DB12T 652-2016 转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种定性检测 实时荧光PCR法

67.050B

23

DB12天 津 市 地 方 标 准DB12/T

652—2016转基因耐除草剂大豆

DAS-68416-4

及其衍生品种定性检测

PCR

法Detection

of

plants

and

—Qualitative

method

herbicide-resistant

soybean

and

derivates2016-09-27

发布 2016-11-01

实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T

652—2016 本标准按照

GB/T

—

给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、李亮、赵新、刘雪岩、宛煜嵩、王成、陈锐、朱珠、刘娜、徐石勇。本标准

年

9

月首次发布。DB12/T

652—2016

DAS-68416-4

PCR

1 范围本标准规定了转基因耐除草剂大豆

DAS-68416-4

转化体特异性的定性

PCR

检测方法的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于转基因耐除草剂大豆

DAS-68416-4

DAS-68416-4

转化体成分的定性

PCR

检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法农业部

1485

4—2010 转基因植物及其产品成分检测

DNA

农业部

2031

8—2013 转基因植物及其产品成分检测

大豆内标准基因定性

PCR

法农业部

2031

19—2013 转基因植物及其产品检测

NY/T

转基因植物及其产品检测

通用要求3 术语和定义农业部

2031

8—2013

界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1Lectin

Lectin

编码大豆凝集素的基因。3.2DAS-68416-4

转化体特异性序列

sequence

DAS-68416-4DAS-68416-4

外源插入片段

5′端与大豆基因组的连接区序列。4 原理根据转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4DNA进行PCR扩增。依据是否扩增获得典型的实时荧光扩增曲线，判断样品中是否含有

5 检测方法5.1

试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合

GB/T

6682

规定的一级水。5.1.1

荧光定量

PCR

反应试剂盒。5.1.2 引物和探针。DB12/T

652—20165.1.2.1

基因。lec-1215F：5′′lec-1332R：5′′lec-1269P：5′′预期扩增片段大小为

（参见附录

A）。5.1.2.2

DAS-68416-4

转化体特异性序列。DAS-68416-4-F：5'-

-

3'：

-

3'：5'

-

3'预期扩增片段大小为

128

（参见附录

A

10

µmol/L需避光保存。5.2 仪器

0.1

g

和

0.1

PCR

仪；其他相关仪器设备。5.3 分析步骤5.3.1 按

NY/T

672

和农业部

2031

号公告—19—2013

规定执行。5.3.2 试样准备按

NY/T

672

和农业部

2031

号公告—19—2013

规定执行。5.3.3 试样预处理按农业部

1485

号公告—4—2010

规定执行。5.3.4 DNA

模板制备按农业部

1485

号公告—4—2010

规定执行。5.3.5 PCR

反应5.3.5.1 标准样品和试样实时荧光

PCR

同时进行标准样品和试样的

PCR

反应，每个

PCR

反应设置

3

次平行。DAS-68416-4

转化体实时荧光

PCR

1

在

PCR

Lectin内标基因实时荧光

PCR

反应按表

2

在

PCR

反应管中依次加入反应试剂，混匀。将

PCR

管放在离心机上，500

g~3

g

离心

10

s

PCR

PCR

荧光

PCR

反应。（反应程序为：94℃变性

5

；进行

45

次循环扩增反应（94

15

s，60℃退火延伸

1

）；（60

1×10

DAS-68416-4-F0.8

2.0

10

DAS-68416-4-R0.8

2.0

10

DAS-68416-4-P0.4

.0

2.0

25.0

表示体积不确定。根据

25.0

1×10

lec-1215F0.2

0.5

10

lec-1332R0.2

0.5

10

lec-1269P0.2

0.5

.0

25.0

表示体积不确定。根据

25.0

DB12/T

652—2016表

1 DAS-68416-4表

1 DAS-68416-4

PCR

反应体系表

2 Lectin

PCR

反应体系在试样

PCR

反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因大豆基因组DNA质量分数为0.1%~1.0%的基因组

DNA（或采用

与非转基因大豆基因组相比的拷贝数分数为

0.1%~1.0%的DNA

溶液）作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照

PCR

反应体系中，除模板外，其余组分及

PCR

反应条件与

5.3.5.1

6 结果分析与表述6.1 Lectin内标准基因无典型扩增曲线，表明样品中未检出大豆成分，结果表述为“样品中未检测出大豆成分，检测结果为阴性”。6.2 LectinCt值≤38DAS-68416-4转化体特异性序列出现典型Ct值≤因耐除草剂大豆转化体成分，检测结果为阳性”。DB12/T

652—20166.3 LectinCt值≤38DAS-68416-4转化体特异性序列未出现典型扩增曲线，表明样品中未检测出DAS-68416-4转化体成分，结果表述为“样品中未检测出转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4

转化体成分，检测结果为阴性”。6.4 Lectin

/或

转化体特异性序列出现典型扩增曲线，但

Ct

值在

～之间，进行重复实验。如重复实验结果符合

～

的情形，依照

6.1～6.3

进行判断。如重复实验检

Ct

值仍在

38～

内标准基因和/或转化体特异性序列，根据检出参数情况，参照

～

对样品进行判定。DB12/T

652—2016附录A（资料性附录）A.1 Lectin基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（Accession

No.K00821）1

CCACATTTGG

CCGGTAGCGT

TGCCAGCTTC61

GCCGCTTCCT

CTTCTATGCC

AAAGGCTTGC

AGATGGGC

A.2耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性序列1 GGGCCTAACT