微生物反应器操作

5微生物反应器操作教学基本内容：讲授微生物反应器的操作方式，包括分批式操作、连续式操作、流加式操作。连续式操作的定义、数学模型，连续稳态操作条件，连续操作的优缺点，在生产上和科研中的应用；流加式操作的定义、数学模型，定流量流加、指数流加的概念，流加式操作的控制优化问题。分批式操作下微生物生长曲线。5.1微生物反应器操作基础5.2连续式操作5.3流加式操作5.4分批式操作授课重点：1.三种基本操作方式的比较。2.单级连续式操作的数学模型，连续稳态操作条件，冲出现象。3.连续操作的优缺点及在生产上和科研领域的应用。4流加式操作的数学模型，指数流加和定流量流加的概念。5.流加操作的控制与优化。6.分批式操作下微生物的生长曲线。难点：1.连续式操作的数学模型。2.多级连续培养的数学模型。3.流加式操作的数学模型。本章主要教学要求：1.理解微生物反应器操作方式的概念。注意连续式操作、流加式操作和分批式操作的区别。2.理解和掌握连续式操作的数学模型及连续稳态操作条件。3.理解指数流加和定流量流加的区别。4.了解连续式操作的优缺点和应用。5.了解流加式操作的优化和控制。5微生物反应器操作5.1微生物反应器操作基础5.1.1微生物反应器操作方式分批式操作：是指基质一次性加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入，反应完成后将全部反应物料取出的操作方式。连续式操作：是指分批操作进行到一定阶段，一方面将基质连续不断地加入反应器内，另一方面又把反应物料连续不断的取出，使反应条件不随时间变化的操作方式。流加式操作：是指先将一定量基质加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入反应器中，反应开始，反应过程中将特定的限制性基质按照一定要求加入到反应器内，以控制限制性基质浓度保持一定，当反应终止时取出反应物料的操作方式。Vt图5－1分批式操作中基质体积变化Vt图5－2流加式操作Vt图5－3连续式操作5.1.2不同操作方式的特点在分批式操作中，反应液中基质浓度S随反应进行不断降低，菌体浓度X、产物浓度P则不断升高，因此是一个动态变化过程。当微生物反应存在底物抑制时，初期底物浓度高不利于反应。后期底物浓度过低，则反应速度很低。在流加式操作中，基质浓度控制在一定水平，避免了底物抑制问题。流加过程中反应液体积是变化的。流加式操作可达到拟稳态。在连续式操作中，反应液体积V、底物浓度S、菌体浓度X、产物浓度P保持恒定，连绵式操作是一个稳态过程。5.1.3不同操作方式的优缺点见教材73页表5-1。5.2连续式操作连续式操作有两大类型，即CSTR型和CPFR型，CPFR型多用于酶促反应过程，微生物反应的连续式操作多采用CSTR型。根据达成稳定状态的方法不同，CSTR型连续操作，大致可分为以下3种：恒化器法：指连续培养过程中，基质流加速度恒定，以调节微生物细胞的生长速率与恒定流量相适应的方法。恒浊器法：指预先规定细胞浓度，通过基质流量控制，以适应细胞的既定浓度的方法。营养物恒定法：指通过流加一定成分，使培养基中的营养成分恒定的方法。5.2.1恒化器法单级连续操作5.2.1.1数学模型图5－4所示的单级CSTR培养系统中，流入液中仅一种成分为微生物生长的限制性因子，其他成分在不发生抑制的条件下充分存在。F（S0，X0）S，X，PF（S，X，P）F（S0，X0）S，X，PF（S，X，P）图5－4单级CSTR培养系统菌体的物料衡算式：变化量=流入量+生长量流出量即：（5－1）限制性基质的物料衡算式：变化量=流入量流出量－消耗量即（5－2）产物的物料衡算式：变化量=流入量＋生成量流出量即：（5－3）（5－1）式～（5－3）式两边同除以V，则（5－4）（5－5）（5－6）式中D为稀释率，稳定状态下，，因此D=μ（5－7）（5－8）（5－9）若微生物生长符合莫诺模型，则（5－10）（5－7）式～（5－10）式为恒化器法单级连续培养的数学模型。稀释率D是一个重要的操作参数。