血液学检验技术 课件 22.项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

单元四：血栓与止血检验及其应用项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统目录项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验1.掌握：常用纤溶物质检验（3P试验、t-PA、FDP和D-二聚体）原理、注意事项及临床意义。2.熟悉：纤维蛋白（原）降解产物的作用。3.了解：纤溶系统的组成及基本理论。4.具备常用纤溶物质的检测能力。5.学会分析纤溶物质检验结果。学习目标项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统纤维蛋白溶解系统：简称纤溶系统。其主要作用是将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解，起到修复、祛除和防止血管内由于纤维蛋白沉着(如血栓形成)引起的阻塞作用。纤溶系统功能亢进可引起出血，功能减低则可导致血栓形成，因而纤溶系统具有重要的生理和病理意义。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统（一）纤维蛋白（原）溶解系统组成1．纤溶酶原激活物（1）组织纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,t-PA)（2）尿激酶样纤溶酶原激活物(urokinase-likeplasminogenactivator,u-PA)项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统（一）纤维蛋白（原）溶解系统组成2．纤溶酶原(plasminogen,PLG)和纤溶酶(plasmin,PL)PLG由肝合成的一种单链糖蛋白，以无纤溶活性的酶原形式存在于血液中。纤溶酶原在其激活物t-PA或u-PA作用下转变成有纤溶活性的双链结构丝氨酸蛋白水解酶，它除了能裂解纤维蛋白原和纤维蛋白外，还参与分解凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ和因子Ⅻa等。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统（一）纤维蛋白（原）溶解系统组成3.纤溶抑制物（1）纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogenactivatorinhibitor,PAI）能特异性抑制t-PA和u-PA激活纤溶酶原，主要有二种：①纤溶酶原抑制物-1(PAI-1)，其作用是和t-PA或u-PA形成复合物使其失活。PAI-1也可抑制凝血酶、因子Ⅸa、Ⅻa、激肽释放酶和APC的活性。②纤溶酶原抑制物-2(PAI-2)，对t-PA的抑制作用较PAI-1弱。正常人血浆中无PAI-2，但在妊娠早期开始出现，随着妊娠而增高，产后迅速减少或消失。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统（一）纤维蛋白（原）溶解系统组成3.纤溶抑制物（2）纤溶酶抑制物：正常血浆中有很多非特异性纤溶酶抑制物，最重要且与纤溶酶形成1:1复合物（PAP）使其失去蛋白水解活性的特异性抑制物是α2抗纤溶酶（α2-antiplasmin，α2-AP）。α2-AP是一种肝合成的单链糖蛋白，血浆浓度为50mg/L。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统（一）纤维蛋白（原）溶解系统组成3.纤溶抑制物（3）凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）：TAFI是一种血浆蛋白质，以酶原的形式存在，血浆浓度约为75nM，被凝血酶-TM复合物激活后，形成具有蛋白水解活性的TAFI（TAFIa，即羧基肽酶），TAFIa通过抑制PLG激活、抑制纤溶酶的纤溶活性和水解纤溶蛋白的羧基端赖氨酸而抑制纤溶酶。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统（二）纤维蛋白（原）溶解机制1．纤溶酶原激活途径项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统（二）纤维蛋白（原）溶解机制2．纤维蛋白（原）降解机制（1）纤维蛋白原的降解：（2）可溶性纤维蛋白的降解：（3）交联纤维蛋白的降解：项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

一、纤维蛋白（原）溶解系统（三）纤维蛋白（原）降解产物的作用

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二、纤维蛋白溶解系统检验（一）优球蛋白溶解时间测定（二）血浆组织纤溶酶原激活物测定（三）血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定（四）血浆纤溶酶原活性测定（五）血浆a2-抗纤溶酶活性测定（六）血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验（七）血浆纤维蛋白（原）降解产物的检测（八）血浆D-二聚体测定项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（一）优球蛋白溶解时间测定【实验原理】血浆优球蛋白组分中含纤维蛋白原、纤溶酶原和纤溶酶原激活物等，但不含纤溶酶抑制物。用低离子强度和Ph4.5的溶液沉淀和分离优球蛋白，再溶于缓冲液中，加钙或凝血酶使其凝固，测定凝块完全溶解的时间，即优球蛋白溶解时间。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（一）优球蛋白溶解时间测定【试剂】(1)0.109mol/L枸橼酸钠。(2)0.025mol/L氯化钙溶液（或2U/ml凝血酶溶液）。(3)1%醋酸溶液。(4)硼酸盐溶pH9.0:氯化钠9g、硼酸钠1g、蒸馏水加至1000ml。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（一）优球蛋白溶解时间测定【操作】(1)快速分离枸櫞酸抗凝血浆。(2)取尖底离心管1支，加蒸馏水7.5ml和1%醋酸溶液0.12ml，使pH为4.5，置冰浴中。(3)取血浆0.5ml加到上述离心管中，混匀，继续置冰浴中10min,使优球蛋白充分析出。

