实验室检测方法的确认及验证

内容三、食品微生物检测方法的确认与证实二、食品微生物检验的外部质量控制和内部质量控制一、涉及食品微生物检验的质量控制规范食品微生物检验的质量控制

一、涉及食品微生物检验的质量控制规范质量手册程序性文件作业性文件格式文件（质量控制、表格、报告……）原则一类活动一项活动证据证实文件支持文件纲领性文件实验室质量管理体系架构图一级文件二级文件三级文件标准、规范、规程、指南、要求、操作规程、通行惯例等

ISO7218:2007Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Generalrequirementsandguidanceformicrobiologicalexaminations

SN/T0330-2012出口食品微生物学检验通则（IDTISO7218:2007）

GB4789.1-2010食品安全国家标准食品微生物学检验总则

CNASCL09-2012检测实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明

ISO11133Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Guidelinesonpreparationandproductionofculturemedia.Part1:GeneralguidelineonqualityassuranceforthepreparationofculturemediaofculturemediainthelaboratoryPart2：Practicalguidelinesonperformancetestingofculturemedia

SN/T1538-2005&2007培养基制备指南（MODISO11133）

GB4789.20食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂质量控制方法（MODISO11133）（征求意见稿）

WS/T232-2002商业性微生物培养基质量检验规程

ISO22174:2005Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs–Polymerasechainreaction(PCR)forthedetectionoffood-bornepathogens–Generalrequirementsanddefinitions

SN/T2102.1-2008食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义（MODISO22174:2005）

ISO/TS20836:2005Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs–Polymerasechainreaction(PCR)forthedetectionoffood-bornepathogens–Performancetestingforthermalcyclers

SN/T2102.2-2008食源性病原体PCR检测技术规范第2部分：PCR仪性能试验要求（MODISO/TS20836:2005）

ISO20838:2006,Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Polymerasechainreaction(PCR)forthedetectionoffood-bornepathogens—Requirementsforsamplepreparationforqualitativedetection

SN/T2102.3-2008食源性病原体PCR检测技术规范第3部分：定性检测方法样品制备要求（MODISO/TS20837:2006）

ISO20838:2006,Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Polymerasechainreaction(PCR)forthedetectionoffood-bornepathogens—Requirementsforamplificationanddetectionforqualitativemethods

SN/T2102.4-2008食源性病原体PCR检测技术规范第4部分：定性检测方法扩增和检测要求（MODISO/TS20838:2006）

WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

SN/T1193-2003基因检验实验室技术要求

ISO/TS19036:2006Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs–Guidelinesfortheestimationofmeasurementuncertaintyforquantitativedeterminations

SN/T食品和动物饲料微生物学——微生物定量检测的测量不确定度的评估指南（待发布）

EA-04/10AccreditationinMicrobiologicalLaboratories

GB/T27405-2008实验室质量控制规范食品微生物检测

ISO8261:2001Milkandmilkproducts--Generalguidanceforthepreparationoftestsamples,initialsuspensionsanddecimaldilutionsformicrobiologicalexamination；

SN/T2552.2-2010乳及乳制品卫生微生物学检验方法第2部分：检验样品的制备与稀释

ISO6887-1:1999Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs--Preparationoftestsamples,initialsuspensionanddecimaldilutionsformicrobiologicalexamination——Part1:Generalrulesforthepreparationoftheinitialsuspensionanddecimaldilutions；

——

Part2:Specificrulesforthepreparationofmeatandmeatproducts；

——Part3:Specificrulesforthepreparationoffishandfisheryproducts；

——Part4:Specificrulesforthepreparationofproductsotherthanmilkandmilkproducts,meatandmeatproducts,andfishandfisheryproducts；

WHO《实验室生物安全手册》（第三版）

GB50346-2011生物安全实验室建筑技术规范

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

WS233-2002微生物和生物医学实验室生物安全通用准则

YY0569-2005生物安全柜

国务院第424号令：《病原微生物实验室生物安全管理条例》

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

WS/T367-2012医疗机构消毒技术规范

SN/T2660-2010食品微生物实验室菌种保藏方法

SN/T2632-2010微生物菌种常规保藏技术规程

USAFSIS《MicrobiologyLaboratoryGuidebook》：CHAPTER36.Equipmentcalibration,maintenance,andperformanceverification

