王金发细胞生物学网络课件讲义全集

王金发《细胞生物学》网络课件讲义全集1.1细胞的发现及细胞学说的创立1.1.3细胞学理论对细胞学发展的推动作用1.4.2真核细胞的两种主要类型:动物细胞和植物细胞1.7.1细胞生物学的主要研究内容和发展方向学习指导所有的生物都是由细胞(cell)构成的。除了病毒、类病毒等是非细胞的生命体以外，其它生命有机体的结构和功能单位都是细胞。细菌、酵母等微生物是以单细胞的形式存在，而高等动、植物则是由多细胞构成的，如人大约有3研究细胞及其生物学功能的科学称为细胞生物学(cellbiology)。1.1细胞的发现及细胞学说的创立蜂窝，称为"cella"，这是人类第一次发现细胞，不过，胡克发现的只是死的细胞壁(图1-1)。胡克的发现对细胞学的建立和发展具有开创性的意义，其后，生物学家就用"cell"一词来描述生物体的基本结构。倍左右)，并观察到了血细胞、池塘水滴中的原生动物、人类和哺乳类动物的精子，这是人类第一次观察到完整的活细胞。列文虎克把他的观察结果写信报告给了英国皇家学会，得到英国皇家学会的充分肯定，并很快成为世界图1-1胡克所用的显微镜及观察的栎树细胞壁植物是由细胞构成的，植物的胚是由单个细胞产生的。是由细胞构成的;②所有的生活细胞在结构上都是类似的。有细胞的分裂，即细胞来自于细胞。细胞学说的创立大大推进了人类对生命自然界的认识，有力地促进了生命科学的进步。恩格斯对细胞学说给予极高的评价，把它与进化论和能量守恒定律并列为19世纪的三大发明。为什么恩格斯对细胞学说给予与此高的评价?1.1.3细胞学理论对细胞学发展的推动作用细胞科学是实验科学，而实验科学的发展既依赖于实验观察，又有待于理论的升华。尽管细胞是1665年发现的，但在其后的170年的时间里细胞学的研究没有什么大的发展，究其原因主要是没有将这一发现上升为理论，因而也就没有指导意义。但是，细胞学理论创立之后，在这一理论的指导下，细胞学得到了突飞猛进的发展。■原生质理论的提出1840年普金耶(Pukinje)在动物、1846■细胞受精和分裂的研究■一些重要细胞器的发现在这短短的25年里，取得如此多的成果，除了细胞学说本身的贡献外，技术革新起着重要的作用。细胞染色技术、切片技术、显微技术等的不断改进和创新保证了科学研究的进步。当然，更重要的是这一时期人才辈出，他们的不断追求和探索的精神才是细胞学得以发展的原动力。如何理解人才、理论和技术在科技发展中的作用?对细胞生物学的发展阶段划分不一，本书分为四个时期：段研究细胞学的问题，其特点是从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学、遗传发育机理的研究。由于实验研究不断同相邻学科结合、相互渗透，导致了一些重要分支学科的建立和发展：分子细胞生物学阶段。虽然细胞学说是根据光学显微镜对不同类型的细胞进行形态观察得出的结论，但是它们在结构和功能上的相似性甚至超过形态上的相似性。无论何种来源的细胞，都具有基本相似的功能。●细胞能够进行自我增殖和遗传细胞能够以一分为二的分裂方式进行增殖，动植物细胞、细菌细胞都是如此。●细胞都能进行新陈代谢细胞内有机分子的合成和分解反应都是由酶催化的，即细胞的代谢作用是由酶控制的。细胞代谢包括物质代谢和能量代谢，这也是细胞的基本特性。●细胞都具有运动性所有细胞都具有一定的运动性，包括细胞自身的运动和细胞内的物质运动。不同类型的细胞不仅具有功能上的相似性，而且还具有结构上的相似性。■细胞都具有选择透性的膜结构细胞都具有一层界膜，将细胞内的环境与外环境隔开。膜有两个基本的作用，一是在细胞内外起障碍作用，即不允许物质随意进出细胞，二是要在细胞内构筑区室，形成各功能特区。植物细胞与动物细胞的一个重要差别是在植物细胞质膜的外面还有一层细胞结构，即细胞壁。在离体条件下细胞壁很容易被酶水解掉，脱去细胞壁的细胞就称为原生质体(protoplast)。■细胞都具有遗传物质和遗传体系细胞内最重要的物质就是遗传物质DNA。现有的研究表明，在生命的进化过程中，最早的遗传物质是RNA而不是DNA，也就是说先出现RNA，后逐渐进化形成DNA。证明最早的遗传物质是RNA而不是DNA的证据是什么?由于DNA储存遗传信息较之RNA更稳定，复制更精确，并且易于修复，所以它取代RNA成为遗传信息的主要载体。