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二、纤维蛋白溶解系统检验（一）优球蛋白溶解时间测定【操作】(4)以3000r/min离心5min，倾去上清液，倒置离心管于滤纸上，吸去残余液体，沉淀即为优球蛋白。(5)加硼酸盐缓冲液0.5ml于沉淀中，37℃水浴，轻轻搅拌使沉淀溶解。(6)加0.025mol/L氯化钙溶液（或2U/ml凝血酶溶液）0.5ml，凝固时开始计时。置37℃水浴中观察凝块完全溶解不见絮状物为止，所需时间即为ELT。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（一）优球蛋白溶解时间测定【参考区间】加钙法:129min48s±4min6s加凝血酶法：（123±24）min项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（一）优球蛋白溶解时间测定【临床意义】(1)ELT缩短（<70min）表明纤溶活性增强，见于原发性和继发性（DIC）纤溶亢进。但在DIC早期尚未发生继发性纤溶亢进是，或当纤溶极度亢进，纤溶酶绝大部分已被消化时，可为阴性。(2)ELT延长表明纤溶活性减低，见于血栓形成前期和血栓形成性疾病。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（二）血浆组织纤溶酶原激活物测定【实验原理】根据双抗体夹心法原理，将纯化的组织纤溶酶原激活物（t-PA）单克隆抗体包被在反应板上，加入待测样本和标准品，加过氧化物酶标记的t-PA抗体，再加邻苯二胺（OPD）显色后读取A值，计算出其血浆浓度。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（二）血浆组织纤溶酶原激活物测定【试剂】(1)t-PAELISA法试剂盒(2)洗涤液0.025mol/L氯化钙-聚山梨醇。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（二）血浆组织纤溶酶原激活物测定【操作】(1)常规采血，分离PPP。(2)试剂盒要求将待测血浆和标准品加入包被好的反应板孔内，37℃温育1h后，洗涤甩干。(3)加过氧化物酶标记抗体，37℃温育1h后洗涤甩干，立即加OPD显色(避光)。(4)显色20min(室温)，以4mol/L硫酸终止反应，在波长492nm的酶标仪上读取A值。(5)制成直线回归方程，并计算出t-PA的样本浓度。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（二）血浆组织纤溶酶原激活物测定【参考区间】t-PA：1～12μg/L项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（二）血浆组织纤溶酶原激活物测定【临床意义】(1)t-PA增高见于应激反应、剧烈运动、先天性增高以及纤溶亢进时。(2)减低往往见于高凝状态和血栓性疾病、口服避孕药、肥胖症等。PAI增高见于血栓性疾病和高凝状态，减低见于原发性或继发性纤溶症。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（三）血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定【实验原理】根据双抗体夹心法原理，将纯化的纤溶酶原激活物抑制物（PAI）单克隆抗体包被在反应板上，加入待测样本和标准品，加过氧化物酶标记的PAI抗体，再加邻苯二胺（OPD）显色后读取A值，计算其血浆浓度。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（三）血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定【试剂】(1)PAIELISA法试剂盒。(2)洗涤液0.025mol/L氯化钙-聚山梨醇。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（三）血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定【操作】(1)常规采血，分离PPP。(2)试剂盒要求将待测血浆和标准品加入包被好的反应板孔内，37℃温育1h后，洗涤甩干。(3)加过氧化物酶标记抗体，37℃温育1h后洗涤甩干，立即加OPD显色(避光)。(4)显色20min(室温)，以4mol/L硫酸终止反应，在波长492nm的酶标仪上读取A值。(5)制成直线回归方程，并计算出PAI的样本浓度。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（三）血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定【参考区间】PAI:2～10μg/L项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（三）血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定【临床意义】(1)PAI增高见于血栓性疾病和高凝状态。(2)减低见于原发性或继发性纤溶症。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（四）血浆纤溶酶原活性测定【实验原理】免疫扩散法：受检血浆（含抗原）加到含抗纤溶酶原（PLG）血清的琼脂糖扩散板中，自然扩散一定时间后，测定抗原抗体反应沉淀弧的直径计算受检者血浆PLG抗原的含量，其直径与PLG含量呈正相关。发色底物法：向受检血浆中加链激酶（SK)和发色底物（S-2251)，PLG在SK的作用下转变成PL，后者作用于发色底物，释放出对硝基苯胺（PNA）而显色。颜色的深浅与纤溶酶的水平呈正相关，通过计算求得血浆中PLG的活性。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（四）血浆纤溶酶原活性测定【试剂】--免疫扩散法(1)抗人纤溶酶原血清和标准血浆。(2)pH8.2巴比妥缓冲液。(3)琼脂糖。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（四）血浆纤溶酶原活性测定【操作】--免疫扩散法(1)常规采血，分离PPP。(2)制备免疫扩散板以巴比妥缓冲液配制的2%琼脂糖溶液与等量抗血清混合后制成宁搅拌。用打孔器在板上以间距15mm等距打孔，孔径3mm。