《微生物实验室检测指南》（中国农业科学技术出版社，ISBN978-7-80233-266-9）

《人间传染的病原微生物名录》《病原微生物实验室生物安全管理条例》第一类病原微生物第二类病原微生物第三类病原微生物第四类病原微生物生物安全1级微生物生物安全2级微生物生物安全3级微生物生物安全4级微生物WETHEYWHO、EU、USACDC…为了确保测量结果具有溯源性、可比性、可靠性和有效性等，食品微生物检验质量控制措施原则上要求覆盖“重要”/“高风险”测试项目的所有环节，管理层所采取的质量控制是在“技术可行性”

、“成本控制”和“风险”

之间的一种平衡。实验室/操作者/程序时间空间溯源性可比性可靠性有效性二、食品微生物检验的外部质量控制和内部质量控制物类检测状态仲裁一般危险标识、档案校准状态标记期间核查公认自制企业标准等合同评审样品处置分包采购检测报告编制审批归档合同管理样品管理通知客户与限量标准比较人员管理设备管理检测方法环境条件报告管理档案管理量值溯源资质考核，持证上岗持续培训，提高素质实验室能力评审合同评审样品标识样品接收样品制备样品管理配备率校准使用维护作业指导书标准方法证实非标准方法确认有效监控记录内务管理溯源至SI证书要求参考标准、RM管理报告应与原始记录一致信息量充足审核签署受控存放保密方便取阅质量控制是质量管理的一个组成部分，其是任何一个试验室的关键工作措施，必须保证：

重视客户的要求；

不断提高；

第一次就要做到正确操作；

集体行动；

领导重视；

建立机构内外的监督机制。质量控制可分为外部质量控制和内部质量控制。内部质量控制外部质量控制能力验证实验室间比对测量审核人员比对留样再测仪器比对方法确认与验证期间核查盲样测试方法比对实验室内质控

自我控制

发现随机误差和新出现的系统误差

评价分析质量的稳定性是分析的基础、必需、常规。实验室间质控

外部质控

发现系统误差和实验室间数据的可比性

评价实验室的测试系统和分析能力

有效的校核是参加与标准实验室的比对

实验室间比对：按照预先规定的条件，由两个或多个实验室对相同或类似检测物品进行检测的组织、实施和评价。

ISO13528Statisticalmethodsforuseinproficiencytestingbyinterlaboratorycomparisons

GB/T28043-2011利用实验室间比对进行能力验证的统计方法

能力验证：利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力。

CNAS-CL03《能力验证提供者认可准则》（IDTISO/IEC17043）

CNAS-GL02《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》

CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》

CNAS-RL06《能力验证提供者认可规则》

CNAS-AL07《能力验证领域和频次表》

CNAS-RL02《能力验证规则》1、食品微生物检验外部质量控制措施

测量审核：一个参加者对被测物品(材料或制品)进行实际测试，其测试结果与参考值进行比较的活动。

注1：测量审核是对一个参加者进行“一对一”能力评价的能力验证计划。测量审核相当于“小能力验证”。注2：测量审核是将参加实验室的结果与参考值进行比对和判断，该参考值由参考实验室提供，通常由国家测量机构提供，也可能由其他经济体的国家标准实验室提供。

