DB43-T 2412-2022鸡冷冻精液制作技术规程

ICS65.020.30

CCSB43

43

湖南省地方标准

DB43/T2412—2022

鸡冷冻精液制作技术规程

Codeofpracticeformakingroosterfrozensemen

2022-07-08发布2022-10-08实施

湖南省市场监督管理局发布

DB43/T2412—2022

目次

前言························································································································Ⅲ

1范围·····················································································································1

2规范性引用文件······································································································1

3术语和定义············································································································1

4准备·····················································································································1

5精液采集与品质检测································································································2

6细管精液制作·········································································································2

7细管精液冷冻·········································································································3

8细管冷冻精液解冻及活力检测····················································································3

9细管冷冻精液保存及解冻应用····················································································4

附录A（资料性）主要器具与耗材················································································5

附录B（规范性）冷冻精液用液配制与保存····································································6

附录C（资料性）精子密度估测方法示例·······································································7

附录D（资料性）精子活力评判方法·············································································8

附录E（资料性）液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例·····················································9

附录F（资料性）解冻精液应用及输精效果检测····························································10

参考文献··················································································································11

I

DB43/T2412—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由湖南省农业农村厅提出。

本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：湖南省畜牧兽医研究所、全国畜牧总站、浏阳市农业发展事务中心、湖南光大牧

业科技有限公司、浏阳市湘依园生态农业有限公司、湖南陶氏生态禽业科技发展有限公司。

本文件主要起草人：燕海峰、李安定、朱芳贤、宋武、白文娟、李闯、赵晓、张旭、刘伯承、黄璇、

邓萍、伍国强、江为民、冯小花、文平、刘海林、朱斌、陶金彪。

III

DB43/T2412—2022

鸡冷冻精液制作技术规程

1范围

本文件规定了鸡冷冻精液制作的准备、精液采集与品质检测、细管精液制作、细管精液冷冻、细管

冷冻精液解冻及活力检测、细管冷冻精液保存及解冻应用。

本文件适用于鸡细管冷冻精液的制作。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T30396牛冷冻精液包装、标签、储存和运输

