点：简单快速，应用广泛，普及至基层。第六节抗体诊断试剂

一、血清学鉴定用的抗体试剂第4章抗体制药(三)（1）常用诊断血清的品种和用途

诊断病原菌或相关抗原的试剂包括各种诊断血清、分群血清、分型血清、因子血清等。（2）诊断血清的制备：用病菌抗原免疫动物，采血、离心分离得到血清。（3）诊断方法：直接凝集反应，常用玻片做定性试验，简便快速。第六节抗体诊断试剂

一、血清学鉴定用的抗体试剂

1.鉴定病原菌的抗体试剂（诊断血清）第4章抗体制药(三)第4章抗体制药(三)第六节抗体诊断试剂

一、血清学鉴定用的抗体试剂

2.乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原，称为反向被动血凝试验(RPHA)。（1）诊断试剂的制备：用HBsAg免疫豚鼠，获得抗HBs血清，实质是含HBsAg抗体（HBsAb）的血清；甲醛处理红细胞，与抗HBs血清混合，红细胞大量吸附血清中的包括HBsAb在内的蛋白。待测样品中有HBsAg时，发生凝聚。（2）RPHA法测定HBsAg通常在V型血凝板上进行，操作时应附有阴性、阳性和空白对照。第4章抗体制药(三)第六节抗体诊断试剂

一、血清学鉴定用的抗体试剂

3.妊娠诊断试剂孕期三个月的妇女血液和尿液中的人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotrophin,HCG)处于高峰值。测定体液中HGG的方法常用生物试验法、胶乳间接凝集试验法、酶联免疫吸附测定法和放射免疫测定法等。（1）用胶乳试剂测定HGG：①间接凝集法（不发生凝集为阳性结果）；②直接凝集法（发生凝集为阳性结果）（2）胶乳的致敏方法：①物理吸附法；②化学交联法。第4章抗体制药(三)第六节抗体诊断试剂

一、血清学鉴定用的抗体试剂

4.抗ABO血型系统血清血型有多个系统，其中最重要的是ABO血型系统，按人红细胞表面带有的A或B种凝集原来分型。第4章抗体制药(三)为了提高诊断的灵敏度，用放射性同位素、荧光素或酶对抗体做标记，放大抗体—抗原反应的表象，是免疫标记诊断的实质内容。结合显微镜或电子显微镜技术，还能对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定，除了诊断外，还能为探讨发病机制提供有力的研究手段。第六节抗体诊断试剂

二、免疫标记用的抗体试剂第4章抗体制药(三)（一）荧光抗体诊断试剂免疫荧光技术：用异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、罗丹明(Rhodamine)或藻红素等荧光色素标记抗体，直接向组织切片或细胞悬液滴染，在荧光显微镜下或用流式分光光度计（流式细胞仪）观察。第4章抗体制药(三)荧光抗体的制备

免疫荧光测定方法（1）直接法：采用荧光抗体直接与抗原反应。优点：特异性高；缺点：每种抗原须单独制备相应的荧光抗体。（2）简接法：用荧光标记抗球蛋白抗体（荧光第二抗体）来检测未知抗原。只需制备一种荧光标记的抗体，即可用以检测多种抗原抗体系统，敏感度比直接法高5～10倍。第4章抗体制药(三)免疫荧光（神经元）免疫荧光显像系统第4章抗体制药(三)（二）免疫酶抗体诊断试剂用酶标记来检测抗原，分为免疫酶染色（组比法）和酶免疫测定两种类型。免疫酶染色法用酶标记抗体，称为酶标抗体。测定时酶标抗体与抗原发生特异性结合，发生组化反应，产生有色物质，可在光学显微镜下直接观察。常用辣根过氧化物酶(horseradishpeiroxidase，HRP)标记抗体，加入酶底物－二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)。如果抗体与抗原结合，底物将被分解，呈现棕褐色。第4章抗体制药(三)酶免疫测定（ELA）是一种在液相内微量待检抗原物质的定量测定方法。酶联免疫吸附技术：ELISA酶免疫测定在方法上的一个重大改进，使抗原或抗体吸附在聚苯乙烯塑料等表面上进行反应，大大简化了抗原抗体结合物的分离过程。用途广泛，敏感度高，既可定性也可定量。第4章抗体制药(三)酶联免疫吸附试验――ELISA第4章抗体制药(三)酶联免疫反应示意酶标仪第4章抗体制药(三)间接法：用于检测血清中抗体载体抗原＋抗体（待检血清）＋酶标抗抗体＋底物-→显色反应夹心法：检测标本中抗原载体抗体＋抗原（待检标本）＋酶标抗体（特异性）＋底物-→显色反应第4章抗体制药(三)ELASA（竞争法）第4章抗体制药(三)生物素-酶标抗生素蛋白系统抗体诊断试剂（BAS-ELISA）生物素-抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物可作为一种指示剂，组成一个新的生物放大系统。该法特异性强、结合稳定，在与抗体、酶、荧光素等结合后不影响后者的生物活性，可用于检测多种抗原抗体系统。灵敏度：扩散试验<电泳试验<凝集试验<ELISA<BAS-ELISA、放射免疫分析试验。第4章抗体制药(三)（三）放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫技术：灵敏度最高的检测手段。诊断试剂设计中考虑的是用放射性同位素131I和125I标记抗体，放射自显影检测。把同位素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来。在医学实践中可用放射性自显影法检测微量抗原物质。第4章抗体制药(三)放射免疫（竞争法）结合态的标记抗原（B）与游离态的标记抗原（F）第4章抗体制药(三)第4章抗体制药(三)第六节抗体诊断试剂