CNAS-PD22《测量审核程序

》检测实验室（组织）取样样品处理检验检疫结果处理分包测量过程测量资源方法人员设施设备环境材料质量调节质量评定测量系统测量要求测量结果控制

测量结果的质量来源于测量过程，所以对测量结果质量的控制关键在于控制测量过程,

而对测量过程的控制主要来自于对过程中所使用测量资源的控制。2、食品微生物检验内部质量控制措施测人机环料法人员档案人员(5.2)设备(5.5)、测量溯源性(5.6)样品(5.8)、耗材(4.6)抽样(5.7)、方法和方法确认(5.4)实施和环境(5.3)人机料法环授权人员人员描述培训目标5类人能力人员监督在培人员监督运输贮存设备档案校准溯源参考标准采购供应商期间核查标准物质状态标识维护保养样品处置样品制备样品接收状态样品贮存样品标识标准方法实验室方法数据控制抽样(统计)非标方法方法确认不确定度评定监测、控制记录人员隔离环境实施设备区域隔离内务管理正确性不确定度可靠性测检测结果方法验证仪器设备料（培养基、试剂、标准物质、试剂盒、诊断试剂）人环境监测、记录和报告检测检测检测陕西省食品药品检验所2009年10月10日质控点分布表对“方法控制”的质量控制要求方法查标准方法一览表采用何种途径确认确认了哪些内容是否批准是否通知客户典型项目有无范例有无测量不确定度评定程序是否便于查阅查七个环节的执行记录有无计划、程序查使用哪些公认非标方法有无行业、地方标准目录有无国际、国家标准目录查方法确认记录确认范围是否准确有无自制方法有无制定开展新工作评审程序自编软件是否验证并足够详细文件化查数据控制程序对计算和数据转换是否有适当核查是否经过评审有无方法偏离查作业指导书清单是否现行有效对“人员管理”的质量控制要求人员查资质确认资料查对在培人员的监督记录查岗前培训记录上岗证是否在现场可随时提供临时人员，额外技术人员有无考核、签约关键人员是否有当前工作描述四类人员是否授权七方面内容是否描述齐查保密要求及监督记录查人员一览表有无流动编制是否按岗位职责配备胜任人员是否便于查阅内容是否齐全人员技术业绩档案是否集中管理有无人员培训程序资料是否归档有无教育培训目标有无教育培训计划有无培训证明考核资料对“检测设备控制”的质量控制要求检测设备查设备维护记录查是否在校准有效期内查有无自校准规程、是否完整、正确，是否经确认、批准，校准人员资格，校准环境属限定范围内使用的设备查是否明确标明准用范围查设备状态标识、规格和精度是否适宜核查校准证书核对设备控制程序查操作人员对指导书的熟悉程度对使用外部设备、脱离永久控制的设备有无规定，有无期间核查程序，有无设备发生故障时的控制要求查设备档案内容是否齐全是否提供校正因子抽查有关检测原始记录是否使用最新校正因子查有无设备操作指导书修理后校准记录查维修保养记录设备使用环境是否符合要求现场测试，验证设备情况查校准设备的校准对“样品控制”的质量控制要求样品样品流转如何控制核对样品清单有无样品唯一标识样品制备有无要求查样品接收登记，有无数量、状态、签收等内容样品制备环境条件是否满足要求样品保存条件是否满足要求环境监控仪器是否经检定、是否运行正常验证有关记录核对样品控制程序样品有无状态标识有无规定留样要求查留样及登记留样是否满足投诉、复验要求查到期样品处理登记对“设施环境控制”的质量控制要求设施环境检查环境条件是否符合要求查环境监控仪器是否满足要求抽查检验原始记录验证环境条件有无进入和使用控制、标识实测试验场地环境效果核对内务管理控制程序使用外部设备时有无对环境控制的要求必要时，查环境监控纪录必要时，是否采取了有效隔离措施核对设备说明书、试验方法、样品要求等验证环境是否满足要求查检测人员对环境管理制度熟悉、执行情况（必要时，注意实验室对有关环保、职业安全等法规执行情况）验证环境监测仪器的校准证书查试验环境是否可能对检测质量造成不良影响对“标准物质控制”的质量控制要求标准物质参考标准是否使用法定计量单位能否溯源到国际、国家标准确定有效期有无依据查标签内容是否符合程序规定有无合格证是否在定值有效期内使用查标准物质清单查标准溶液配制是否符合要求查配制纪录核对相关管理程序查合格供应商清单领用是否控制存放条件是否有要求查合格供应商资料查标准物质领用记录查标准物质存放条件参考标准是否只用于校准是否规定并实施期间核查对“检测记录控制”的质量控制要求检测记录核对文件清单记录表格是否受控是否有文件编号核对记录控制程序是否规定了记录保留时间保存环境是否符合要求是否对电子储存的记录有控制要求是否清晰记录、表格内容是否填写齐全记录更改是否按程序进行非标方法是否形成文件并经审批，非标使用是否经客户同意验证有关记录是否有可识别的任务标识是否记录了检测依据，标准方法选用是否合理记录的检测项目是否完整核对检验方法、标准计算机打印的记录有无明确的标识数据修约是否符合规定是否记录了所使用的仪器核对当日的设备使用记录是否记录了所使用的参考标准、标准物质查相关领用记录是否记录了试验环境状况核对当日环境纪录记录是否包括足够的信息是否有相关人员的签字verificationofmethods方法验证confirmationofmethods方法证实validationofmethods方法确认三、食品微生物检测方法的确认与证实好氧菌总数肠杆菌科大肠菌群粪大肠菌群大肠杆菌沙门氏菌致泻性大肠杆菌金黄色葡萄球菌粪链球菌弧菌科单增李斯特氏菌志贺氏菌芽孢杆菌O157厌氧梭菌弯曲菌1、食品微生物检测方法体系

国内主要检测体系(online)

国家标准(GB)

检验检疫行业标准(SN)

卫生行标(WS)

农业行标(NY)……

国外主要检测体系

国际标准化组织(ISO)

美国食品药品监督局（FDA）(online)

美国官方分析化学师协会(AOAC)