NY/T1234牛冷冻精液生产技术规程

NY/T3458种鸡人工授精技术规程

NY/T4047家禽精液品质检测方法

3术语和定义

NY/T3458、NY/T4047界定的术语和定义适用于本文件。

4准备

4.1器具与耗材

4.1.1主要器具与耗材准备见附录A。

4.1.2细管标示按NY/T1234的规定执行，其中制作单位名称标示，采用习惯字母、英文或者拼音首

字母。

4.1.3重复使用的器具，使用后立即用清水浸泡。器具清洗和消毒操作按NY/T1234与NY/T3458的

规定执行。

4.1.4细管、细管搓板、细管承载泡沫框等细管精液制作用具使用前置于2℃～5℃保温箱中，温度平

衡后待用。

4.1.5水浴解冻保温箱中加入清洁自来水,水深大于10cm，放入冰袋或者冰块，保持水温为2℃～

5℃。

4.2用液

4.2.1按照附录B配制所有用液。

4.2.2所有用液使用前置于2℃～5℃操作保温箱中，温度平衡后待用。

4.2.3所有用液与精液吸取前应摇匀。

1

DB43/T2412—2022

4.3公鸡挑选与训练

按NY/T3458规定执行。

4.4操作环境

4.4.1操作环境应避免污染。

4.4.2冷冻精液制作室环境温度为20℃～25℃。

5精液采集与品质检测

5.1精液采集前准备

5.1.1根据所采公鸡数量准备规格为5mL的离心管。

5.1.2每只离心管中移入0.2mL稀释液（I液）。

5.2精液采集与稀释

5.2.1手握加热已移入稀释液（I液）的离心管，采用双人或单人背腹式按摩采精法采集精液，收集

无污染、纯净精液，轻轻摇匀，置于2℃～5℃采精保温箱中。依次采集完所有公鸡精液，存于采精

保温箱带回。

5.2.2在冷冻精液制作室外，将精液从采精保温箱中转移至2℃～5℃操作保温箱中。

5.2.3自采集精液开始计时，宜在30min时开始细管精液制作。如果远距离采集精液，采集后用稀释

液（I液）等比稀释，存放于2℃～5℃保温箱中尽快带回，应在精液采集后4h内完成冷冻精液制作。

5.3精液品质检测

5.3.1将显微镜温度设置在32℃，按照NY/T4047的方法检测精液品质。不同精子密度样品图示见

附录C。精子活力判定见附录D。

5.3.2用于冷冻的精液应符合下列要求：

a）精子密度不小于15亿个/mL；

b）精子活力不低于70％或有效精子数不少于10.5亿个/mL。

6细管精液制作

6.1液氮添加

至少在细管冷冻前10min，将液氮倒入细管熏蒸泡沫箱等容器，液氮深度3cm～4cm。

6.2冷冻保护液添加

6.2.1按照精子密度7.5亿个/mL、甘油最终浓度6％的冷冻精液制作要求，根据5.3检测的精子密度，

选择甘油浓度适宜的冷冻保护液（II液）并计算添加量。

6.2.2按计算量添加2℃～5℃的冷冻保护液（II液），在2℃～5℃条件下平衡10min，准备灌装。

6.3精液灌装

6.3.1人工灌装

2

DB43/T2412—2022

6.3.1.1握住细管精液棉塞端，另一端插入待灌装的精液中，分2次吸取精液，细管中间段留约1cm

空气柱。

6.3.1.2擦干细管外壁残留液体，用热熔、超声波或封口粉封口，存放于2℃～5℃操作保温箱中。

6.3.1.3采用封口粉封口时，细管端含封口粉2mm，擦净细管外壁残留粉末。封口粉应根据需要量现

取现用，防止污染。

6.3.2机械自动灌装

使用全自动细管精液灌装机灌装时，按操作说明书进行操作。

7细管精液冷冻

7.1液氮熏蒸法

7.1.1将厚度为1cm的细管承载泡沫框套入细管搓板并置于搓板底部。

7.1.2以细管棉塞端指向操作者的方向，将细管铺放在细管搓板上。如需防止细管滑动或便于分组标

记，则在细管棉塞端黏贴无纺布医用胶带形成细管带，胶带黏贴应既牢固，又利于浸入液氮后细管之间

或胶带与细管间的剥离。

7.1.3平行抬起细管承载泡沫框，将细管从细管搓板整体转移至细管承载泡沫框上。冷冻装置与细管铺

放示例见附录E。

7.1.4将载有细管的细管承载泡沫框叠加于厚度为3cm～5cm的泡沫框上，浮于已注入液氮的熏蒸泡

