生物学案：专题课题血红蛋白的提取和分离

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精课题3血红蛋白的提取和分离问题导学一、血红蛋白提取和分离的原理活动与探究11．分离生物大分子的基本思路是什么？2．蛋白质的分离和提取的原理是什么？3．凝胶色谱法分离蛋白质的原理是什么？4．讨论电泳的作用及其原理是什么.迁移与应用1用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()。A．路程较长,移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快电泳方法琼脂糖凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状等在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，使其迁移速率完全取决于分子的大小二、凝胶色谱法的实验操作活动与探究21．思考洗涤红细胞的目的和过程分别是什么。2．在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的分别是什么？3．观察教材图5－18，讨论血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层?如何获得血红蛋白溶液?4．采用何种装置进行透析？并说出透析的目的。5．试从凝胶色谱的分离原理分析凝胶的装填要紧密、均匀的原因。6．滴加样品时，应注意什么问题?7．探究样品洗脱时，红色区带可能会出现哪些情况？8．总结血红蛋白提取和分离的完整过程。迁移与应用2将经处理破裂后的红细胞混合液以2000r·min－1的速度离心10min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下依次是(）。A．血红蛋白、甲苯层、脂类物质层、沉淀层B．甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂类物质层C．脂类物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D．甲苯层、脂类物质层、血红蛋白、沉淀层1．样品处理、分离与纯化的目的不同目的红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析除去样品中分子较小的杂质纯化除去相对分子质量较大的蛋白质2．分离血红蛋白溶液的结果答案：课前·预习导学【预习导引】一、1．形状和大小电荷亲和力2．（1）相对分子质量的大小分配色谱法多孔球体多糖类化合物贯穿的通道容易进入较慢较短相对分子质量的不同（2)带电粒子带电性质的差异分子本身的大小迁移速度琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分子的大小3．（1）缓冲剂缓冲剂的使用比例预习交流1：提示：细胞外液中主要的酸碱缓冲对有：H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。二、1．（1)去除杂蛋白低速短时间离心黄色蒸馏水甲苯脂溶性沉淀层(2）透析袋透析袋磷酸缓冲液12h样品中相对分子质量较小的杂质（3）凝胶色谱(4）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2．（2）垂直缓慢均匀50cm磷酸缓冲液（3）缓冲液凝胶面顶端加样后，打开下端出口，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口20mmol/L的磷酸缓冲液红色的蛋白质5mL3．（1）洗涤次数离心速度离心时间洗涤次数离心速度时间白细胞（2)洗脱液湿凝胶沸水浴（3)气泡洗脱次序分离效果（4）均匀一致预习交流2：(1)提示:凝胶色谱柱装填的是凝胶颗粒,允许小分子进入，不允许大分子进入，通过延长小分子的路程使大分子与小分子分离。固定化酶的反应柱装填的是固定有酶的载体颗粒,既能催化反应物的反应,又保证了酶与反应物分子的分离，实现了酶的重复利用,节约了生产成本.（2）提示:不是。固定化酶的反应柱能进行化学反应,凝胶色谱柱不能进行化学反应。课堂·合作探究【问题导学】活动与探究1：1．提示：选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2．提示：根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质与多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等分离不同种类的蛋白质.3．提示：当相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时，相对分子质量较大的蛋白质分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；相对分子质量较小的蛋白质分子穿过多孔凝胶颗粒的内部通道，路程长，流动慢。因此可将相对分子质量不同的蛋白质分离。4．提示：电泳能使带电分子向与其所带电荷相反的电极方向移动。由于待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子大小及形状不同，所以在电场中的迁移速度不同，从而实现分离。迁移与应用1：D解析:凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动,路程较短，移动速度较快。活动与探究2：1．提示:（1）目的是去除血浆蛋白等杂蛋白.(2）过程：血液低速短时离心,去除上层黄色血浆→加生理盐水再离心,去除黄色上清液→如此重复洗涤三次,获得纯净的红细胞。2．提示：加入蒸馏水是使红细胞吸水胀破，甲苯的作用是溶解细胞膜.3．提示：（1）分为4层:第1层为无色透明的有机溶剂（甲苯)，第2层为白色的脂类物质,第3层为红色透明的血红蛋白溶液，第4层为暗红色的红细胞破碎物沉淀。（2）分层的液体→过滤除去脂溶性沉淀→分液得下层的血红蛋白溶液。4．提示：透析袋。透析袋一般是用硝酸纤维素制成的，是一种半透膜，小分子能自由进出,大分子则保留在袋内。因此透析的目的是除去小分子杂质。5．提示：如果凝胶装填得不够紧密、均匀,就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序,影响分离的效果。6．提示：滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。7．提示:如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。8．提示：血红蛋白提取和分离的程序包括:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去,即样品的纯化；最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。迁移与应用2：D解析：混合液经离心后,按密度大小排列,在离心管中从上到下依次是:第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层;第3层为红色透明液体,是血红蛋白的水溶液；第4层为暗红色沉淀物,主要是红细胞破碎物沉淀.当堂检测1．分离蛋白质不必考虑的因素是（)。A．分子的形状和大小B．蛋白质所带电荷的性质和多少C．蛋白质的溶解度D．蛋白质肽键的结构答案:D解析：所有蛋白质的肽键结构相同，均为“—NH—CO-”，不作为分离蛋白质考虑的因素。2．关于凝胶色谱法的叙述错误的是（）。A．可根据相对分子质量的大小分离蛋白质B．凝胶大多数由多糖类化合物构成C．相对分子质量大的蛋白质优先离开色谱柱D．所用的凝胶是一些微小的无孔球体答案:D解析:凝胶色谱法的凝胶是一些微小的多孔球体，允许小分子蛋白质进入，不允许大分子蛋白质进入，因而增加了小分子蛋白质穿过色谱柱的距离，从而使大分子蛋白质优先离开色谱柱，从而将相对分子质量不同的蛋白质分离。3．在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲溶液,其作用主要是（）。A．使酶的活性最高B．使蛋白质的活性最高C．维持蛋白质所带的电荷D．使蛋白质带上电荷答案：C解析：蛋白质具有两性，在一定pH下，蛋白质分子的某些基团会带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。因此，加缓冲溶液的目的是维持蛋白质所带的电荷不发生改变而不是使蛋白质带上电荷。4．下列有关透析的叙述中，错误的是（）。A．用于透析的薄膜要具有选择透过性B．透析膜一般是用硝酸纤维素制成的C．透析能使大分子保留在袋内,小分子自由进出D．透析可用于更换样品的缓冲液答案：A解析：透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸)制成的，它没有生物活性，故不具有选择透过性(活的生物膜才具有选择透过性）。透析袋能使小分子物质自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。5．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作不正确的是（）。A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B．让吸管管口沿管壁环绕移动,贴壁加样至