玉米秸秆低温高效降解菌剂制备技术规范

1玉米秸秆低温高效降解菌剂制备技术规程本文件规定了玉米秸秆低温高效降解菌剂制备的菌种混合发酵、菌剂制备配方、菌剂保藏方式等技术要求。本文件适用于玉米秸秆低温（4℃~15℃)降解菌剂的制备。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB20287-2006农用微生物菌剂GB/T23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定QB/T2583-2003纤维素酶制剂DB15/T2770-2022玉米秸秆低温高效降解菌选技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1活菌计数viablecount在规定的培养条件下，测定细菌悬液、染菌载体等样本中含有的活菌数量。通过计算长成的单个菌落数，而得到单位体积菌悬液中或染菌载体上的存活试验菌菌数。3.2吸光值opticaldensity光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收的能量，特定波长下，同一被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。被检测物吸收的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示，1OD=log10（1/trans其中trans为检测物的透光率T值。3.3纤维素酶cellulase能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和纤维二糖酶3个主要组分。3.42木聚糖酶xylanase木聚糖水解酶是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界的木聚糖类半纤维素。1g固体酶或mL液体酶，在温度50±0.1℃、pH4.8条件下，每分钟催化分解底物木聚糖产生1μmol木糖的量为一个酶活力单位，以U/mL或U/g表示。3.5木质素过氧化物酶ligninperoxidase木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。可在木素聚合物内形成自由基，使键稳定变差从而破坏木质素大分子。3.6锰过氧化物酶manganeseperoxidase一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶类，能有效的降解木质素。3.7漆酶laccase一种含四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶，以单体糖蛋白的形式存在。4菌剂制备流程4.1菌种选择选取秸秆降解能力强的菌株，选择标准见表1。本标准选取菌株为Bacilluscereus、Bacillussubtilis、Pseudomonas、Alcaligenesfaecalis、Pseudomonasputida和Acinetobacterlwoffii等6株细菌。表1玉米秸秆降解菌筛选指标项目数值范围纤维素酶活性（U/mL）木聚糖酶活性（U/mL）木质素过氧化物酶活性（U/L）锰过氧化物酶活性（U/L）漆酶活性（U/L）秸秆失重率（14天）4.2菌种菌龄确定将单菌在种子培养基中活化，接种于活菌计数培养基中，选择菌种处于对数生长期且活菌数最多时期，即可作为种子液进行扩繁发酵的最佳时期，要求单菌OD值≥1，单菌活菌数≥10×107CFU/g。4.3菌液发酵时间确定6株菌等体积比例混合后接种于发酵培养基中，选择菌液活菌数最多、浓度较大、溶氧较低、pH3值相对稳定（接近中性）时期，作为适宜发酵时间，指标详见表2。4.4发酵液离心发酵液在4℃、11292g条件下离心5分钟，每50ml发酵液的沉淀质量约为1g(1g：离心后湿沉淀物的质量)。4.5菌剂配方发酵液沉淀与填料（吸附剂与保护剂统称）设置重量比为1:8、1:6、1:4共3个梯度。填料设置三种调配方式，分别为单独使用、两两组配和三种混合配比。