根据上述方程可知当D确定时，、S、X、P即可唯一确定。D=F/V，因此，当反应液体积一定时，可通过控制流量F来控制、S、X、P，这正是恒化器法又被称为外部控制方法的缘故。5.2.1.2连续稳态操作条件：D的取值是有限制的，即应有，式中，为临界稀释率。微生物反应一般是在条件下进行的，所以当D时，根据（5－4）式可知，反应器中菌体终将全部被冲出(wash-out)，称为冲出现象。5.2.1.3菌体产率、产物产率菌体产率（5－11）产物产率（5－12）获得最大菌体产率（或最大产物产率）时的稀释率为（5－13）此时，最大菌体产率为（5－14）最高产物产率为（5－15）当时，，（5－16）例1：以葡萄糖为限制性底物，连续培养大肠杆菌，在此培养条件下，测得实验数据如下，比较理论与实验的结果。已知m=1.08h-1，KS=0.102g/L，YX/S=0.505g/g。单级恒化器连续培养大肠杆菌S0=0.968g/L稀释率D(h-1)葡萄糖S(mg/L)菌体浓度X(mg/L)菌体产率DX(mg/L.h)0.066427260.1213434520.24334171000.31404381360.43644221810.531024272260.601224242540.661534222790.691704302970.712213902770.73210352257解：根据实验数据计算菌体产率DX，列入上表。根据理论公式计算不同稀释率下的葡萄糖浓度S、菌体浓度X和菌体产率DX，列入下表。，，单级恒化器连续培养大肠杆菌S0=0.968g/L稀释率D(h-1)葡萄糖S(mg/L)菌体浓度X(mg/L)菌体产率DX(mg/L.h)0.066486290.1213482580.24294741140.31414681450.43674551960.53984392330.601274252550.661604082690.691803982750.711963902770.73213381278分别以实验数据和理论数据绘制S~D、X~D及DX~D曲线。实验曲线用实线表示，理论曲线用虚线表示。XXDXDXSS观察理论曲线与实验曲线的拟合情况，可以发现，两组曲线基本吻合，在稀释率较小时X~D理论曲线与实验曲线存在较大偏差。例2葡萄糖为限制性基质进行呼吸缺陷型酵母突变株的单级连续培养（恒化器法）。请给出存在乙醇抑制和无抑制两种情况下稀释率D与菌体浓度X、基质浓度S与产物浓度P的关系。已知原料中不含产物乙醇（Pin＝0），基质浓度Sin=10g/L。存在乙醇抑制的生长动力学模型可采用解：存在乙醇抑制时，连续培养稳态下，无乙醇抑制时，连续培养稳态下，例3判断题1)单罐连续培养稳态下，稀释率与生长比速的关系：D>()D=()D<()D==0()3)单罐连续培养稳态下，在洗出稀释率下，可达到最大的菌体产率。()4)单罐连续培养稳态下，在Dmax的细胞浓度不是最大细胞浓度。()5)单罐连续培养稳态下，细胞浓度越高，菌体产率越大。()6)单罐连续培养稳态下，在洗出稀释率下罐内底物浓度等于零。()7)单罐连续培养稳态下，细胞浓度越高，罐内底物浓度越低。()例4（教材例4－7）求青霉素连续发酵的稳定状态下最大菌体生成速度(DX)max及此时的稀释率Dmax，菌体浓度X和基质浓度Sout。已知Sin=30g/L，YX/S＝0.45，菌体生长可用Monod方程表达，max=0.18h-1，KS＝1.0g/L。解：菌体生长符合Monod模型，连续培养稳态下达到最大菌体生成速度的稀释率5.2.2具有反馈的单级连续培养有时为了增加反应器内的菌体浓度，或者在某种条件下提高发酵产物的产率，对单级连续培养可以采取将反应器排出液中的部分菌体重新返回反应器中。5.2.2.1数学模型（1+（1+）F（X，S）F（S0）S，XF{[1+（1-）]X，S}F(X，S)图5－5具有反馈的单级连续培养图5－5表示具有反馈的单级连续培养系统，图中g为微生物的浓缩系数（g1），r为再循环反应液的比例（返回的反应液与供给的新鲜反应液的体积比）。