为了保证遗传信息的准确传递，RNA被保留下来，专司遗传信息的转录和指导蛋白质的合成。所以，无论是原核生物还是真核生物都具有DNA和RNA。不过，少数原始生命形式的病毒，仍然保留RNA作为遗传信息的■细胞都具有核糖体所有类型的细胞，包括最简单的支原体都含有核糖体。真核细胞和原核细胞的核糖体不仅功能相同，在结构上也十分相似，都是由大小两个亚基组成的，只不过原核细胞的核糖体比真核细胞的核糖体稍小一些。细胞具有多种多样的形态(图1-2)，有球形、杆状、星形、多角形、梭形、圆柱形等。多细胞生物体，依照细胞在各种组织和器官中所承担的不同功能，分化形成了各种不同的形状。这些不同的形状一方面取决于对功能的适应，另一方面亦受细胞的表面张力、胞质的粘滞性、细胞膜的坚韧程度，以及微管和微丝骨架等因素的影响。举例说明细胞的形态与功能是相关的。细胞最为典型的特点是在一个极小的体积中形成极为复杂而又高度组织化的结构。典型的原核细胞的平均大小在图1-3典型的原核、真核、病毒和分子的大小■细胞体积的守恒定律不同细胞的大小变化很大，如人的卵细胞的直径只有0.1mm，而鸵鸟的卵细胞的直径细胞的体积一般是相近的，不依生物个体的大小而增大或缩小。如人、牛、马、鼠、象的肾细胞、肝细胞的大小基本相同。因此，器官的大小主要决定于细胞的数量，与细胞的数量成正比，而与细胞的大小无关，把这种现象称之为"细胞体积的守恒定律"。■限制细胞体积大小的因素●体积同表面积的关系以球形细胞为例(体内的细胞并非都是球形)，计算体积同表面积的关系(图1-4)。结果表明，球形细胞增大，其体积增加的比例要比表面积增加得多。这样，当细胞增大到一定程度时，质膜的表面积就不适应细胞进行内外物质的交换，细胞为了维持一个最佳的生存条件，必需维持最佳的表面积，从而限制了体积的无限增大。●细胞内关键分子的浓度一些重要的分子在细胞内的拷贝数是很少的，当细胞体积增大时，这些分子的浓度就越来越稀释，一些重要的生化反应需要一定的浓度才能进行，所以细胞内分子浓度就成了限制细胞体积无限增大的另一个因素。真核细胞的体积一般是原核细胞的1000倍，真核细胞如何解决细胞内重要分子的浓度问题?●酶蛋白质种类的限制细胞不仅对体积的增大有限制，而且对体积的减少也有限制。一个生活细胞要维持正常的独立生活功能，最低限体是目前所知最小原核细胞，很显然，细胞体积最小化受制于维持细胞生命活动所需的酶和蛋白质种类的最低限生命是物质的，所有的细胞都是由水、蛋白质、糖类、脂类、核酸、盐类和各种微量的有机化合物所组成(表1-1)。蛋白质、糖类、核酸和脂类等化合物也被称为生物分子(biom化学成份占细胞的重量(%)每种分子的类型数所以水是细胞生命的活动介质。相邻水分子间的关系是靠氢键维系的(图1-7)，这种氢键赋予水分子哪些独特的性质，对于生活细胞有什么重要水在细胞中既是反应物也是溶剂。水分子参与了生命活动的一些重要反应，在大分子的合成过程中水是产物，而在分解反应中水是反应剂。除了作为反应剂外，由于水是极性分子，所以是各种极性有机分子和离子的最好溶剂，主要是靠氢键的形成使这细胞中的水以两种形式存在:游离水和结合水。游离水是细胞代谢反应的溶剂;结合水则是以氢键和蛋白质结合的■无机盐的作用分类主要分为四大类●各种酶反应所需的主要离子，包括Ca2+、Cu2+、M●某些生物需要的特殊微量元素，如碘、铯、溴等。■无机离子的功能有:维持细胞内的pH和渗透压，以保持细胞的正常生理活动;同蛋白质或脂类结合组成具有特定功能的结合蛋白，参与细胞的生命活动；作为酶反应的辅助因子。细胞内有四类有机小分子:单糖、脂肪酸、氨基酸和核苷酸。细胞内的有机小分子约占细胞总有机物的十分之一，但却有许多不同的种类。糖是细胞的营养物，包括单糖、二糖、低聚糖(2～6个糖)和多糖(由几百到几千个单糖分子组成)，其中多糖属于生单纯的多糖由许多葡萄糖残基组成，在动物细胞内主要是糖原，在植物细胞内主要是淀粉。它们是细胞内贮存的营养物质，提供细胞代谢所需的能源(图1-9)。脂肪酸是脂的主要成分。细胞内几乎所有的脂肪酸分子都是通过它们的羧酸基团与其它分子共价连接。各种脂肪酸的碳氢链长度及所含碳—碳双键的数目和位置的不同，决定了它们不同的化学特性。脂肪酸是营养价值较高的营养物，按重量比计算，脂肪酸分解产生的能量，相当于葡萄糖所产生能量的两倍。