义翘讲堂《核酸酶及其“全生命周期”的质量控制要点》

核酸酶及其“全生命周期”的质量控制要点北京义翘神州科技股份有限公司核酸酶及其质量控制1核酸酶使用困境2核酸酶的活性检测3核酸酶的残留检测4义翘神州核酸酶系列产品5义翘神州药品生产中核酸酶原料的质量控制核酸酶原料储存稳定性核酸酶工作液稳定性稳定性入厂质控酶工作液活性研究工作液配制工作液稳定性研究同类酶可比性研究原料安全性酶在工艺条件活性评价核酸酶去除工艺研究工艺活性SuperNucleaseELISAKitCat:KIT-SSNP01总酶量残留（工艺杂质）义翘神州总活酶-20℃2-8℃室温存储条件2-8℃室温核酸酶是生产关键原料，核酸酶的质量控制对工艺稳定性和终产品质量至关重要《国家药典委员会关于征求核酸酶残留量检测方法验证意见的函》2023.04.26核酸酶及其质量控制01义翘神州核酸酶SuperNuclease-DNA结构模型短ssDNA核酸酶SaltactiveSuperNuclease-DNA结构模型残留宿主DNA危害：致癌、感染国内疫苗：0.01-10ng/剂治疗性生物制品：10ng/剂单抗注射液：0.1ng/剂国际0.1-10ng/剂,长度<200bp宿主DNA残留控制粘滞沙雷氏菌非特异性核酸酶耐盐/嗜盐非特异性核酸酶（海洋生物）其他（义翘神州可为客户定制开发）降低宿主DNA风险降低料液粘度提高下游层析载量140+核酸酶及突变体库基于需求和结构的理性设计经验单批90+突变体筛选通量义翘神州高聚DNA低盐（50mMNaCl）具有最适活性高盐（500mMNaCl）具有最适活性核酸酶的质量义翘神州检项：性状、鉴别、蛋白质含量、活性、纯度、微生物限度限量控制参数：1）纯度2）比活性指每1mg质量的蛋白质中所含重组胰蛋白酶的活性，应不低于3800U/mg蛋白质3）微生物限度《中国药典》2020版重组胰蛋白酶有效性指标比活性（U/mg）体积活性（U/μL）活性蛋白质含量鉴别核酸酶的关键质量属性优质核酸酶特征：高比活性、低杂质风险、易去除安全性指标纯度微生物限度其他杂质

-内毒素-TritonX-100-抗生素-动物源杂质核酸酶是工艺杂质需要从终产品中去除核酸酶比活性测定义翘神州比活性（U/mg）指单位质量蛋白质的酶活力单位数，通过计算获得。蛋白浓度测定《中国药典》2020版通则0731第四法BCA法80-400μg，受甘油和还原剂影响第五法Bradford法1-200μg蛋白，受TritonX-100影响第六法紫外-可见分光光度法0.2~2mg/mL，需要测定吸收（消光）系数酶活力测定（缺乏统一的方法）特定检测检测温度、反应时间特定缓冲液pH、缓冲液组成、添加剂（金属离子、特定浓度无机盐、表面活性剂等）特定底物浓度、类型、状态（聚集态、子量分布等）特定方法特定条件（酶活力单位定义条件）酶的比活性属酶含量范畴，只在特定条件下数值等同于酶的活性核酸酶使用困境02义翘神州核酸酶的使用困境义翘神州FAQ200/300mMNaCl浓度下耐盐酶和不耐盐酶谁更好？A酶

比B酶

活性更好吗？你们的核酸酶和xxx品牌的有什么差异？可以替换使用吗？我应该加多少酶才能保证宿主残留合格？核酸酶容易去除吗？……DMEM细胞培养液/250mMNaCl,Tris缓冲液等37℃，pH8.5，500mMNaCl