菌体衡算式：（5－17）基质衡算式：（5－18）培养达到稳定状态时， 即：=D(1+r-gr)=DR（5－19）（5－20）式中，R为循环浓缩因子，R＝1＋r－rg，若微生物生长模型可采用Monod方程，则（5－21）（5－19）式、（5－20）式、（5－21）式为具有反馈的单级连续培养数学模型。5.2.2.2稳态操作条件：(在通常情况下，Sin<<KS)（5-22）稳态操作条件：DDcrit可见，具有反馈的单级恒化器与无反馈的单级恒化器相比，稳定状态下的菌体浓度X增大，临界稀释率增大。5.2.2.3菌体产率对具有反馈的单级连续培养，还应考虑排出反应液中的菌体浓度X。菌体分离装置处的菌体衡算式为（5-23）所以，从分离装置处流出的菌体浓度（5-24）菌体产率（5-25）例5（教材例4－9）以葡萄糖为基质在如下条件进行具有反馈的连续操作。V＝1m3；F＝0.1m3/h；YX/S＝0.158g/g(以细胞/葡萄糖计)；Sin=10kg/m3；r=0.8；g=1.5。已知微生物反应可以用Monod方程来表示，其中max=0.41h-1，KS＝0.22kg/m3，求比生长速率，反应器内基质浓度Sout和菌体浓度X和分离装置出口处的菌体浓度X。解：微生物反应可以用Monod方程来表示，具有反馈的连续培养稳态下，5.2.3多级连续培养5.2.3.1数学模型：以微生物生长符合莫诺模型为例。F，SF，S2，X2，P2F，SF，S3，X3，P3F，SoF，S1，X1，P1图5－6多级连续培养操作达到稳态时，第一级罐（5-26）（5-27） （5-28）（5-29）第n级罐物料衡算式（5-30）（5-31）（5-32）（5-33）化简，得 （5-34）（5-35）（5-36）（5-37）例6某微生物的生长可用Monod方程来描述，并且max=0.5/h，KS=2g/L。(1)连续培养中，流加基质浓度So=48g/L，YX/S=0.45g/g，在稳定状态下，菌体的最大生产强度为多少？(2)采用相同容积的发酵罐，且D=0.2/h连续稳定状态下培养，若要保证反应系统的基质流出浓度S小于0.5g/L，问需要几个发酵罐串联？基质转化率为多少？解：(1)微生物的生长可用Monod方程来描述，连续培养稳态下，取得最大生产强度的稀释率(2)连续培养稳态下，第一级罐中第二级罐中：（1）（2）（3）联立方程求解,得，S2=0.3g/L基质转化率:5.2.4连续培养中的杂菌污染和菌种变异目前，除大规模工业化生产单细胞蛋白、工业化处理废水采用连续培养技术之外，其他发酵产品的工业生产极少采用连续培养技术。主要原因有三：(1)杂菌污染问题。因连续培养以长期、稳定连续运转为前提，在整个培养过程中，必需不断地供给无菌的新鲜培养基，好氧发酵时，必需同时供给大量的无菌空气，这两种供给的过程中极易带来杂菌的污染，长期保持连续培养的无菌状态非常困难。(2)菌种变异问题。因工业化生产所用菌株大都是通过人工诱变处理的高度变异株，在长期的连续培养过程中容易使回复突变菌株逐渐积累，最后取得生长优势。(3)成本问题。为降低成本,其一要使原料以最大的转化率和最大的产率转化为产物；是使发酵终了液中含有尽可能高的产物浓度，以缩小产物分离提取系统的规模和操作的费用。一些发酵过程其产物的分离提取费用约占生产总成本的40%以上；而对于大多数抗生素和精细化学品的发酵生产，其本身就是一个高成本分离过程的生产过程。而在连续培养过程中，流出的发酵液中产物浓度一般比分批培养、流加培养的低，结果加重了分离提取的负荷，在生产成本上没有竞争力。目前连续培养的应用主要集中在研究领域。XWS设连续培养微生物X的过程中被Y或Z或W微生物所污染。其中杂菌Y在给定的限制性底物S中的比生长速率；杂菌Z在S中的比生长速率；而杂菌W在S中的比生长速率则与S有关。三种菌在连续培养中与微生物X的生长关系如图所示。XWSXZSXZSXYS根据连续培养理论，对于杂菌Y，在一定S下，，，因此杂菌Y被冲出，不能残存在系统中。