氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纤维化中的保护作用

氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纤维化中的保护作用[摘要]目的研究盐酸氨溴索注射液（氨溴索）对百草枯（PQ）中毒肺纤维化的影响及相关机制。方法将105只SD大鼠随机分为5组：正常对照组（NC组）、百草枯中毒组（PQ组）、氨溴索普通剂量治疗组（PN组）、氨溴索大剂量治疗组（PL组）、氨溴索超大剂量治疗组（PE组），采取腹腔注射法构建动物模型：NC组注射1.25mg/kg生理盐水；PQ组注射25mg/kg2%PQ溶液；PN组注射25mg/kg2%PQ溶液+30mg/（kg?d）氨溴索；PL组注射25mg/kg2%PQ溶液+50mg/（kg?d）及PE组注射25mg/kg2%PQ溶液+90mg/（kg?d）。在模型建立后21d处死动物，肺组织行HE和Masson染色分别观察炎症以及纤维化情况；ELISA法测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-6（IL-6）含量，q-PCR和Westernblot分别测定肺组织中组织金属蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA和蛋白的表达。结果NC组肺组织正常，百草枯模型组大鼠肺损伤和肺组织胶原沉积明显。各剂量氨溴索治疗均能显著减少百草枯中毒诱导的大鼠肺组织胶原沉积，同时伴有IL-6、TIMP-1和TNF-α表达的显著下降（P[关键词]氨溴索；百草枯；肺纤维化；白介素-6；基质金属蛋白酶抑制因子1；肿瘤坏死因子α[中图分类号]R595.4[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2017）04（a）-0035-04[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectofambroxolonparaquat-inducedpulmonaryfibrosisinrats.Methods105SDratswererandomlydividedintofivegroups，NCgrouptreatedwith1.25mg/kgnormalsaline，PQgrouptreatedwith25mg/kg2%paraquat，PNgrouptreatedwith25mg/kg2%paraquat+30mg/（kg?d）ambroxol，PLgrouptreatedwith25mg/kg2%paraquat+50mg/（kg?d）ambroxol，PEgrouptreatedwith25mg/kg2%paraquat+90mg/（kg?d）ambroxol.Theratswerekiiledon21daftermodeling，thedegreesofacutepulmonaryinjuryandfibrosisweredetectedbyHEstainingandMassonstaining；themRNAandproteinexpressionsofTIMP-1andTNF-αwereevaluatedbyreal-timeqPCRandWestern-blotrespectively.ResultsThelungtissuewasnormalinNCgroup，whileitshowedthatsignificantinjuryoflungs，fibrosisandlargecollagendepositioninPQgroup.Afterambroxoltreatment，fibrosisandlargecollagendepositionreduced，expressionofIL-6，TIMP1-andTNF-αincreased（P1材料与方法1.1实验动物、试剂、药品及仪器105只6周龄、体重250～310g的SPF级SD雄性大鼠购自温州医科大学实验动物中心[合格证号：SCXK（浙）2010-0044]。本研究经温州医科大学附属黄岩医院伦理委员会批准。按常规饲养条件，在氨溴索干预后第21天，予腹腔注射2%利多卡因2mL处死大鼠。主要试剂及药品：氨溴索（批号：20090043），德国柏林格殷格翰医药公司；脂质体、荧光素酶活性检测试剂盒，美国Promega公司；Trizol试剂、逆转录试剂，Invitrogen公司；TaqManmiRNA检测试剂盒，美国ABI公司；TIMP-1抗体（批号ESAP10803）TNF-α抗体（批号110520），美国NovusBiologicals公司；实时荧光定量9700PCR分析仪，美国ABI公司产品。1.2动物分组及百草枯中毒模型建立根据随机数字表分组原则，105只大鼠随机分为5组，即：正常对照组（NC组）5只，百草枯中毒?M（PQ组）、氨溴索普通剂量治疗组（PN组）、氨溴索大剂量治疗组（PL组）以及氨溴索超大剂量治疗组（PE组）各25只。NC组按1.25mg/kg一次性腹腔注射生理盐水；PQ组：按25mg/kg一次性腹腔注入2%PQ液，建立大鼠PQ中毒模型；氨溴索治疗组：在PQ中毒模型成功后分别给予腹腔注射氨溴索，剂量分成30mg/（kg?d）、50mg/（kg?d）以及90mg/（kg?d）。本研究根据前期实验结果及既往研究结果[8]，30mg/（kg?d）组染毒后21d大鼠行为、体重的变化及肺组织纤维化的病理改变，均符合百草枯中毒的特征，且在观察期内未出现死亡，故以30mg/（kg?d）的剂量作为建立模型的合适剂量。以出现饮食明显减少，静伏少动，逐渐出现目光呆滞，反应迟钝，尿量减少，甚至明显呼吸急促等典型的百草枯中毒的特征作为建模成功的标准。1.3BALF以及肺组织的收集处死大鼠后完整取出肺脏，气管分叉处结扎右主支气管，取出右肺组织，保存在-80℃冰箱以备用mRNA和蛋白测定；左肺给予冰生理盐水灌洗（2.5mL×3次），回收BALF，进行低温离心（2500r/min，离心3～5min），取上清液，保存在-80℃度冰箱以备用；后左肺以10%中性甲醛溶液固定。1.4ELISA法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6的浓度取出上述BALF标本上清，ELISA法检测BALF中IL-6的浓度，操作具体按试剂盒说明进行。