三、导向诊断药物在体内直接诊断病原的抗体试剂被称为导向诊断药物。放射免疫显像定位技术是把特异性与病原细胞表面抗原结合的抗体预先同重金属络合剂—二乙基三胺五乙酸(DTPA)耦联成Ab-DTPA，注入体内，“自动寻的”与病原细胞结合；再注入In-113M（放射性核素，铟），使其与DTPA络合。放射免疫显像定位技术通过放射自显影，可以对病原细胞(如肿瘤)进行组织定位、显示肿瘤细胞转移形成的病灶、观察抗体在血液中的功能半衰期、确定肌体对抗体做出的不良反应等。第4章抗体制药(三)导向诊断药物的显像第4章抗体制药(三)肿瘤标记物放射免疫显像第4章抗体制药(三)

白细胞分化抗原是不同谱系白细胞分化、成熟的不同阶段表达的细胞表面抗原分子，亦即白细胞表面标记。它们参与机体重要的生理和病理过程。例如：（1）免疫应答过程中免疫细胞的相互识别，免疫细胞抗原识别、活化、增殖和分化，免疫效应功能的发挥；（2）造血细胞的分化和造血过程的调控；（3）炎症发生；（4）细胞的迁移如肿瘤细胞的转移等。

第六节抗体诊断试剂

四、CD单克隆抗体系列第4章抗体制药(三)应用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群，简称CD（clusterofdifferentiation)，按照发现的顺序，白细胞分化抗原的命名从CD1、CD3，已达到CD247。用异硫氰酸荧光黄或罗丹明标记这些分子，在免疫学上认识淋巴T细胞的功能、分化、信息传递等具有十分重要的意义。第六节抗体诊断试剂

四、CD单克隆抗体系列第4章抗体制药(三)CD4细胞第4章抗体制药(三)第七节抗体治疗药物抗体治疗药物：以抗体为载体的导向治疗药物。其应用上的障碍是抗体相对分子质量大，穿透力低，不能到达靶部位或其摄取量低；另外就是鼠源性单克隆抗体的排斥反应。目前正致力于抗体小型化和人源化的研究。第4章抗体制药(三)第七节抗体治疗试剂

一、放射性同位素标记的抗体治疗药物放射性同位素标记肿瘤特异性抗体，以抗体作为导向载体，导向病灶，利用放射性同位素的电离辐射能量治疗病灶，使肿瘤细胞接受最大的电离辐射能量，杀伤肿瘤细胞。已经研究的放射性同位素有131I、212Bi、109Pd、186Re等。第4章抗体制药(三)优点：操作简便，同位素和抗体的用量小，且能观察到药物在体内的分布和药物动力学，就用前景好。

缺点：有些同位素来源困难，且需放射性保护和污物处理。第4章抗体制药(三)第七节抗体治疗试剂

二、与抗癌药物耦联的抗体治疗药物常用的抗癌药物：氨甲喋呤(methotrixate,MTX) 阿霉素(adriamycin,ADM) 丝裂霉素(mitomycin,MMC) 环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX) 新抑癌蛋白(neocarzinostaitin,NCS) 正定霉素(doxorubincin,DOX)以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。第4章抗体制药(三)抗体药物偶联物对化学疗法耐药的细胞株仍然有效。

肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（MDR）。MDR是由基因调控的，其编码蛋白称为P糖蛋白，其中P170是与肿瘤耐药相关的主要蛋白。P蛋白是ATP酶依赖性药泵，药物进入细胞后与P蛋白结合，利用ATP水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。抗体导向酶—前药疗法（ADEPT）可以大为提高化疗的特异性，避免对正常组织的破坏。ADEPT的关键在于选择适当的活化酶-前药对。第4章抗体制药(三)第七节抗体治疗试剂

三、与毒素耦联的抗体治疗药物在导向药物中，毒素与抗体的交联物称为免疫毒素。 白喉毒素(diphtheriatoxin,DT) 绿脓杆菌外毒素(pseudomonasexotoxin,PE)产气夹膜杆菌磷脂酶(perfringens-pholipasePLC) 蓖麻毒素(ricintoxin,RT)。第4章抗体制药(三)第一代免疫毒素是由包含A、B链的完整毒素和抗体的交联物。

第二代免疫毒素则是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或A链作用相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。用基因克隆方法改造毒素基因，再和小分子抗体基因重组表达，成为第三代免疫毒素——重组免疫毒素。第4章抗体制药(三)毒素的来源，主要是细菌毒素和植物毒素，如DT、PE、PLC、RT等。载体主要是将毒素携带至靶细胞表面，且与其结合，使毒素进入细胞内起作用。作为毒素的载体，必须相对分子质量要小，识别与结合靶细胞能力强，特异性好。载体的种类：小分子抗体FV或scFV；细胞生长因子；激素；CD4。必须先把毒素基因分离与克隆出来，用基因重组技术去掉不必要的顺序，只保留毒素决定部位的核苷酸顺序，再与载体基因的cDNA连接，形成融合蛋白基因，转化受体菌，表达的蛋白就是重组免疫毒素。第4章抗体制药(三)免疫毒素的临床作用：免疫毒素用于治疗肿瘤、自身免疫病，并能克服组织移植排斥反应。可单独结药，或包裹在脂质体及其他微粒中结药。（1）肿瘤的免疫治疗（2）骨髓移植

包括自体和异体骨髓移植。第4章抗体制药(三)第四章复习题

1、画图说明抗体分子