脂肪酸在细胞内最重要的功能是构成细胞结构。核苷酸是组成核酸的基本单位，每个核苷酸分子由一个戊糖(核糖或脱氧核糖)、一个含氮碱基(嘧啶或嘌呤)和一个细胞内主要有20种氨基酸，它们的差别主要是R侧链不同，决定了氨基酸不同的化学性质。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，蛋白质是长的线性的氨基酸多聚体，这些氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间形成的肽键而首尾相连，构成多肽链(图1-12)。细胞中的有机分子，根据它们在细胞代谢活动中的作用可分为四种不同类型。构成细胞的基本结构，并且执行细胞基本功能的巨大的、高度组织起来的生物分子称为生物大分子。细胞内有四种类型的生物大分子:核酸、蛋白质、多糖，以及某些类型的脂类，前三种是由单体构成的多聚体。细胞内大约有3000种大分子。生物大分子的功能取决于构成它们亚单位的种类和排列顺序。细胞内大多数生物大分子的半寿期都很短，它们不断地被降解，并被新的生物大分子所取代。所以细胞内有许多构成大分子的构件，如单糖、氨基酸、核苷、脂肪酸等。●代谢物细胞内的分子具有十分复杂的结构，通常要一步一步地合成。细胞中有许多不同的代谢途径，发生不同的化学反应。在不同的代谢途径中，通常先合成的物质是后合成物质的前体。●非细胞功能的分子这是非常广泛的一类分子，但是量并非很大。这类分子包括各种维生素、蛋白类激素、能量储存分子(如ATP)、某些磷酸化的物质，以及代谢废物等。多糖是细胞的重要支持材料，是细胞壁的主要结构成分。糖同蛋白质结合形成糖蛋白。蛋白质的糖基化不仅对蛋白分子的理化性质有很大影晌，而且对蛋白质的生物功能也有很大影响。在迄今已知的上千种蛋白质中，50％以上是糖基化的。许多糖蛋白具有酶、激素、抑制剂等各不相同的生物活性，相当一部分糖蛋白，其分子中糖链是实现生物功能所必需的，去除或破坏糖链会使它们失去生物功能。■核糖核酸与脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸即是DNA分子，是遗传物质，只有一种类型，其结构是双螺旋的(图1-13)。RNA即是核糖核酸，种类较多，有tRNA、rRNA、mRNA，还有一些存在于细胞核和细胞质中的小分子RNA，它们具有在不同的功能，在某些病毒中也是遗传物质。蛋白质是细胞内行使各种生物功能的生物大分子，估计在一个典型哺乳动物细胞中有10,000种不同的蛋白质执行功能举例功能举例结构材料胶原、角蛋白运动肌动蛋白、肌球蛋白营养储存酪蛋白、铁蛋白激素胰岛素、生长激素物质运输Na+-K+泵信号转导乙酰胆碱受体基因调控Lac操纵子渗透压调节血清白蛋白免疫作用抗体毒素白喉和霍乱毒素电子转移细胞色素酶(催化作用)氧化还原酶、连接酶等组成蛋白质的基本构件只是20种氨基酸。为什么蛋白质却具有如此广泛的功能?近年来的研究发现，很多大的蛋白质分子都是由两个或两个以上结合紧密的功能区域构成的，这种区域称为结构域(domain)，结构域在功能上具有半独立性，它可与不同的因子结合。图1-14显示了从马肌细胞中分离的磷酸甘细胞是由化学物质物质组成的。由于细胞的生命活动是高度有序的，所以细胞内的化学物质不可能杂乱无章地堆集在一起，而是有规则地分级组装成复杂的细胞结构，如核糖体、细胞核、高尔基体和细胞骨架等。不仅如此，在多细胞有机体中，细胞要组成不同的组织，再由组织形成器官(图1-15)。由生物分子组装成细胞，可以粗略地分成四级∶●第一级是构成细胞的小分子有机物的形成，包括碱基、氨基酸、葡萄糖、软脂酸，这些构成了细胞的基石；●第二级由基石组装成生物大分子，包括DNA、RNA、蛋白质、多糖;●第三级由生物大分子进一步组装成细胞的高级结构，如细胞膜、核糖体、染色体、微管、微丝等;●第四级由生物大分子组装成具有空间结构和生物功能的细胞器，如细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基复合体、溶酶体、微体等。最后再由细胞器组成细胞。各种生物大分子到底如何组装成有功能的细胞结构和组织是当前细胞生物学所要研究的基本问题。