(3)将标准血浆用巴比妥缓冲液作1﹕2、1﹕4、1﹕8、1﹕16稀释，待测血浆作1﹕2稀释，加入反应板加样孔中（10μl/孔）。(4)置37℃温箱24h，精确测量沉淀弧直径，制成直线回归方程，并计算出待测样本的浓度。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（四）血浆纤溶酶原活性测定【参考区间】--免疫扩散法PLG:230～340mg/L项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（四）血浆纤溶酶原活性测定【临床意义】(1)血浆纤溶酶原含量减低可见于先天性纤溶酶原缺乏症，但更常见于纤溶酶原激活物活性增强的情况，如原发性和继发性纤溶亢进、溶栓治疗后、重症肝炎、肝硬化、肝叶切除术、大手术后、肿瘤播散、严重感染等。(2)纤溶酶原含量增多往往反应纤溶活性的降低，如高凝状态和血栓性疾病。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（五）血浆a2-抗纤溶酶活性测定【实验原理】在待测标本中加入过量的纤溶酶，纤溶酶与标本中的a2-AP结合形成复合物，剩余的纤恪酶水解发色底物S2251，使底物释放出对硝基苯肢(PNA)，生色的深浅与α2-AP活性成反比。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（五）血浆a2-抗纤溶酶活性测定【试剂】(1)纤溶酶。(2)发色底物S2251。(3)标准血浆(20个以上的正常人混合血浆)。(4)2mol/L的硫酸终止液。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（五）血浆a2-抗纤溶酶活性测定【操作】(1)将标准血浆稀释10倍，设此时α2-AP活性为200%，按表1加入到酶标板上。(2)将待测标本用缓冲液作20倍稀释，取100μl加入到酶标板中，37℃保温10min。(3)将发色底物及纤溶酶分别用1ml缓冲液溶解，37℃保温30min。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（五）血浆a2-抗纤溶酶活性测定【操作】(4)吸取50μl纤溶酶加入到待测标本中，37℃准确保温2min。(5)吸取50μl发色底物加至上述孔中，混匀，置室温1min左右。加终止液20μI，检测405nm吸光度。(6)以405nm吸光度为纵坐标，以α2-AP:A为横坐标，绘制标准曲线。(7)以待测标本的405nm吸光度值在标准曲线上查出α2-AP:A，再乘以稀释倍数就得到待测血浆的α2-AP:A。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（五）血浆a2-抗纤溶酶活性测定【参考区间】α2-AP:A:95.6±12.8%项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（五）血浆a2-抗纤溶酶活性测定【临床意义】（1）α2-AP:A增高见于静脉、动脉血栓形成、恶性肿瘤、分娩后等。（2）α2-AP:A减低见于肝病、DIC、手术后、先天性α2-AP缺乏症等。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（六）血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验【实验原理】纤维蛋白原在凝血酶作用下释放出A肽和B肽后转变成纤维蛋白单体(FM)。FM具有自行聚合呈肉眼可见的纤维、絮状或胶冻装的特性。如发生继发性纤溶，存在纤维蛋白降解产物，尤其X’片段可和FM形成可溶性复合物，而硫酸鱼精蛋白具有分离这种复合物的能力，可使FM游离出来，形成肉眼可见的纤维素样物质，称为血浆鱼精蛋白副凝固试验,也称3P试验。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（六）血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验【试剂】(1)0.109mol/L枸橼酸钠。(2)1%硫酸鱼精蛋白溶液。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（六）血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验【操作】(1)常规采血，分离PPP。(2)取0.5mlPPP置37℃水浴3min。(3)加入0.05ml(1/10血浆量)的1%硫酸鱼精蛋白溶液，置37℃水浴15min，立刻观察结果。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（六）血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验【参考区间】阴性项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（六）血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验【临床意义】阳性见于DIC早期、中期、严重创伤，大手术，咯血、呕血以及久置冰箱的样品。DIC晚期和原发性纤溶表现为阴性，故在区别原发性和继发性纤溶时有一定意义。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（七）血浆纤维蛋白（原）降解产物的检测【实验原理】胶乳凝集试验（Fi试验）：用特异性抗纤维蛋白（原）D、E片段抗体标记的胶乳颗粒与受检血清混合，如血清中含有FDP，特别是D、E片段，可发生抗原抗体反应，导致胶乳颗粒凝集。胶乳增强散射比浊法：将FDP抗体包被在胶乳颗粒上，与FDP结合后，形成FDP抗原抗体复合物的胶乳凝集颗粒，体积增大，根据散射光的变化计算出其含量。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（七）血浆纤维蛋白（原）降解产物的检测【实验原理】ELISA法：将抗FDP抗体（多克隆或单克隆抗体）包被于固相载体上（酶标反应板），加入待测血清或尿液。如存在FDP即发生抗原抗体反应，形成的复合物再与酶联抗体（过氧化物酶标记的相同抗体）反应，以OPD显色，读取的A值与FDP含量呈正比，参照用标准品制成的标准曲线可算出待测样品的FDP量。项目二十二：纤维蛋白（原）溶解系统及检验

二、纤维蛋白溶解系统检验（七）血浆纤维蛋白（原）降解产物的检测【参考区间】胶乳凝集法阴性；散