沫箱液氮面上，细管带离液氮面距离4cm～6cm。盖上泡沫箱盖，静置5min后将细管带迅速浸入液

氮中。

7.2程序冷冻仪法

7.2.1将细管架置于冷冻室，以-7℃/min速率从5℃下降到-35℃，再以-60℃/min速率从-35℃

下降到-140℃，于-140℃停留10min，将细管立即浸入液氮中。

7.2.2其他操作按仪器操作说明书进行。

8细管冷冻精液解冻及活力检测

8.1精液解冻

8.1.1将冷冻细管精液从液氮中取出，迅速浸入2℃～5℃水浴解冻泡沫箱中水浴1min～3min，取

出擦干细管表面水分。解冻大批量细管精液时，应及时搅动细管，避免细管瞬间被冰包裹而影响解冻效

果。

8.1.2剪掉封口端，用推针从棉塞端将精液推至规格为2mL的离心管中。解冻大批量细管精液时，可

同时剪掉多支细管棉塞端，使精液自然流出，并吹出管内余液。细管精液解冻后立即置于2℃～5℃

保温箱中。

8.2精子活力检测

8.2.1用于精子活力检测的细管冷冻精液，应已在液氮中保存15min以上，精液解冻按8.1操作。

8.2.2按5.3.1检测精子活力，不低于40％为合格。

3

DB43/T2412—2022

9细管冷冻精液保存及解冻应用

9.1每批次细管冷冻精液应按10％比例随机抽样，按8.2检测精子活力，抽检样品全部检测合格判定

为批次检测合格。批次检测合格的冷冻精液继续保存，如细管上有胶带则应在液氮中将胶带去除。批次

检测不合格的冷冻精液不再保存，进行无害化处理。

9.2合格冷冻精液的包装、标签、储存和运输应符合GB/T30396的规定。

9.3解冻精液应用及输精效果检测见附录F。

4

DB43/T2412—2022

附录A

（资料性）

主要器具与耗材

A.1温度可调恒温显微镜（20倍物镜）。

A.2程序冷冻仪。

A.3便携式低速冷冻离心机（10mL,1000×g,30kg）。

A.4超低温温度计（直径0.5mmT型热电偶探头）。

A.5恒温干燥箱。

A.6细管搓板（长17cm、宽9cm、高6cm）。

A.7液氮罐2个（每个容量10L以上）。

A.8长柄镊子2把、中柄镊子2把、剪刀2把、细管推针2根、插线板2个。

A.9自配稀释液设备：

——渗透压测定仪；

——酸度计；

——高压灭菌锅；

——超净工作台；

——磁力搅拌仪；

——石英蒸馏水器。

A.10液氮熏蒸法冷冻装置:

——液氮熏蒸泡沫箱，深不小于25cm，厚4.5cm，长、宽大于细管承载泡沫框；

——细管承载泡沫框，1cm厚2个，4cm厚1个，框外径14.5cm×25.0cm，厚1.8cm。

A.112℃～5℃采精保温箱、操作保温箱。

A.122℃～5℃水浴解冻保温箱（长30cm、宽30cm、高20cm）。

A.130.25mL细管。

A.14封口粉。

A.15医用无纺布透气纸胶带、布胶带、拇指管、拇指管袋、棉线。

A.16标签纸，卫生纸，记号笔，冰袋。

A.172mL、5mL、10mL离心管盒及相应离心管。

A.1810μL、200μL、1mL移液枪及相应枪头。

A.19载玻片、盖玻片。

A.20精液稀释液。

A.21液氮。

5

DB43/T2412—2022

附录B

（规范性）

冷冻精液用液配制与保存

B.1稀释液（I液）配方

稀释液（I液）配方见表B.1。

表B.1稀释液（I液）配方

每100mL稀释液

试剂中文名称试剂英文名称或分子式

（I液）用量

葡萄糖（一水）Glucosemonohydrate0.530g

柠檬酸钾（一水）Potassiumcitratetribasicmonohydrate0.102g

L-谷氨酸钠（一水）L-Sodiumglutamate.H2O1.210g

乙酸鎂(四水)Magnesiumacetatetetrahydrate0.064g

BES（N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸）N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulphonicacid2.430g