Tris-HCl缓冲液，50mM小牛胸腺DNA检测A260上升1.0的酶量为1U≠工艺条件活性SASNSN如何选择合适的酶？不同来源的核酸酶的酶学性质可能具有显著差异酶的比活性不能直接用于衡量工艺条件下酶的活性义翘神州SASNSNSASNSN真实活性相对活性比活力比活力核酸酶的使用困境相对活性不能作为指导酶使用的依据应依据真实活性选择适宜的酶相对活性核酸酶的使用困境义翘神州困境原因核酸酶工艺条件活性难评估酶活定义条件与工艺条件差异真实底物与酶活测定底物不同高成本使用条件不当过量使用基于宿主残留检测酶活性质控难、同类产品难以比较缺乏高效测活方法缺乏统一标准（方法、定义）核酸酶残活检测现有方法不易用核酸酶活性检测03义翘神州核酸酶测活方法1.0（紫外-可见光分光光度法）高聚双链dsDNA（小牛胸腺DNA、鱼精DNA）当A260(10mm)=1时，dsDNA：50μg/mLssDNA：33μg/mL*GironK.etal.NEBTechnicalNotessDNA3-5nt核酸酶影响因素：测试条件：底物类型和浓度、温度、缓冲液组成检测仪器和容器材质操作：稀释方法、终止方法上市产品采用方法，各家试验细节、定义条件具有差异义翘神州鱼精DNA水甘油高聚底物粘度高难以准确吸取优点：直接检测酶活性，不依赖酶参考品缺点：稳定性、重现性较差核酸酶测活方法2.0（荧光底物法）义翘神州*ThermoScientific:DNaseAlert™QCSystem优点：底物均一性好，板内精密度高；灵敏度高主要问题：无国家/国际标准品，依赖DNaseI酶参考品1）DNaseI稳定性风险2）不同酶间酶学性质差异数据处理复杂需要单独处理每个试验点的酶活曲线核酸酶残留检测04义翘神州核酸酶残留检测方法——ElisaSuperNucleaseELISAKitCat:KIT-SSNP01高线性区间：

46.9-3000pg/mL板间精密度：<10%板内精密度:<5%灵敏度：27.3pg/mLIntra-assayPrecisionInter-assayPrecisionSample123123N202020333Mean(pg/mL)11031420611363732137SD10.916.365.76.712.659.6CV(%)9.9%5.2%3.2%4.9%3.4%2.8%义翘神州核酸酶残留检测方法——酶活义翘神州《国家药典委员会关于征求核酸酶残留量检测方法验证意见的函》

2023.04.23建议使用酶活性残留检测方法检测核酸酶残留推荐使用荧光法法规趋势义翘神州核酸酶系列产品05义翘神州Cat:

GMP-SSNP01Cat:

GMP-SASN-AF义翘神州核酸酶系列产品核酸酶活性检测试剂盒核酸酶定制开发服务核酸酶活性检测服务（特定工艺条件下、稳定性等）基于核酸酶的核酸去除工艺开发服务义翘神州预计2024Q1上市酶质量控制酶残留检测服务基于Elisa的蛋白残留检测SuperNucleaseELISAKitCat：KIT-SSNP01SaltactiveSuperNucleaseELISAKit预计2024Q1上市活性酶残留检测核酸酶活性检测试剂盒SuperNucleaseSaltActiveSuperNuclease义翘神州核酸酶系列产品预计2024Q1上市义翘神州SuperNuclease（SSNP）SaltActiveSuperNuclease（SASN）核酸酶适用条件生理盐高活性中高盐高活性比活力义翘神州提供了主要使用场景全覆盖的两款核酸酶产品生理盐高活性酶SuperNuclease义翘神州SuperNuclease对真实样本宿主核酸去除效果与竞品相当SuperNuclease和Benzonase具有相同的抗原表位，二者Elisa检测试剂盒可通用货号特点GMP-SSNP01高浓度、无甘油GMP-SSNP01-G低浓度、具有甘油GMP-SSNP01-AF高浓度、无甘油、无动物源粘滞沙雷氏菌核酸酶生产未使用抗生素具有无动物源产品GMP级别DMF备案（MF035978）SuperNuclease性能、蛋白特征与进口全能核酸酶相当中高盐高活性酶SaltActiveSuperNuclease义翘神州25℃,pH7.5测试条件：20mMTris-HCl缓冲液，25-37℃，pH7.5-8.5，150-600mMNaCl37℃,pH7.537℃,pH8.5嗜盐菌核酸酶GMP级别未使用动物源原料完全未使用抗生素室温4个月以上稳定高等电点，易去除中高盐条件比活性优于已上市竞品200-600mM比活力比活力比活力SaltActiveSuperNuclease具有自主知识产权，性能领先于同类产品SASN的宿主DNA去除能力义翘神州1.0x107cell/mLCHO细胞破碎液