对于杂菌Z，在一定的S下，，,因此杂菌Z将残存在系统中。其残存方式是：由于，微生物Z增殖，Z的增殖将导致限制性底物浓度S的下降，下降至时，有，建立了一个在下新的稳定状态。在下，，微生物X将从培养系统中洗出。对于杂菌W，W的残存与否取决于操作的稀释率，在D=0.25Dcrit时,X将洗出，在D=0.75Dcrit时,W将被洗出。由此可见，在系统中保留的是在此环境中比生长速率最大的微生物。5.2.5连续培养在研究领域的应用(1)发酵动力学参数的测定。莫诺模型中max、KS的测定：绘制曲线或曲线，即可由直线斜率和截距计算出max、KS。为了达到测定的准确性，就要求S-数据准确、可靠、重现性好。采用分批培养，由于过程的不稳定性，数据重现性不好，另外还要求底物、菌体浓度测定方法极为灵敏、准确；而连续培养由于过程的稳定性，数据准确、可靠、重现性好。测定一般采用恒化器实验，即控制不同的稀释率D，使系统达到稳定状态后，测定相应的底物浓度S，而=D，这样，就得到了-S数据。产物动力学模型中系数的测定：，可变形为同样采用恒化器实验，即控制不同的稀释率D，使系统达到稳定状态后，测定相应的产物浓度P、菌体浓度X，根据连续培养产物恒算式计算Qp，而=D，这样，就得到了-Qp数据。绘制Qp~曲线，根据直线斜率、截距即可计算出、。(2)确定最佳培养条件这是过程优化的一个内容。对于一个发酵过程，优化的内容包括：什么样的条件下能获得最大菌体产率、产物产率？什么样的条件下能获得最大的菌体得率、产物得率？控制哪种限制性底物，在何种浓度水平才能最大限度地避免其他副产物的形成？下面将举例说明。微生物培养的目的有两个：一是菌体，二是产物。先以面包酵母生产为例。以葡萄糖为限制性底物，在不同稀释率D下进行连续培养，测定稳态下的菌体浓度X、糖浓度S、乙醇浓度P并计算出得率YX/S、乙醇生成比速，可得如图5－7所示培养结果。0.40.30.20.10.40.40.30.20.10.40.30.20.1(a)(b)(b)DDDD0.10.20.30.40.50.10.20.30.40.50.10.20.30.40.50.10.20.30.40.5SS(c)(c)0.20.20.10.10.20.30.40.50.10.20.30.40.5SS图5－7面包酵母连续培养实验结果由图(a)可知：在D=0.1-0.25之间培养能够取得最高转化率YX/S=0.5g/g；在此种稀释率D下，所对应的葡萄糖浓度S0.12g/L，如图(b)所示；在这一底物浓度下，乙醇的比产生速率QP=0，如图(C)所示。根据这些参数间的关系，可知在培养面包酵母时，应控制发酵液中面包酵母的比生长速率在0.1-0.25之间,选择合适的初糖浓度S0，使培养操作时的底物浓度S0.12g/L；在此条件下培养，基本无乙酵生成，转化率可达到最高为50%。生产中呼吸商RQ是易于测定和控制的参数，RQ=QCO2/QO2。测定培养过程菌体浓度X、氧摄取速率QO2、二氧化碳排出速率QCO2，计算呼吸商RQ，可得图5－8所示的结果。XQCO2XQCO2YX/SXX，YX/S，RQ12X，YX/S，RQ1284QCO2，QO2D图5－8连续培养面包酵母时各参数间的关系从图中可以看出：呼吸商RQ为1时取得最大转化率YX/S，呼吸商RQ大于1时，转化率下降。综合上述结果，可得培养面包酵母的最佳培养条件：S=0.12g/L；=0.25h-1；RQ=1，此时，转化率、产率均可达到最大值。依此培养条件，采用连续培养或流加培养就能够获得最好的培养结果。事实上，现代工业化规模生产面包酵母的流加培养和操作控制技术就是建立在上述研究基础上的。我们再举一个以得到发酵产物为目的例子。在这类发酵中，过程优化的问题就是研究如何提高产物产率。其中研究限制性底物对产物比生成速率的影响十分重要。在各种限制性底物对链球菌产生乳酸的研究中得到如下结果。限制性底物稀释率D(h-1)细胞产酸力YP/X（g/g）比产物生成速率(h-1)乳酸P(g/L)葡萄糖0.0175.40.0924.0葡萄糖0.0346.10.214.0葡萄糖0.0516.00.313.8氮源0.03426.30.8910.0磷酸盐0.03480.02.74.8表中细胞产酸力YP/X反映了生长与产物的偶联情况。