3.1.3重组DNA技术的基本工具（DNA粗提取和鉴定限制酶的选择）高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章基因工程重组DNA技术的基本工具（DNA粗提取和鉴定+限制酶的选择）板展：1.基因工程的工具？

运载体包括？2.按其来源不同，DNA连接酶有两类，即______和_______，其中后者只能连接一种末端。3.运载体具备的条件及目的？4.右图：EcoRⅠ限制酶的切点是___________之间。5.若质粒的切割末端为

,则与之连接的用同一种酶切割的目的基因的切割末端应为___________。该酶的识别序列为______________。6.某限制酶识别序列是—↓GATC—；画出用该限制酶切割获得的DNA片段？7.质粒用EcoRⅠ切割后产生的片段如下:为使运载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,还可用另一种限制性核酸内切酶切割,该酶的特点？切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同用同种酶切割的目的是：产生相同末端，便于连接。缺点：容易发生①目的基因自身环化

②质粒自身环化

③目的基因与质粒反向连接。【改进：使用两种产生不同末端的酶分别切割质粒、目的基因】1.目的基因自身环化2.载体自身环化3.目的基因与载体正向连接4.目的基因与载体反向连接(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中

；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择

和

两种限制酶。(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择

，而不选择

。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择

。PstⅠSmaⅠSmaⅠPstⅠPstⅠEcoRⅠ看书范围：P74“探究

实践”【6分钟】1.第一段：找出DNA粗提取原理

鉴定原理2.3.实验步骤：（1）圈出每步用到的试剂——作用是？（2）每步DNA存在于溶液中还是沉淀物中？（4）步骤4——完成表格导思1.已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。质粒用限制酶_____切割，目的基因用限制酶_______切割。议2.若利用酶切法获得目的基因，最应选择的限制酶是__________和______________。3.用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________两种限制酶切割。4.为实现M蛋白基因与质粒连接，切割质粒。选用的限制酶是_____________。切割质粒时选用不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________。5.目的基因接入质粒的方式理论上有两种：正向连接和反向连接。若正向连接转录出的mRNA序列是5’-AAUUGGCC-3’，则反向连接时，转录出的mRNA序列是？反向连接导致目的基因表达出不同蛋白质的原因是？自由展1.已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。质粒用限制酶______切割，目的基因用限制酶_________切割。2.若利用酶切法获得目的基因，最应选择的限制酶是____________________。展1IIIMspISmaI_3.用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_________________两种限制酶切割4.为实现M蛋白基因与质粒连接，切割质粒。选用的限制酶是_____________。切割质粒时选用不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________。展2BclIHindIII_BglIIXmaI_SmaI切割后产生平末端，不能与目的基因连接_5.限制酶的选择：若用下图中的质粒和目的基因构建重组DNA，分析：（1）能否选用SmaI进行切割？不能

原因？①会破坏目的基因

②质粒上无该酶切割位点（2）能否选用EcoRI和HindⅢ共同切割,原因？切割后无标记基因（3）若单独使用HindIII分别切割目的基因和载体，则会出现下列哪些片段？①载体自身环化②目的基因环化③目的基因与载体正向连接④目的基因与载体反向连接（4）单独使用HindIII分别切割目的基因和载体，携带CDKN2B基因的重组质粒成功导入细胞后，发现约一半细胞中没有检测到CDKN2B蛋白，原因是④目的基因与载体反向连接为避免这种现象发生，改进措施是同时选用PstIEcoRI酶分别对目的基因和载体进行酶切？（5）结合上述分析，与单独使用HindIII相比,用两种酶切的优势是？【高频二卷】①避免载体自身环化（1分

）；

②避免目的基因环化（1分）；③避免目的基因与载体反向连接（1分）。展3评1（一）限制酶的选择1.总结:限制酶选择的要求：①选择的酶切位点不能破坏目的基因、复制原点。②至少保留一个标记基因。2.注意方向性:A．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体B用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体5.目的基因接若正向连接转录出的mRNA序列是5’-AAUUGGCC-3’，则反向连接时，转录出的mRNA序列是3’-UUAACCGG-5’。反向连接导致目的基因表达出不同蛋白质原因：反向连接转录出的mRNA不同评2（二）DNA粗提取和鉴定1.DNA粗提取的原理：①DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精。②DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，在2mol/LNaCl溶液中溶解度最大。2.DNA鉴定原理；在_沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈_蓝_色。（二苯胺现配现用！）3.本实验可选用【洋葱

菠菜

猪肝

大肠杆菌、鸡血】

：原因DNA含量丰富。

不能选用猪血/兔血,原因：_哺乳动物成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器，DNA含量少。4.步骤：【步骤1】若为鸡血，加入蒸馏水目的是使鸡血细胞_吸水涨破_，释放出DNA。若材料是洋葱，则需倒入研磨液后充分研磨。≠滤纸（1）析出DNA时，加入95%的冷酒精。（2）预冷酒精优点是①抑制DNA水解酶的活性，防止DNA降解；②降低分子运动，易于形成沉淀_析出_；③有利于增加DNA柔韧性，减少_DNA断裂。评3【步骤4】2mol/L的Nacl溶液不处理加入丝状物二苯胺沸水浴冷却颜色不出现蓝色出现蓝色是否加入DNA判断

1.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来

×植物有壁，不会涨破2．将含DNA的上清液加入95%的冷酒精会出现白色丝状物√3.鉴定DNA时，应将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴×加入2mol/LNaCl4.鉴定时加入二苯胺后沸水浴即可观察到较为明显的显色反应×P75沸水浴5min，冷却5．将DNA丝状物溶于2molL的NaCl中，沸水中加热5min可观察到溶液变蓝

×加入二苯胺试剂6.将白色丝状物溶解在NaCl中，加入二苯胺试剂够震荡，观察颜色变化。×沸水浴7．将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液×研磨后DNA在滤液8．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀×DNA在研磨液中——为除去细胞结构等杂质9．鉴定粗提取的DNA时，对照组与实验组的区别是加不加二苯胺试剂

×自变量：有无加入DNA10.使用二苯胺试剂能有效测定不同提取液中DNA的纯度差别

×二苯胺颜色深浅反映DNA的量≠DNA的纯度【看提取物颜色】

11.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加。×12.用EcoRV(-GAT↓ATC-)切割产生的片段和SmaI(-CCC↓GGG-)切割产生的DNA片段可以相连接

√

T4DNA连接酶连接平末端时，对两侧序列没要求。检检1.DNA粗提取的原理？①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。②DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，在2mol/LNaCl溶液中溶解度最大。2.DNA鉴定的原理？在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色。3.实验中向研磨液中加入95%的冷酒精析出DNA，依据的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等其他物质溶于酒精。4.预冷酒精优点是①抑制DNA水解酶的活性，防止DNA降解；②降低分子运动，易于形成沉淀_析出_③利于增加DNA柔韧性，减少_DNA断裂。5.获取目的基因和切割载体时，通常使用同一种限制酶，目的产生相同的末端，便于连接。但是使用该方法的缺点是容易发生①目的基因自身环化

②质粒自身环化

③目的基因和质粒反向连接。为了避免上述情况的发生，可采取的措施是：分别用两种限制酶去切割目的基因和载体。6.