曾经对组装的■反应复合物的组装随着分子生物学研究的深入，人们更多地注意反应复合物的组装及其在生命活动中的作用。如DNA复制的引发体为什么解决生命科学的问题不能仅靠分子生物学而要靠细胞生物学?细胞分为两大类:原核细胞和真核细胞。细菌是原核细胞的主要类群。细菌细胞的基本特点是:遗传信息量少，内部结构简单，特别是没有分化成以膜为●细菌的细胞通常很小，只有几个微米。细菌细胞的界膜，即细胞质膜的外侧都是被一层坚硬的细胞壁包裹起●原核细胞的细胞质膜是多功能的，其最重要的功能就是运输作用，包括营养物质的吸收、废物的排除、能量细菌质膜还参与遗传物质的复制和分配，因为细菌没有细胞核，所以细菌的DNA在复制时只能结合在质膜上，然●细菌没有细胞核结构，仅为DNA与少量RNA或蛋白质结合物，也没有核仁和有丝分裂器。E.coli的DNA所以细菌的RNA转录与蛋白质翻译几乎是同步进行的，这是原核与真核生物的最主要的差别。细菌除了具有染色体DNA外，还有核外DNA，即质粒DNA。质粒是比染色体小的遗传物质，为环状的双链DNA，常常赋予细胞●细菌体表还有菌毛和鞭毛。菌毛有两种，一种短而细，具有呼吸作用；另一种是数量少但细长的性纤毛，为雄性菌所特有。鞭毛是细菌的运动器官，鞭毛蛋白的氨基酸组成与横纹肌中的肌动蛋白相似。1.4.2真核细胞的两种主要类型:动物细胞和植物细胞真核细胞的主要特点是以生物膜为基础进一步分化，使细胞内部产生许多功能区室，它们各自分工负责又相互协调和协作。动物细胞是真核细胞的主要类动物细胞具有的结构，植物细胞基本都有，但是植物细胞还有一些独特的结构，包括细胞壁、质体、中央液泡表1-3动物细胞与植物细胞的比较细胞器动物细胞植物细胞细胞壁无有溶酶体有无乙醛酸循环体无有通讯连接方式间隙连接胞间连丝胞质分裂方式收缩环细胞板将真核细胞内的结构体系归纳起来可分为三大系统:生物膜结构体系、遗传信息表达结构体系、细胞骨架结构体系。原核细胞和真核细胞无论在结构上还是在功能上都有许多相同之处（表1-4但真核细胞具有许多原核细胞所没表1-4原核细胞与真核细胞的相同点1.都具有类似的细胞质膜结构2.都以DNA作为遗传物质，并使用相同的遗传密码3.都是以一分为二的方式进行细胞分裂4.具有相同的遗传信息转录和翻译机制，有类似的核糖体结构5.代谢机制相同(如糖酵解和TCA循环)6.具有相同的化学能贮能机制，如ATP合成酶(原核位于细胞质膜，真核位于线粒体膜上)7.光合作用机制相同(蓝细菌与植物相比较)8.膜蛋白的合成和插入机制相同9.都是通过蛋白酶体(蛋白质降解结构)降解蛋白质(古细菌与真核细胞相比较)1.细胞分裂分为核分裂和细胞质分裂，并且分开进行2.DNA和蛋白质结合压缩成染色体结构，形成有丝分裂的结构3.具有复杂的内膜系统和细胞内的膜结构(如内质网、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、胞内体等)4.具有特异的进行有氧呼吸的细胞器(线粒体)和光合作用的细胞器(叶绿体)5.具有复杂的骨架系统(包括微丝、中间纤维和微管)6.有复杂的鞭毛和纤毛7.具有小泡运输系统(胞吞作用和胞吐作用)8.含有纤维素的细胞壁(如植物细胞)9.利用微管形成的纺锤体进行细胞分裂和染色体分离10.每个细胞中的遗传物质成双存在，二倍体分别来自于两个亲本11.通过减数分裂和受精作用进行有性生殖细胞虽然是地球上主要的生命形式，但并非是惟一的生命形式，病毒也是生命体，但它却不具有细胞结构。病毒是19世纪末通过对疾病的研究发现的，无法用光学显微镜观察。病毒没有细胞结构，不能在体外独立生活。在电子显微镜下可观察到病毒颗粒的体积大约在10～100nm之间，比细胞小得多。分组成∶蛋白质外壳和遗传物质的核。病毒的遗传物质可以是DNA，也可是RNA，前者称为DNA病毒，后者称为RNA病毒。病毒的形态各异，有正二十面体的、有柱形的、也有丝状的(图1-23)。病毒不仅没有细胞结构，而且也不能独立生存，只能在活细胞中进行增殖。病毒的生活史包括五个基本过程(图请简述病毒的生活史。人们对细胞的认识是在实验室里将细胞打开，然后分离各种细胞器和生物分子，分别研究它们的功能，但是我们能够打开的细胞只是当今生活的细胞，是进化到十分高级的细胞而无法获得远古时期的活细胞。在进化的过程中细胞生命活动的分子是如何形成的?