当以葡萄糖为限制性底物时，生长与产酸相偶联；而当以氮源或磷酸盐为限制性底物时，由于氮源和磷酸盐都是构成菌体成分的物质，氮源或磷酸盐的限制，使葡萄糖的代谢与生长速率无关，即生长与葡萄糖代谢非偶联，促使葡萄糖的分解代谢产物乳酸大量产生、积累，菌种的比产物生成速率提高了一个数量级。(3)富集、选育特殊性状的菌种一般的菌种选育方法有物理诱变法、化学诱变法，利用连续培养技术选育菌种，是一种十分简便的方法。这种方法包括两个要点：一是要针对具体选定的微生物群，根据所要求的功能建立高度选择的培养环境，使得无此功能的微生物在此环境中不能生长或极少生长，例如，选育能够利用碳氢化合物的微生物，则需以碳氢化合物为唯一碳源；又如选育的是酵母而非细菌，则可在高酸性条件下培养，pH3-4；如果所选育的是嗜热微生物，则在高温条件下培养。第二个要点是选择合适的稀释率。5.3流加式操作F，SF，S0XS图5－9流加式操作在流加式操作中，反应液体积是变化的，。5.3.1流加操作的数学模型流加操作中菌体、基质、产物的物料衡算式：（5-38）（5-39）（5-40）当培养达到拟稳态时，基质浓度S、菌体浓度X恒定。即：（5-41）即：（5-42）（5-43）化简后，得到（5-44）（5-45）（5-40）式化简可得，（边界条件：）(5-46)对（5－46）式积分，得(5-47)若，

则(5-48)流加操作中有关参数的变化如图5－10所示。X，S，PtX，S，PtXSPVVtt图5-10流加操作中有关参数的变化5.3.2流加的方式指数流加：指稀释率D恒定，对积分，得。即基质流量按指数规律变化，这种方式可达到拟稳态，微生物呈指数生长。定流量流加：流量F恒定，定流量流加的最大特点是微生物进行线性生长，即（一定）5.3.3流加操作的控制流加操作的控制包括无反馈控制和反馈控制。无反馈控制的流加操作是指按预先设置好的模式进行底物的流加。因此，系统的数学模型是否正确成为控制成败的关键。另外，由于微生物反应的复杂性，使实际情况总会与理论模型存在偏差，而无反馈控制不能及时修正偏差。反馈控制则可弥补这一缺陷。反馈控制又可分为直接反馈控制和间接反馈控制。直接反馈控制监测的是发酵液中底物浓度S、菌体浓度X、产物浓度P等直接指标。如果些指标不能在线测定，可以监测溶氧、pH等可在线测定的间接指标，这就是间接反馈控制。无论直接反馈控制，还是间接反馈控制，都可以根据监控指标的变化情况对过程中产生的偏差进行修正。5.3.4流加操作过程的优化。发酵动力学的应用并不限于对发酵过程的模拟，更重要的是实施过程的优化，以达到高产、低耗的目的。由于微生物生长是代谢产物合成的基础，并对产物合成起着调控作用，故发酵过程的优化主要是微生物生长的优化。考虑到实用的目的，这里主要介绍补料分批发酵过程的优化。流加培养优化是指控制适当的稀释率或菌体生长比速，是生产强度和得率尽可能最大。大量的菌体时产生产物的前提，因此在菌体生长阶段，应控制较高的生长比速，使菌体量快速增长。进入产物生成阶段后，应控制较低的菌体生长比速，以减少基质的消耗，并保证“壮龄”细胞在细胞群体中占绝大多数。进行流加培养优化时，还应考虑以下边界条件：(1)最大比生长速率。流加操作拟定态要求。(2)临界比生长速率。每个菌株维持具有较高产物合成酶活性的“壮年”细胞占优势都必须满足一个最低比生长速率，低于它，老龄细胞将逐渐占优势，致使产物合成能力下降，这就是临界比生长速率。根据这一要求，应有。(3)发酵罐最大允许细胞浓度。由于发酵罐氧传递能力的限制，使细胞浓度也有一临界值，超过它，氧的供应将失去平衡，使细胞处于缺氧状态，产物合成能力将急剧下降。(4)细胞对底物的耐受力。一般来说，底物浓度越大，细胞生长比速越大，但是由于细胞对底物有一定的耐受力，因此底物浓度并非越大越好。例7流加基质为葡萄糖，培养大肠杆菌。流加培养开始时的，，反应