1.5HE染色半定量评价肺损伤程度及Masson染色评价肺纤维化程度甲醛溶液固定的左肺组织，分别进行HE染色及Masson染色。采用Mikawa评分[7]方法：①肺泡充血；②出血；③间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；④肺泡间隔增厚或透明膜形成。按病变轻重，分为0～4分（0分为无或极轻微损伤；1分为轻度损伤；2分为中度损伤；3分为重度损伤；4分为极重度损伤），总分作为病理评分。Fulmer评分[8]来半定量肺纤维化：0级，无纤维化，得0分；Ⅰ级：轻度纤维化，受累面积40%，得4分；每组切片观察4个高倍镜，最后取平均值为肺纤维化得分。1.6qRT-PCR法检测肺组织TNF-α和TIMP-1的mRNA表达运用qRT-PCR法检测右肺组织中TNF-α和TIMP-1的mRNA表达，具体按试剂盒说明进行。TNF-α和TIMP-1表达的相对值=2-△△Ct。TNF-α引物：（F）5'-GTAGCCCACGTCGTAGCAAAC-3'和（R）5'-TGT？鄄GGGTGAGGAGCACATAG-TC-3'；TIMP-1引物：（F）5'-ATCGCTCTGGTAGCCCTTCT-3'和（R）5'-TCCCA？鄄GA-AATCATCGAGAC-3'。以U6为内参，每组实验重复3次。1.7Westernblot检测组织TNF-α和TIMP-1蛋白的表达采用Westernblot检测右肺组织中TNF-α和TIMP-1蛋白的表达情况，具体按试剂盒说明进行。以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。1.8统计学方法采用统计软件SPSS19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P2.3各组大鼠TNF-α、TIMP-1mRNA与蛋白的表达Westernblot结果表明，各实验组TNF-α和TIMP-1的mRNA与蛋白表达均显著升高（P0.05）。见表3。3讨论百草枯中毒大鼠肺的病理改变包括早期急性肺炎和后期肺纤维化，炎性细胞的浸润和炎性因子的释放是其重要的病理特征，IL-6、TNF-α和TIMP-1等细胞因子在肺纤维化的发病及病理过程中的作用已引起广泛的重视[4，9]。笔者发现，在百草枯中毒后第21天后，大鼠肺组织不仅存在肺损伤，同时伴有肺组织大量胶原沉积，并伴有TIMP-1、TNF-α和IL-6表达的增加，这与Nakamura等[10]的研究是一致的，说明百草枯中毒后期出现广泛的肺纤维化。盐酸氨溴索具有抗炎、抗氧化和促进肺泡表面活性物质释放等作用，能够减轻放射性、内毒素等所致的急性肺损伤[11-12]。本研究主要发现，氨溴索能够减轻百草枯中毒所导致的肺损伤和肺胶原的沉积，同时降低TIMP-1、TNF-α和IL-6的水平，提示氨溴索对于百草枯中毒所致的急性肺损伤及后期的纤维化有一定的保护作用。TNF-α与肺纤维化和肺间质炎症密切相关，在肺纤维化中起重要作用[13-14]。IL-6具有广泛的生物学功能，在肺纤维化过程中，大量增生的淋巴细胞、巨噬细胞以及成纤维细胞可以产生大量的IL-6，导致IL-6水平的升高[15-17]。本研究发现氨溴索能够降低TNF-α和IL-6的表达，提示氨溴素对百草枯中毒所致的后期肺纤维化的保护作用可能与这两个细胞因子相关。急性百草枯中毒患者由肺损伤渐进发展为肺间质纤维化，其发生发展与TIMP-1的表达相关，研究结果显示百草枯中毒后导致TIMP-1水平升高，考虑为中毒后肺泡内皮、上皮细胞受损，释放一系列细胞因子和炎性递质，促进基质金属蛋白酶合成与活化，从而参与细胞外基质和基底膜的降解，导致急性肺损伤[18-20]。而中毒后期，TIMP-1仍持续高于正常，此时，TIMP-1的表达占优势，参与肺纤维化的进展[21-22]。本研究发现肺纤维化程度越高，TIMP-1的表达越高，而氨溴索干预后可以明显降低TIMP-1的表达。综上所述，本研究发现氨溴索能够减缓急性百草枯中毒引起的肺损伤及肺组织纤维化，这种作用与TIMP-1、TNF-α以及IL-6相关。因而，氨溴索对急性百草枯中毒引起的肺损伤及肺纤维化有一定的保护作用，值得进一步研究。[参考文献][1]KervégantM，MerigotL，GlaizalM，etal.ParaquatpoisoningsinFranceduringtheEuropeanban：experienceofthePoisonControlCenterinMarseille[J].JMedToxicol，2013，9（2）：144-147.[2]?丽，钱洁，叶延，等.百草枯反复小剂量腹腔给药诱导小鼠肺纤维化模型[J].中华急诊医学杂志，2011，20（12）：1285-1289.[3]梁笛.化痰药物氨溴索的非化痰作用研究进展[J].复旦学报：医学版，2011，11，389（6）：554.[4]田同德，杨峰，唐静雯，等.清热活血散结复方对放射性肺炎及肺纤维化血清细胞因子IL-6，TNF-α，TGF-β1水平的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，5（4）：127-130.[5]章巍，刘新民，李海潮，等.博来霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织MMP-2、MMP-9、MT1-MMP及TIMP-1、TIMP-2的表达[J].北京大学学报：医学版，2002，34（6）：716-721.[6]万勇，张念，李剑平，等.调节性T细胞与Th17细胞的失衡及其对大鼠肺纤维化的影响[J].华中科技大学学报：医学版，2013，42（2）：161-166.[7]马玉腾.大剂量氨溴索治疗百草枯中毒所致急性肺损伤的实验研究[D].石家庄：河北医科大学，2004.[8]FulmerJD，BienkowskiRS，CowanMJ，etal.Collagenconc？鄄entrationandratesofsynthesisinidiopathicpulmonaryfibrosis[J].AmRevR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