最早的细胞是如何产生的?真核细胞又是如何起源的?导致细胞生命形成的关键因素是地球的形成及地球大气层条件的变化。一般将细胞生命的起源分为五个阶段：①地球和原始大气层的形成；②有机分子的自发形成；③分子聚合体的形成；④生命初级聚合体的形成；⑤原始细根据化石资料分析，地球上最早的细胞出现在35亿年前。关于地球上细胞生命起源有两种假说，一种假说认为细胞是由已存在于地球上的分子产生的，另一种假说则认为细胞是从别的宇宙空间来到地球的。这一假说得到了实验的支持。实验的设计者是StanleyMiller，当时是一位研究生，他设计了一个实验装置，证明在合适的物理化学条件下可以自动合成有机分子。Miller如何证明在合适的物理化学条件中可以自动合成有机分子？真核细胞是由原核细胞进化而来，这是生物学家的基本共识。原核细胞向真核细胞进化的主要事件是呼吸代谢的发展和内膜系统的形成。细胞内两个与能量转换有关的细胞器线粒体和叶绿体的起源主要是通过内共生机制，而内膜系统则是通过质膜的内陷形成的(图1-26)。细胞在向多细胞机体进化过程中，最重要的特点是出现细胞的分化，即在多细胞的机体内，各种细胞向不同方向发展，形成结构和功能各异的不同组织，但又互相协调成为一个有机的整体。在多细胞的机体内，有一部分细胞高度特化，成为下一代机体的起源，这些细胞称为生殖细胞(germcell)，以1.7.1细胞生物学的主要研究内容和发展方向从生命结构层次来看，细胞生物学位于分子生物学和个体生物学之间，同它们互相衔接、互相渗透。因此，从这一意义上来说，细胞生物学是一门承上启下的学科，和分子生物学一起同是现代生命科学的基础，并广泛渗透到遗传学、发育生物学、生殖生物学、神经生物学和免疫生物学等的研究中，和农业、医学、生物高新技术的发展有密切的关系，是生命科学的重要支柱之一。90年代中期，国家自然科学基金委员会组织一批细胞生物学方面的专家就我国的细胞生物学发展的13个方面的研2l世纪人类将面临严重的挑战，细胞生物学作为生命科学中的重要基础学科，是连接整体与分子的重要一环，将会在新的生命科学世纪中发挥其重要的作用。展望未来，细胞生物学的前景无限广阔。课程学习：2.细胞生物学研究方法>2.细胞生物学研究方法2.1.1光学和电子显微镜成像原理2.1.3光学显微镜的样品制备与观察2.3.2细胞融合与单克隆抗体技术2.5.3选择性基因敲除与转基因鼠学习指导课程学习：2.细胞生物学研究方法2.细胞生物学研究方法生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验得以发现和发展的。方法上的突破，对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用。20世纪30年代发展起来的电子显微镜导致细胞结构和功能研究发生了一次革命，使生物学家得以从亚显微水平上图2-1光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构2.1.1光学和电子显微镜成像原理不管是何种显微镜，镜像的形成都需要三个基本要素:①照明系统，②被观察的样品，③聚焦和成像的透镜系统(图图2-2光学和电子显微镜的基本结构在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素，因为波长决定能被检测样品的最小极限。波长越长，波幅的跨度就越大，所能观察到的物体极限就越大(图2-3)。●光学和电子显微镜成像的光学原理是相同的，其中最重要的是光子和电子都具有波的行为。当光子和电子穿过透镜到达聚焦点时，由于波的干涉(interference)性质而成像。实际上通过透镜观察到的样品的镜像是通过透镜波的干涉累加或消除，即衍射(diffraction)的结果。●焦距与角孔径半角α(图2-5)，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜，最好的光学显微镜的角孔径大约是700。角孔径是光从样品进入透镜的半角α。(a)小孔径透镜;(b)大角孔径透镜。角孔径越大，透过透镜的信息越多，最好的玻璃透镜的角孔径大约是700透镜最重要的性质就是它的分辨率，分辨率(R)可用以下公式计算:0.61是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度。