第9章 目的基因的获取

第九章

目的基因的获取目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。目的基因：人们所需要研究的基因。目的基因目的基因需要克隆的DNA片段建立高效表达系统研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系确定其表达调控机制和生物学功能目的基因的克隆与基因文库的构建APCR法B基因文库的构建法C化学合成法

1、概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术聚合酶链式反应体外特定DNA片段2、原理：DNA复制1、利用PCR技术扩增目的基因DNA扩增仪四种脱氧核苷酸

一对引物：耐热的DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

3、条件：一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补。一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物4、前提：能量

5、过程高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环预变性（增加DNA变性的概率）引物脱氧核苷酸5、具体过程①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

、

_______________、___________、___________.等②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNA（含目的基因）ATP⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原则原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子基因库（genepool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（genelibraryorgenebank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因）cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）2、基因文库的构建及目的基因的筛选基因文库构建的基本战略构建基因组文库，材料来自染色体DNA构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库。基因组文库的构建基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。鸟枪法克隆目的基因1.目的基因组DNA片断的制备超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。当染色体DNA上目的基因区域的限制性酶切图谱未知时，采用合适这超声处理强度和时间，可以将切割的DNA片段控制在一定在大小范围内，其上限是载体的最大装载量，下限应至少大于目的基因的长度，否则无法在一个重组克隆中获得完整的目的基因。一般来说，原核生物的基因长度大都在2kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达100kb以上，因而将外源基因片段处理成略小于载体装载量上限的长度始终是正确的，外源DNA片段越大，后续筛选的规模越小。外源DNA片段很难完整地从重组分子上卸下。基因组文库的构建鸟枪法克隆目的基因1.目的基因组DNA片断的制备全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。如采用识别序列为4个碱基对的限制性内切酶（如AluⅠ,MboⅠ）部分降解染色体DNA，这些限制性内切酶的识别顺序在任何生物基因组中频繁出现，因此只要采取合适的酶解条件就可能获得大片段的DNA分子。DNA片段具有粘性末端，可以直接与载体分子拼接。基因组文库的构建

内切酶识别位点的碱基数——影响所切出的产物的长度和随机程度。

4bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。

6bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。限制性内切酶的选用原则鸟枪法克隆目的基因1.目的基因组DNA片断的制备部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。如果染色体上DNA上目的基因的两侧含有已知的限制性内切酶识别位点，而且两者之间距离不超过载体装载量的上限，用这一（两）种限制性内切酶全酶解染色体DNA片段可能更为有利，所产生的片段呈非随机化，在某些程度上可以简化后续的重组和筛选操作。基因组文库的构建鸟枪法克隆目的基因2.外源DNA片断的全克隆根据外源DNA片段的末端性质和大小确定克隆载体，一般选择质粒或λDNA，受体细胞一般选择大肠杆菌。如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体。如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体，受体细胞选择能使目的基因表达的受体细胞。3.重组子的筛选与鉴定抗生素抗性筛选兰-白斑筛选PCR筛选DNA杂交筛选

鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构3、cDNA文库的构建及目的基因的获得1、cDNA文库的构建（1）分离提取细胞总RNA（2）mRNA与其他RNA的分离，mRNA仅占总RNA的1~2%，可利用mRNApoly(A)与其他RNA分开。mRNA与其他RNA的分离(3)以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链

mRNA纯化后，加入oligo(dT)作为引物，以提供3’-OH引导DNA链的合成，同时加入逆转录酶和四种dNTP，形成RNA-DNA杂合分子。以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链（4）cDNA第二链的合成

自身引导法

获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失（4）cDNA第二链的合成

置换合成法

获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失,还会有一小段RNA,但不影响后续的克隆操作。cDNA第二链的合成引导合成法

获得的双链cDNA

能保留完整的5’端序列cDNA法克隆目的基因的基本战略（5）双链cDNA的克隆平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收cDNA法分离目的基因差异分离将两种不同组织来源的mRNA进行比较，用扣除杂交（subtractivehybridization)排除相同部分，即共同表达的那部分mRNA，选出有差异的、特异表达的mRNA，构建成的cDNA文库。因而这种程序较适用于分离克隆新基因，进而研究其生物学功能。对已知序列目的基因的筛选DNA探针筛选：构建的cDNA文库，每个噬菌斑或菌落中含有一个被克隆的cDNA片段。然后，利用原位DNA探针进行筛选目的基因。PCR法筛选（6）从cDNA文库中筛选目的基因核酸探针筛选cDNA文库目的基因未知序列目的基因的筛选（1）从蛋白质寻找基因•早期寻找基因的方法，对特异表达的蛋白质进行序列分析，并推测一段核苷酸序列，合成DNA探针，筛选分离相应的基因。

（2）同源性序列搜索在Genebank等网站中收录了大量DNA序列的数据，用同源性比较工具Blastn软件，搜索基因之间存在着的一些保守序列，可以判断某些新基因的存在。未知序列目的基因的筛选

（3）差示筛选组织特异的cDNA是利用一对组织基因表达的差异，筛选出其中一种组织中受某种因素调控表达的一种或一组基因。制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。未知序列目的基因的筛选（4）DNA微列阵技术筛选基因把某一生物体内全部已知基因分别点到DNA芯片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达情况。•建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活

----基因诊断。未知序列目的基因的筛选

（5）用抗体筛选目的基因

cDNA应克隆在表达载体中表达载体有使外源基因表达的必要调控部分。如启动子、SD序列等。通过表达产物与抗体特定的结合来识别和分离目的cDNA克隆。未知序列目的基因的筛选用抗体筛选目的cDNA克隆cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因3、化学合成法的基本战略全基因合成a.小片段粘接法根据目的基因全序列，将目的基因分成若干12-15碱基长的小片断，两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片断。容易在退火时发生错配化学合成法的基本战略b.补钉延长法将目的基因的一条链分成若干40-50碱基的片断，另一条设计成与之交错互补的20个碱基小片段。c.大片段酶促法

根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA