DB13-T 1778-2013 鱼类链球菌病诊断技术规范

ICS 67.120.30B

50DB13

of

diagnosis

streptococcicosis

河北省质量技术监督局

DB13/T

1778—2013前 言本标准按照GB/T

1.1—2009给出的规则起草。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。薛政。IDB13/T

1778—2013鱼类链球菌病诊断技术规范1

范围本标准规定了鱼类链球菌病的诊断方法。本标准适用于鱼类链球菌病病原菌的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2

规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

食品卫生微生物学检验

染色法、培养基和试剂GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法3

术语和定义3.1

下列术语和定义适用于本文件。病原菌链球菌（Streptococcus）呈球形或卵圆形，在液体培养基中以成对或链状出现；革兰氏阳性、触Streptococcus

iniae）、无乳链球菌（Streptococcus

agalactiae）、米氏链球菌（Streptococcus

millieri）、副乳房链球菌（Streptococcus

parauberis）和停乳链球菌（Streptococcus

dysgalactiae）。其中海豚链球菌和无乳链球菌是引起鱼类链球菌病的主要病原菌。4

设备和材料设备和材料包括：a)

恒温培养箱。b)

显微镜：10×～100×。c)

灭菌乳钵。d)

天平：精度

e)

恒温水浴锅。f)

带有热盖功能的

PCR

仪。g)

电泳仪。h)

紫外分析仪或紫外观察灯。i)

灭菌剪刀、镊子。j)

高压灭菌器。1DB13/T

1778—20135

培养基和试剂培养基和试剂包括：a)

水：应符合

的要求。b)

Todd-Hewitt

肉汤（简称

c)

血琼脂平板：按

GB/T

4789.28

中规定。d)

75％酒精。e)

革兰氏染色液：按

中规定。f)

3％

H2O2

溶液（临时配制）。g)

Taq

DNA

聚合酶。h)

酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）。i)

琼脂糖。j)

溴化乙锭（EB）。k)

标准菌株：海豚链球菌和无乳链球菌标准菌株。l)

dNTP：含

dATP、dCTP、dGTP

和

dTTP

各

10mmol/L。m)

PCR

引物：

为

10μmol/L。其序列如下：E1:

5′－GGACCAATGCCACAAACTCG－3′E2:

5′－TGGAGTATGACGTCCACCTTC－3′n)

DNA

分子质量标准（Marker）。o)

无水乙醇：使用前预冷至-20℃。6

诊断步骤6.1 活动情况观察或间断地狂游、翻滚、转圈。6.2 外部检查部有出血现象；体表有

l

处或多处隆起，尤以尾部为多见，隆起部位出血或溃疡。6.3 解剖检查患病鱼脑部充血，有出血点；肝脏肿大、出血，或脂肪变性、褪色；脾脏肿大，呈暗红色；胆囊、肾脏肿胀；胃肠或腹腔积水，肠壁充血发炎。6.4 病原菌的实验室常规鉴定6.4.1 涂片检查用

75%酒精棉球擦拭鱼体，在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官的小块组织,在洁净载玻片上涂片,风干后,革兰氏染色（按

中的规定）后镜检。如见紫色球菌则表明病料中可能含有链球菌。2用无菌生理盐水稀释至10

CUF/mL（约麦氏比浊度0.4），按

用无菌生理盐水稀释至10

CUF/mL（约麦氏比浊度0.4），按

的方法提取细菌DNA做为PCR反6.4.2 病原菌分离培养脂平板。

25g

灭菌的

THB

培养

24h

士

48h

士

后观察。6.4.3菌落形态和显微镜观察直径大小为

6.4.4 病原菌生化鉴定

菌落接种于营养肉汤（见附录A.2）于10℃培养48h，观察是否生长。可鉴定为链球菌。6.5病原菌的聚合酶链式反应（PCR）方法鉴定本方法与6.4的方法可任选其一。6.5.1取样解剖待检样品鱼，取脑、肾、肝和脾组织约

1.0g，于灭菌乳钵中充分研磨,

再加

TE

(见附录

A.3)混匀,

然后将组织悬液转入无菌离心管中。6.5.2 模板

DNA

取组织悬液

90μL

于

1.5mL

10μL(10

37

℃水浴

1

h。加入蛋白酶

K

5μL(20

mg/mL),

37

1h，加入

RNA

酶

10μL(10

37

℃水浴

30min,加入

苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提

3

次，然后加入预冷的无水乙醇，

r/min

离心

10min，弃上清，自然干燥，用

TE

PCR

反应模板

溶液，4

℃保存。也可以使用能够达到同种效果的商业化细菌DNA提取试剂盒。6.5.3 PCR

扩增PCR

反应体系

5μL，MgCl2

（25mmol/L）4μL，dNTPs（各

10mmol/L）1μL，E1、E2

引物（10μmol／L）各

1μL，Taq

DNA

聚合酶（5Ｕ/μL）0.5μL，模板

DNA

溶液

双蒸水

35.5μL。PCR

反应条件为：94℃预变性

5

min；94℃变性

1

min，58℃退火

45

s，72℃延伸

1min，共

35

循环；72℃延伸

min，最后

每次反应应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。将海豚链球菌或无乳链球菌标准菌株分别接种于THB增菌液中，28℃培养18h～24h，摇匀后取1mL，6 8应的阳性模板。以DNA提取液代替阴性对照模板。以水替代空白对照模板。3DB13/T

1778—2013PCR

PCR

6.5.4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳用电泳缓冲液（见附录

A.4）配制

1.5%的琼脂糖〔含

0.5μg/mL

EB

溶液〕平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好没过胶面。将

6μL

2μL

上样缓冲液（见附录

6

品孔，同时加入

DNA

标准分子量（Marker）。5V/cm

电泳约

6.5.5 结果观察与判定用紫外分析仪或紫外观察灯观察琼脂糖凝胶；阳性对照样会在与

639bp

片段的位置出现条带，阴性对照和空白对照应无条带；如在

639bp

位置出现条带，则判定为链球菌阳性；如在

639bp

位置无条带，或条带不在此位置，则判定为链球菌阴性。7

综合判定4DB13/T

1778—2013AA附录 A（规范性附录）试剂配制标准中所用试剂，除特别注明外，均采用分析纯试剂。A.1 Todd-Hewitt肉汤（简称THB)牛肉膏 5.0g胰蛋白胨20.0g葡葡糖 2.0g碳酸钠 2.5g氯化钠 2.0g磷酸氢二钠(Na24) 0.4g蒸馏水 1000ml将以上各成份混合煮沸，完全溶化，冷却至室温后，调

pH，于

115℃灭菌

10min，最终

pH

为

7.8。A.2 营养肉汤蛋白陈 10g牛肉膏 3g氯化钠 5g蒸馏水 按上述成分混合，溶解后校正

至7.4，分装，每瓶，121℃高压灭菌。A.3 1×TE

1M

Tris-HCl（PH=8.0） 5ml0.5M

EDTA（PH=8.0） 1ml量取以上溶液于

L

后，高温高压灭菌；室温保存。A.4 5×TBE电泳缓冲液Tris 54g硼酸（HBO3

） 27.5gEDTA 2.922g水1000mL用

5mol/L

pH

8.3，用时稀释

5DB13/T

1778—2013A.5 EB(ethidium

bromide，核酸染色剂)用水配制成

的浓缩液，用时每

10mL

1μL。A.6 上样缓冲液每水溶液中含溴酚蓝0.25g，蔗糖。6DB13/T

1778—2013BB附 录 B（资料性附录）链球菌（EF-Tu）tuf

基因序列B.1 无乳链球菌延伸因子（EF-Tu）tuf基因序列1

tgagcacatc

cttctttcac

gtcaagttgg

61

tcatgaacaa

agttgacctt

gttgatgatg

aagaattgct

tgaattggtt121

ttcgtgacct

tctttcagaa

tacgacttcc

caggtgatga

ccttccagtt181

cagctcttaa

agcacttgaa

ggcgacgaaa

aatacgaaga

catcatcatg241

gcactgttga

tgagtacatt

ccagaaccag

aacgtgatac

tgacaaacct301

cagttgaaga

tgtattctca

atcactggac

gtggtacagt

tgcttcagga361

gtggtactgt

tcgtgtcaac

gacgaagttg

aaatcgttgg

tattaaagaa421

aagcagttgt

tactggtgtt

gaaatgttcc

gtaaacaact

tgacgaaggt481

acaacgttgg

tgttcttctt

cgtggtgttc

aacgtgatga

aatcgaacgt541

ttgctaaacc

aggttcaatc

aacccacaca

ctaaatttaa

aggtgaagtt601

ctaaagaaga

aggtggacgt

catactccat

tcttcaacaa

ctaccgtcca661

tccgtacaac

tgacgtaaca

ggttcaatcg

aacttccagc

aggaacagaa721

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t//B.2 海豚链球菌延伸因子（EF-Tu）tuf基因序列1

tgagcacatc

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ccttccagtt181

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1778—2013421

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