从上式可知，角孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径越大，这些都可以使分辨率提高。由于分辨率表示的是能够区别两个点间最近距离的能力，所以R值越小，分辨率越高。从分辨率的表达式来看，NA越大，分辨率越高，或者波长越短，分辨率越高。●一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0.2μm，称之为分辨极限(limitresolution)。●最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。总放大率=物镜放大率×目镜放大率，放大率同样受分辨极限的限制。一般来说，光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的1000倍。由于透镜的数值孔径的范●增大角孔径或缩短波长可提高光学显微镜的分辨率。如果用波长比普通波长短得多的电子波代替光波，分辨率可大大提高，电子显微镜就是在这种需求下被发明的。表2-1是光学显微镜与电子显微镜某些特性的比较。表2-2电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本领光源透镜真空光学显微镜300nm可见光玻璃透镜不需真空光学显微镜(lightmicroscope)是光学显微技术的主要工具，自问世以来已有400多年历史。光学显微镜是利用光线照明，使微小物体形成放大影像的仪器。现今使用的光学显微镜都是由几个透镜组合而成，所以又称为复合显微比较高级的显微镜上都设有倾斜式的双目镜筒(图2-7)。在物镜转换器上方装有四个棱镜，使经过物镜的光线平分为两路到达目镜，故双筒显微镜的亮度要比单筒者为暗。双筒显微镜的优点为同时用两眼观察，有较强的立体感。荧光显微镜的工作原理是利用紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等)发出强烈的紫外线光源，通过照明设备把显微固定的切片或活染的细胞透视出来，基本成像原理示于图2-8。相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很大的不同(图2-9)，可用于观察未染色的活细胞(图图2-9相差显微镜的光学部件及光线通路暗视野显微镜是利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以观察未经染色的活体或胶体粒子(图2-11)。暗视野显微镜主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样，所不同的只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。前者置于载物台之下，而后者在载物台的上方。集光器与载物台之间的工作距离提高，可以放置培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行照明和观察(图2-12)课程学习：2.细胞生物学研究方法>>2.1.3光学显微镜的样品制备与观察2.1.3光学显微镜的样品制备与观察由于大多数细胞的成分不影响光线的穿透，无法形成反差，所以在一般光学显微镜下，几乎看不清未经处理的细胞。为了看清细胞内含物，就必须对细胞样品进行一些特殊的处理，为此建立和发展了样品的各种制备技术。■样品的固定(fixation)●目的:生物组织在染色前先进行固定的目的是杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。●做法:样品固定的最简单做法是将样品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。一般用具有缓冲作用的醛类固定液，用甲醛或戊二醛作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。样品制备的第二步是将固定的组织制备成切片。