其中两两组配时，每种组配方式（即玉米秸秆外皮粉：淀粉、玉米秸秆外皮粉：麸皮和淀粉：麸皮）的配比设置1:1、1:2、1:3、3:1、2:1共5个比例；三种混合配比时，吸附剂：保护剂及两种保护剂（淀粉：麸皮）间的配比也设置为上述5个比例，。以冷冻干燥后菌剂活菌数为指标确定菌剂最佳配方，计算方法参照附录A。4.6干粉菌剂制备将发酵菌液（菌体质量约为1g/40ml，菌含量≥1×10CFU/ml配以不同比例灭菌后的载体和保护剂，在冷冻干燥机中冻干，制备成粉状菌剂。4.7菌剂保藏条件将含水量为5%、15%、25%、35%的菌剂，均包装为真空密封和普通密封，并分别置于冷藏（4℃)和室温（25℃,空调控温）两种温度条件下保藏，定期测定菌剂活菌数存活率，计算方法参照附录A。表2菌液发酵及菌剂制备指标项目数值范围混合菌液OD值混合菌液活菌数≥1×1010CFU/g混合菌液溶氧量≤20%混合菌液pH值7~8冷冻干燥菌剂活菌数≥1×1010CFU/g活菌数存活率大于等于90%4.8菌剂秸秆降解效果将上述制备的菌剂采用纱网袋法，将培养盒置于15℃恒低温培养箱并保持土壤含水量为25%，秸秆配施菌剂40d后验证菌剂对玉米秸秆的降解效果，降解率达到表3。秸秆降解率参照附录A。4.9酶活性测定菌剂酶活性参照附录B执行。表3玉米秸秆降解效率指标项目数值范围滤纸酶活性（U/mL）β-葡萄糖苷酶活性（U/mL）内切酶（U/mL）外切酶（U/mL）4木聚糖酶活性（U/mL）木质素过氧化物酶活性（U/L）锰过氧化物酶活性（U/L）漆酶活性（U/L）秸秆失重率（40天）1玉米秸秆低温高效降解菌剂制备A.1仪器设备博讯洁净工作台、高压蒸汽灭菌锅、紫外分光光度计（IMPLENP330）、发酵罐（带pH电极和溶氧电极）、高速冷冻台式离心机、电热恒温水浴锅、恒温培养箱、恒温震荡培养箱、移液器，磁力搅拌器，恒温干燥箱、电子天平(精确值0.001g)、恒温干燥箱、纤维素分析仪（ANKOMA200i）。A.2培养基活菌计数培养基：LB琼脂培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，琼脂15g）。种子培养基和发酵培养基：LB液体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L初始pH为自然值（6.65±0.15）。培养基均在使用前于高温灭菌锅中121℃灭菌20min。A.3活菌数计数方法定期取菌液或干粉菌剂，采用稀释涂布计数，测定活菌数，3次重复。具体为，将1g干粉菌剂倒入10-1的三角瓶无菌水中，震荡20-30min，用1ml无菌吸管移取至10-2无菌水中，照此一直将菌悬液稀释到10-8，或将菌液按10-1,10-2,10-3，…10-8梯度稀释（每做一个稀释梯度都必须换一支枪头，上述操作保持无菌操作），依次将10-8-10-2的1ml稀释液接入活菌计数培养基中，于28℃恒温培养箱中培养2-3天，取出计数，每稀释梯度3次重复。每1g干粉菌剂或1ml菌液中的活菌数=同一稀释三次重复的平均菌落数×稀释倍数。A.4OD值测定使用紫外分光光度计（IMPLENP330）测定种子液和发酵液的生长曲线（吸光值，OD600nm），3次重A.5发酵液pH值和溶氧测定发酵液的pH和溶氧量（DO）通过发酵罐的pH电极和溶氧电极进行监测。A.6菌剂活菌存活率菌剂活菌存活率（%）=保藏期活菌数/初始活菌数×100%。A.7秸秆降解率的测定试验所用培养盒规格为10cm×10cm×12cm（盆底直径×盆口直径×盆高每盒装土800g，土壤总高度为10㎝，于中部（5㎝）放入8g玉米秸秆，菌剂施用量按照大田玉米秸秆还田量为800kg/667m2配施菌剂1kg的配比比例，确定每包秸秆8g，配施菌剂0.01g，同时配施磷酸铵0.2g，尿素0.1g。秸秆降解率（%）=（W0-W1）/W0×100%[23]式中：W0表示降解前的玉米秸秆重（gW1表示降解后剩余秸秆重（g）。A.8秸秆成分的测定2将降解后的秸秆烘干粉粹后过1mm筛，按照纤维素分析仪（ANKOMA200i）的方法测定样品纤维素、半纤维素和木质素含量，折算得各成分