氢氧化钠NaOH0.185g

B.2配制方法

B.2.1稀释液（I液）

称取表B.1中试剂定容到100mL，稀释液（I液）pH为7.1，渗透压为320mOsm/kg。

B.2.2冷冻保护液（II液）

B.2.2.112％甘油冷冻保护液（12％甘油II液）

取稀释液（I液）44mL加甘油6mL，磁力搅拌30min以上。

B.2.2.218％甘油冷冻保护液（18％甘油II液）

取稀释液（I液）41ml加甘油9mL，磁力搅拌30min以上。

B.2.3清洗液（III液）

可直接使用稀释液（I液），也可自配或购买专用清洗液。

B.2.4重悬液（IV液）

可直接使用稀释液（I液），也可自配或购买专用重悬液。

B.3保存方法

2℃～5℃或-20℃以下保存。2℃～5℃条件下保存不应超过24h，冷冻保存的用液解冻后不

应二次冷冻。

6

DB43/T2412—2022

附录C

（资料性）

精子密度估测方法示例

精子密度估测方法示例见图C.1。

a）精子密度40亿个/mLb）精子密度20亿个/mL

c）精子密度10亿个/mLd）精子密度5亿个/mL

图C.1精子密度估测方法示例

7

DB43/T2412—2022

附录D

（资料性）

精子活力评判方法

精子活力九级评判方法见表D.1。

表D.1精子活力九级评判表

活力等级（％）102030405060708090

运动精子数量极少量少量部分较多较多大部分大部分几乎所有所有

摆动/直线运动摆动摆动摆动摆动+直线直线直线直线直线直线

运动速率几乎无很慢很慢一般较快较快快速快速快速

位移大小没有极小较小较大较大较大很大很大很大

8

DB43/T2412—2022

附录E

（资料性）

液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例

液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例见图E.1。

a）将细管承载泡沫框套入细管搓板b）将细管铺放在搓板

c）粘贴无纺布胶带d）细管承载转移与冷冻

图E.1液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例图

9

DB43/T2412—2022

附录F

（资料性）

解冻精液应用及输精效果检测

F.1解冻精液应用

F.1.1冷冻离心机温度设置

F.1.1.1离心管装入体积与温度均相当于待离心样品的自来水，置于离心机转子中，根据环境温度高

低，设置离心机腔温度-10℃～2℃，以600×g离心10min，运行1轮～2轮。

F.1.1.2用线径0.5mm热电偶电子温度计快速检测离心管中水温，温度2℃～5℃。温度不符合要

求时重新设置离心机腔温度再进行调试。

F.1.2解冻精液稀释

在解冻后精液（见8.1）中加入清洗液（III液）进行稀释。按解冻后精液与清洗液（III液）比

例分别为1∶0.035、1∶0.09、1∶0.165、1∶0.3、1∶0.62和1∶0.79的要求，分6次、每次间隔2min

加入清洗液（III液），最终比例为1∶2。

每次加入后都应轻轻混匀。

示例：当解冻后精液体积为1mL时，加入清洗液（III液）的体积与比例依次为35μL（1∶0.035）、90μL（1∶

0.09）、165μL（1∶0.165）、300μL（1∶0.3）、620μL（1∶0.62）和790μL（1∶0.79），添加清洗

液（III液）总体积为2mL。

F.1.3离心、重悬去除甘油

F.1.3.1将稀释后精液（见F.1.2）以600×g离心10min，用移液枪彻底吸除上清。

F.1.3.2加入与解冻后精液（见8.1）等体积的重悬液（IV液）重悬沉淀，混匀，以600×g离心10min，

用移液枪彻底吸除上清。

F.1.4精液使用

在去除甘油的解冻精液（见F.1.3）中加入与解冻后精液（见8.1）等体积的重悬液（IV液）重悬

沉淀，存放于2℃～5℃保温箱或冰水混合物杯中，立即用于输精。

F.2输精效果检测

F.2.1在16:00以后，每只母鸡输精0.2mL（有效精子数不少于4千万个），输精深度4cm。

F.2.2前2d每天输精1次，随后每72h输精1次，总输精次数一般为5次。

F.2.3第一次输精24h后开始收集种蛋，最后一次输精后第4d停止收集种蛋。

F.2.4收集的种蛋按GB/T40454规定的方法进行孵化。按NY/T823给出的方法，检测、计算种蛋的

受精率、受精蛋孵化率。

F.2.5种蛋的受精率、受精蛋孵化率、冷冻精液精子活力等数据可用于冷冻精液精子活力与冷冻精液

孵化效果的相关性分析。

10

DB43/T2412—2022

参考文献

[1]GB/T40454家禽孵化良好生产规范

[2]NY/T823家禽生产性能名词术语和度量计算方法

11

DB43/T2412—2022

目次

前言························································································································Ⅲ

1范围·····················································································································1

2规范性引用文件······································································································1

3术语和定义············································································································1

4准备·····················································································································1

5精液采集与品质检测································································································2

6细管精液制作·········································································································2

7细管精液冷冻·········································································································3

8细管冷冻精液解冻及活力检测····················································································3

9细管冷冻精液保存及解冻应用····················································································4

附录A（资料性）主要器具与耗材················································································5

附录B（规范性）冷冻精液用液配制与保存····································································6

附录C（资料性）精子密度估测方法示例·······································································7

附录D（资料性）精子活力评判方法·············································································8

附录E（资料性）液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例·····················································9

附录F（资料性）解冻精液应用及输精效果检测····························································10

参考文献······································································