为此，样品首先要被包埋在介质中，通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，然后将之硬化成固体的包埋块，随后用专门的切片机切割包埋块，制备成薄切片(图2-13)。适用于光学显微镜观察的切片厚度为l～10μm。大多数细胞总重量的70%是水，对可见光几乎是透明的，只有很少的内含物不透光。染色的目的就是给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。19世纪初，发现某些有机染料可染生物组织，并对细胞特殊部位的着色具有选择性。如苏木精(hematoxylin)对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红(eosin)可使细胞质染色；苏丹染料(Sudandyes)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。但对许多染料的特异性染色机理尚不清楚。●采用比有机染料更为特异的染色剂及酶细胞化学方法，可以了解细胞和组织中大致的化学组成，及某些活性基●为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类，常利用一些显色剂与所检测物质中特殊基团的特异性结合，通过显色剂在细胞中出现的部位和颜色显示的程度，从而判断被检物质在细胞中的分布和含量。例如，利用Feulgen反应(图2-14)可特异性检测细胞中的DNA，PAS反应可用于检测植物中的淀粉、纤维素及动物细胞中的糖原、粘蛋白等。●将细胞或组织切片与适宜的底物共同温育，切片中的酶会水解底物，再将所释放物质转变成不后者所在部位即是组织细胞中酶的活性部位。放射自显影技术是用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置，基本过程如图2-15大大提高显微镜的分辨率。的结构，如细胞膜、线粒体、细胞核、高尔基体、中心粒等细胞器的细微结构。将在光学显微镜中观察不到而只电子显微镜与光学显微镜在总体结构的设计上有很大的差别(图2-16)。在种类上，电镜可分为两大类:透射电子显微镜和扫描电子显微镜。透射电子显微镜主要是让电子束穿透样片而成像。电子显微镜基本结构由三大部分组成∶电子光学系统(镜筒)、真由于电子显微镜必需在高度真空条件下进行工作，阴极与阳极之间会放电，灯丝也会因受到氧化或被阳离子轰击而缩短寿命，所以设计了真空系统。电子学系统即供电系统，需要高压稳压。为什么电子显微镜需要真空系统?扫描电子显微镜(图2-17)使用与透射电子显微镜完全不同的方式成像，即用电视的方式成像。扫描电子显微镜主要由电子光学系统和显示单元组成，它的光学系统结构示于图2-18。如同光学显微镜，电子显微镜的样品也需固定、包埋、切片、染色等(图2-21)。与光镜相比，用于电子显微镜的组织固定有什么特殊的要求?一些生物大分子组成的结构，如病毒、线粒体基粒、核糖体和蛋白质组成的纤维等可以通过负染色电镜技术观察其精细结构，还可以从不同角度观察三维结构(图2-22)。铸型技术是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法(图2-23)。●冰冻断裂复型和冰冻蚀刻光学显微镜和电子显微镜是利用质子和电子使样品直接成像的技术，还有一些显微方法是间接成像。所谓间接成像，举一个例子，假定你拿起一个物体，非常靠近你的眼睛进行观察，你或许觉得该物体有六个平面、十二条边和八个角，然后将你感觉到的画出来，可能是一个盒子，这就是间接成像。下面讨论的是几种间接成像的方法，这些方法都具有原子级分辨力，它们的分辨率比最好的电子显微镜还高10倍。虽然这些方法目前都还有一定的缺陷限制着在生物学中的应用，但具有发展潜力。扫描隧道显微镜由IBM公司瑞士苏黎世研究所的两位学者BinningG.和RohrerH.等在1981年发明的具有原子显像力的显微镜，是根据量子力学中的隧道效应原理而制成的。这种显微镜对生物、物理、化学等学科均有推动作用，DNA双螺旋结构的建立是根据X射线衍射结果推导出来的，至今还没有直接观察DNA结构的方法，所以对其中的微细结构还不够了解。