美国农业部（USDA）(online)

加拿大健康署(HPB)(online)

北欧食品分析委员会（NMKL）

美国公共卫生协会(APHA)、法国标准协会(AFNOR)标准、英国国家标准(BS)、日本国家标准(JIS)、韩国国家标准（KS）等

国际标准化组织确认并公布的其他国际组织**

标准方法非标准方法

科学书籍和期刊公布的方法；

实验室研发的未出版的方法；

部分由设备制造商指定的方法；

企业标准；

部分协会标准；

部分地方标准等。检测方法体系定量方法定性方法直接定量/计数方法如：细菌总数*、大肠菌群*、大肠杆菌*、肠球菌*、金黄色葡萄球菌*、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、弯曲菌属、肠杆菌科*、副溶血性弧菌、亚硫酸盐还原梭菌、李斯特氏菌属、霉菌和酵母计数*、嗜冷菌*、乳酸菌、双歧杆菌等间接定量/半定量如MPN法：大肠菌群*、粪大肠菌群*、大肠杆菌*、肠球菌*、金黄色葡萄球菌*、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、肠杆菌科*、副溶血性弧菌、亚硫酸盐还原梭菌等如致病微生物：单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、O157、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、肉毒梭菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、产毒霉菌、禽流感、松材线虫病等

带*者通常被列为食品卫生指示菌方法分类传统直接计数法倾注平板法涂布平板法

可替代方法（Alternative）

定义：

ISO16140:2003：可替代方法指用来检验某一特定产品中某种目标微生物的与相应参考方法等效的方法，如快速检测试剂盒和自动化系统。值得说明的是，并非所有的可替代方法都是标准方法。

GB/T18510-2001《煤和焦炭试验可替代方法确认准则》快速检测方法/可替代方法快速检测方法/可替代方法的分类按方法性质计数方法筛选方法确证方法按自动化程度手工半自动全自动按方法原理酶反应显色以代谢为基础的技术免疫技术色谱技术碳源利用分子生物学诊断微量生化反应及药敏试验http:///standard/5.4.5方法的确认[CNAS-CL01:2006(IDTISO/IEC17025:2005)]

确认是通过检查并提供客观证据，以证实某一特定预期用途的特定要求得到满足。

实验室应对非标准方法、实验室设计（制定）的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法进行确认，以证实该方法适用于预期的用途。确认应尽可能全面，以满足预定用途或应用领域的需要。实验室应记录所获得的结果、使用的确认程序以及该方法是否适合预期用途的声明。2、食品微生物检测方法的确认注1：确认可包括对抽样、处置和运输程序的确认。注2：用于确定某方法性能的技术应当是下列之一，或是其组合：——使用参考标准或标准物质（参考物质）进行校准；——与其他方法所得的结果进行比较；——实验室间比对；——对影响结果的因素作系统性评审；——根据对方法的理论原理和实践经验的科学理解，对所得结果不确定度进行的评定。注3：当对已确认的非标准方法作某些改动时，应当将这些改动的影响制订成文件，适当时应当重新进行确认。

按预期用途进行评价所确认的方法得到的值的范围和准确度，应与客户的需求紧密相关。这些值诸如：结果的不确定度、检出限、方法的选择性、线性、重复性限和/或复现性限、抵御外来影响的稳健度和/或抵御来自样品（或测试物）基体干扰的交互灵敏度。注1：确认包括对要求的详细说明、对方法特性量的测定、对利用该方法能满足要求的核查以及对有效性的声明。注2：在方法制定过程中，需进行定期的评审，以证实客户的需求仍能得到满足。要求中的认可变更需要对方法制定计划进行调整时，应当得到批准和授权。注3：确认通常是成本、风险和技术可行性之间的一种平衡。许多情况下，由于缺乏信息，数值（如：准确度、检出限、选择性、线性、重复性、复现性、稳健度和交互灵敏度）的范围和不确定度只能以简化的方式给出。（1）国内关于食品微生物检测方法确认技术的规范

中华人民共和国卫生部令（第77号）：《食品安全国家标准管理办法》

国家技术监督局令（第10号）：《国家标准管理办法》

卫生部（卫政法发（2010）81号）：《食品安全国家标准制（修）订管理规定》

卫生部（卫监督发〔2011〕17号）：《食品安全地方标准管理办法》

国家质检总局（质检食函〔2011〕398号）：《进出口食品安全风险监控实验室质量控制指南》

国家质检总局（质检食函〔2011〕405号）：《出口动物源性食品安全风险监控实验室质量控制指南》

CNCA:《出入境检验检疫行业标准制（修）订管理工作》

CNCA:《商品化食品检测试剂盒评价规则》

CNCA:《食品化妆品专业化学分析方法验证程序》国内尚无关于食品微生物检测方法确认的可操作的规定和权威范例。智者见智，仁者见仁。

适用范围扩大，确认否？如何确认？确认依据和判据？

GB?SN?WS?NY?……...