375

pg酶处理1小时《中国药典》方法检测宿主核酸残留2.5x107cell/mL293细胞浓缩液破碎液

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pg酶处理0.5小时商品化宿主残留检测试剂盒测定等量酶处理细胞破碎液，义翘神州SASN效果优于进口竞品A竞品A（进口）竞品A（进口）核酸酶活性质控方法核酸酶原料储存稳定性核酸酶工作液稳定性稳定性入厂质控酶工作液活性研究工作液配制工作液稳定性研究同类酶可比性研究原料安全性酶在工艺条件活性评价核酸酶去除工艺研究工艺活性残留（工艺杂质）义翘神州总活酶-20℃2-8℃室温存储条件2-8℃室温《国家药典委员会关于征求核酸酶残留量检测方法验证意见的函》2023.04.26可以为核酸酶“全生命周期”服务的合规、稳定、高重现性、易操作的核酸酶活检测方法义翘神州核酸酶活性检测试剂盒将紫外-可见光分光光度法和传统荧光法优势互补，依托国家标准品建立了新型荧光底物检测方法义翘神州方法紫外-可见光分光光度法荧光底物法义翘神州荧光底物法酶活检测直接间接直接参考品无自制DNaseI国家荧光标准品底物多聚DNA均一性差、批间差大单/双链荧光底物均一性高双链荧光底物均一性高、批间差低*灵敏度低高高稳定性一般一般高重现性一般一般高便利性低一般高残留检测&定性限不适用0.5pg（DNaseAlert™QCSystem）0.4pg*所有底物经过特有方法完成结构确认、精确定量&使用DNaseI酶，37℃，30分钟检测，按照药典要求以3倍信噪比定定性限义翘神州核酸酶活性检测试剂盒义翘神州使用国家标准品制作标准曲线线性回归计算酶活简单的操作流程BCA法测蛋白浓度义翘神州核酸酶测活试剂盒酶标仪、qPCR仪、微量荧光光度计均适用像测定蛋白浓度一样，简单的核酸酶活检测方法，半天内可完成方法学确认核酸酶残留检测方法——方法学验证药典项目药典要求荧光法验证报告一、专属性检测杂质对反应的影响5%以内TritonX100和Tween20等表面活性剂；20mM以内HEPES和磷酸盐对反应无影响。*二、准确度回收率：75-120%回收率：97-101%三、精密度重复性RSDr＜8%RSDr:1.9-2.9%中间精密度考察不同时间、人员、设备的精密度差异人间精密度：RSD：0.4-2.1%时间精密度：RSD＜

5%重现性RSDR<16%实验室间RSDR=3.9%四、检测限信噪比3:10.4pmol产物量*五、定量限信噪比10:11.2pmol产物量六、线性应列出回归方程等线性回归，R2>0.996七、范围根据二~六确定1.2-10.1pmol产物量八、耐用性考察测定条件小变动影响底物冻融8次不影响结果5-60分钟操作均符合要求义翘神州产品即将上线，欢迎试用！根据《中国药典》要求完成方法学验证，灵敏度高、稳定性好、重现性高*针对SASN酶活检测试剂盒应用—酶原料活性检定pmol/minx10-3U*0.5521.00.4918.40.3814.70.217.40.113.70.082.5试剂盒可用于酶原料质控、酶稳定性研究等酶原料及溶液的活性质量控制不同浓度竞品A的酶活检测结果*根据竞品A的COA文件数据计算38.6x10-3U的酶在检测条件下的活性是1pmol/min应用场景1：核酸酶活性定量（入厂原料质控、中间品稳定性研究……）酶活检测试剂盒应用—同类产品比较使用试剂盒方法测定计算新酶用量，新酶处理效果与原工艺用酶相当应用场景2：根据A酶用量推算B酶用量酶比活力（x106RFU/mg)蛋白浓度（mg/mL)体积酶活（x103RFU/μL)工艺用酶量（x103

RFU/mL)工艺用酶量（μL酶/L发酵液）A（浓溶液）10840.811485148100B（稀溶液）14090.46958155测定两种酶的体积酶活根据A酶工艺用量（μL/mL）和两种酶体积酶活计算B酶工艺用量酶活检测试剂盒应用—核酸去除工艺优化高效确认工艺变更后核酸酶加量，推动核酸酶相关工艺开发应用场景3：核酸去除工艺条件优化后的工艺确认——酶使用量确认比活力（x106RFU/mg)体积酶活（x103RFU/μL)NaCl

（mM）温度

（℃）吐温-20

（v/v)使用体积(μL/L)31409958500370.5%155834567250370.5%262477324150370.5%45811878075003701848856022503702475293601503704131245846500250.5%175709482250250.5%308349237150250.5%6261078733500250203588400250250371266181150250