DB2305-T 020-2024牛病毒性腹泻病毒pcr检测规程

ICS65.020.30CCSB41

DB 2305双 鸭 山 市 地 方 标 准DB2305/T020—2024牛病毒性腹泻病毒PCR检测规程2024-08-202024-08-202024-09-20双鸭山市市场监督管理局发布DB2305/T020—2024DB2305/T020—2024目 次前 言 Ⅱ范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1缩略语 1主要仪器设备 1试剂 2样品的采集与处理 3样品采集 3样品处理 3样品病毒核酸RNA提取 3PCR扩增 3引物 3反应条件 4结果判定 4检测结果成立条件 4结果判定 4实验室无害化处理 4病料的无害化处理 4实验室废弃物处理 4实验室分区 4实验室生物安全管理 4前 言GB/T1.1-20201部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由双鸭市农业农村局提出并归口。本文件起草单位：双鸭市农业技术综合服务中心、双鸭山市基本建设项目服务中心、黑龙江农业职业技术学院。本文件主要起草人：王宇婷、白鹭、刘云、张红军、杜航、张荣翔、秦藕菊。III牛病毒性腹泻病毒PCR检测规程范围本文件规定了牛病毒性腹泻病毒PCR检测方法的主要仪器设备、试剂、样品采集与处理、样品病毒核酸RNA提取，PCR扩增、结果判定、实验室无害化处理等技术要求。本文件适用于牛病毒性腹泻病毒PCR检测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。本文件没有需要界定的术语和定义。缩略语BVDV：牛病毒性腹泻病毒PCR：聚合酶链式反应RNA：核糖核酸cDNARNADNAPBS：磷酸盐缓冲液EP管：微量离心管DEPC：焦碳酸乙二酯EDTA：乙二胺四乙酸PrimeSTARBuffer：聚合酶的缓冲液dNTPMix：脱氧核糖核苷三磷酸混合液DNAPolymerasePCRDNAddHO主要仪器设备二级生物安全柜412000r/min冰箱：2～8℃、-2070单道（或多道）微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）PCR1涡旋振荡器电泳仪水平电泳槽凝胶成像系统全自动高压灭菌锅0.001g通风橱pH试剂GB/T6682三级水要求。所用液体试剂均需使用RNA酶的容器进行分装。TRIzol、氯仿、异丙醇（-20℃），均为商品化试剂。无水乙醇，应于-20℃预冷。DNAMarkerDL2000。75%75mL25mL0.1%DEPC水，应于-20℃预冷。0.1%DEPC0.1gDEPC100mL12h，121℃30min,冷却后冷藏备用，在通风橱中配制。30%30mL，氯化钠（Nacl）4.2g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1g，磷酸氢二钾（K2HPO4）3.1g，0.02%1.5mL100mLPh7.6，121℃高15min，4℃保存备用。50×TAE242gTris、37.2gNa2EDTA·2H2O800mL三级水中，充分搅拌混匀，加入57.1mL的冰乙酸，充分混匀，加三级水定容至1L，室温保存。1×TAE20mL50×TAE1L，室温保存。cDNA合成：反转录试剂盒。10mg/mL的溴化乙锭溶液：100mL1g，置棕色容器中搅拌数小时以确保完全溶解，用铝箔包裹容器，保存于室温。0.01mol/mLPBS：氯化钠（Nacl）8g、氯化钾（Kcl）0.2g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.9g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g1000mL。1%1g琼脂糖于100mL1×TAE缓冲液中，加热融化后充分摇匀，待冷至50℃～60℃，加入溴化乙锭溶液5μL。摇匀，倒入插好梳子的电泳板上，凝固后取下梳子，备用。阳性对照：BVDVddH2O。2样品的采集与处理样品采集按照NY/T541的规定执行。病死牛无菌采集典型、明显的病变组织部位；活体采集EDTA抗凝全血（5mL～10mL），采血后轻轻颠倒混匀；粪便、口鼻分泌物拭子等分别装入灭菌的2mLEP管中（在管中加入30%甘油磷酸盐缓冲液中），所有样品均编号备用。样品处理组织样品1g1.5mLEP75%1mLPBS进行研磨，制备组织匀浆，12000r/min5min，取上清液用于核酸提取。抗凝血样品直接用于核酸提取。粪便、口鼻拭子样品将拭子样品，充分振荡后，室温静置5min～10min，取上清1mL加到1.5mLEP管中，12000r/min离心15min，取上清液用于核酸提取。RNA2mLEP200μL1mLTRIzol10min。200μLEP15s10min4℃、12000r/min15min。500μL1.5mLEP500μL异丙醇（-20℃预冷）1.5mLEP10min。4℃、12000r/min15min600μL75%乙醇（-20℃预冷）颠倒洗涤。4℃、12000r/min10min，轻轻倒去上清液。4000r/min30s3min。50μLDEPCRNA，4000r/min30s，-20℃保存备用，长期保存需-70℃冷冻。8.9cDNA按照试剂试剂盒说明书反转录，得到cDNA。PCR引物引物序列表见表1。3表1：引物序列表病毒名称序列名称序列（5’-3’）牛病毒性腹泻病毒上游引物GCTAGCCATGCCCTTAGTAGG下游引物TCCATGTGCCATGTACAGC9.2反应条件95℃预变性5min；94℃变性3min30s；60℃延伸40s；72℃退火1min；30个循环，72℃终延伸10min；最后4℃保温。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，预期扩增片段大小约为300bp。表2PCR反应液配方组分牛病毒性腹泻病毒1个反应体系加入量（μL）cDNA15×PrimeSTARBuffer5dNTPmix2DNApolymerase0.25上游引物1下游引物1灭菌ddH2O14.75结果判定检测结果成立条件阳性对照的PCR产物孔出现300bp大小特异性目的条带，阴性对照PCR产物无目的条带，则检测结果成立；否则，结果不成立。如阴性和阳性对照不满足以上条件，则实验视为无效，需重新检测。10.2结果判定10.2结果判定PCR300bp大小特异性目的条带，判为