SNAOAC

AOAC2003.07:

适用于冷冻千层面、奶油冻、冷冻什锦蔬菜、冷冻洋芋饼和冷冻裹浆蘑菇中金黄色葡萄球菌的计数

AOAC2003.08:适用于冰淇淋、原奶、酸奶、奶酪和乳清粉中金黄色葡萄球菌的计数

AOAC2003.08:适用于熟制和切割的鸡肉、汉堡、三文鱼和香肠中金黄色葡萄球菌的计数

SN/T1895-2007：适用于食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的计数，既适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品也适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品。实例①美国官方分析化学家协会(AOAC)：“AOACInternationalMethodsCommmitteeGuidelinesforValidationofQualitativeandQuantitativeFoodMicrobiologicalOfficialMethodsofAnlysis-2002”；②国际标准化组织(ISO)：ISO/TR13843：2000、ISO/TC34/SC9N593、ISO21187、ISO17994、ISO19036和ISO16140:2003；③NordVal：NV-DOC.D–2005-01-01《Protocolforthevalidationofalternativemicrobiologicalmethods》；④新加坡认可委员会(SAC)：C&BandENV002《MethodValidationofMicrobiologicalMethods》。⑤加拿大健康署：OfficialMethodsForTheMicrobiologicalAnalysisOfMethdsVolume1developmentofmethods(2)国际关于食品微生物检测方法确认技术的规范

美国

USAEPA：MethodValidationofU.S.EPA--MicrobiologicalMethodsofAnalysis；

USAFDA：MethodsValidationGuidelinesforMicrobialPathogens

USDAFSIS：USDAFSISGuidanceforTestKitManufacturers-LaboratoriesEvaluatingthePerformanceofPathogenTestKitMethods

澳大利亚：NATAtechnicalnote17Guidelinesforthevalidationandverificationofquantitativeandqualitativetestmethods，andAS-NZS4659Guidetodeterminingtheequivalenceoffoodmicrobiologytestmethods实例1：ISO16140实例2：ISO6579实例3：CanadaHEALTHPRODUCTSANDFOODBRANCH

ProcedureForTheDevelopmentAndManagementOfFoodMicrobiologicalMethods

Part4:GuidelinesForTheRelativeValidationOfIndirectQualitativeFoodMicrobiologicalMethods4.2.1待确认方法与基准方法比较时，定性方法应达到以下性能指标：

——灵敏度≥98%；

——特异性≥90.4%；

——假阴性率<2%；

——假阳性率<9.6%；

——相对准确度≥94%；

——检测限≤3cfu/25g或mL

～5cfu/25g或mL。4.2.2待确认方法与基准方法比较时，定量方法应达到以下性能指标：

——线性：截距=0，斜率=1(95%的置信区间)；

——选择性：包容性≥98%(30个目标菌株)，排他性≤10%(20个竞争菌株)；

待确认方法与基准方法比较时，需提供二者的重复性值(r)、重复性标准偏差(Sr)、重复性相对标准偏差(RSDr)、再现性值(R)、再现性标准偏差(SR)、再现性相对标准偏差(RSDR)，且在一般情况下，二者没有显著差别。5.4.2方法的选择[CNAS-CL01:2006(IDTISO/IEC17025:2005)]……

所选用的方法应通知客户。在引入检测或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准方法。如果标准方法发生了变化，应重新进行证实。3、食品微生物检测方法的证实

方法证实的目的和意义

确认本实验室具备标准方法所需要的人力和物质资源；

核实标准方法在本实验室的可操作性；

证实标准方法在本实验室条件下具体应用于某一类分析对象能够达到预期的分析目标和要求；

对标准方法在实际使用过程中出现的问题进行改进和完善，形成文件化的作业指导书作为标准方法的补充说明。证实技术ISO/1EC17025-2005中

注2”5.4.1总则[CNAS-CL01:2006(IDTISO/IEC17025:2005)]

实验室应使用适合的方法和程序进行所有检测和/或校准，包括被检测和/或校准物品的抽样、处理、运输、存储和准备，适当时，还应包括测量不确定度的评定和分析检测和/或校准数据的统计技术。

如果缺少指导书可能影响检测和/或校