用STM观察了DNA的双螺旋结构，见到DNA分子上的大沟(majorgroove)和小沟图2-26扫描隧道显微镜观察的DNA双螺旋结构■X-射线衍射(X-raydiffraction)X-衍射技术并不涉及显微镜，但是能够根据X-射线通过结晶样品形成的衍射样式成像。这一技术可用于在原子分辨的水平上推测分子的结构。实际上X-射线衍射技术是目前在原子水平上分析蛋白质、核酸和其他生物分子的惟一方法。Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型的主要依据之一就是根据Franklin对DNA晶体衍射的结果(图细胞生物学的一个主要特点是将细胞形态观察与细胞成分分析结合起来，其中一个重要的研究手段就是细胞化学技术。细胞化学技术不是单一的技术，而是一整套有关联的技术，包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术、示踪细胞化学技术等。酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。由于酶的细胞化学定位对研究细胞的生理功能和病理过程具有重要作用，而且很多酶可以作为细胞膜和各种细胞器的标志酶，这为研究细胞器的结构与功能、细胞器的相互关系以及细胞的鉴别等提供有力的手段，这一技术越来越受到重视。免疫细胞化学技术是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。主要分为两大类:免疫荧光技术和将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。细胞分选技术是细胞生物学研究中一个全新的技术领域，主要用流式细胞计(flowcytometer，FCM)对细胞(图2-28)或染色体(图2-29)进行分选，并进行定量分析。流式细胞计主要由以下几部分组成∶●激光光源：可发出合适波长的光。●流室(flowchamber):生物颗粒在此与鞘液(sheathflui流至适当位置，受激光照射可发射出不同的光讯号。●讯号分析部件∶为微型电子计算机装置，对讯号作出分析。什么是细胞分选?原理是什么?图2-29用于染色体分选的染色体荧光探针标记主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。体外细胞培养的条件●废物的排除原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。细胞培养的一般过程如图2-30所示。●细胞系:原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。●细胞株:通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限■动物细胞培养方法分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分钟至几小时)就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态性，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保持接触抑制(contactinhibition)的特性。悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长，如T细胞的培养就是如此。悬浮培养的条件较为复杂，难度也大一些，但是容易同时获得大量的培养细胞。物组织培养是根据植物细胞的全能性发展起来的利用植物植株的不同组织培养成完整植株方法。例如叶片、茎段、根等都可以通过诱导形成愈伤组织，而后培养成植株(图2-231)。用打孔器将植物的叶片打成小圆片，然后与农杆菌进行共培养，接着放在诱导生芽的培养基上进行诱导培养，待芽长出后再转移到生根培养基上，诱导生根，最后移植到土壤中培养成完整的再生植株。一般采用植物的体细胞(二倍体细胞)，先经纤维素酶处理去掉细胞壁，这种脱去细胞壁的细胞称为原生质体。将原生质体放在合适的培养基上，经过诱导分化可以重新长成植株。原生质体也可用于植物细胞融合，然后诱导形课程学习：2.细胞生物学研究方法>>2.3.2细胞融合与单克隆抗体技术2.3.2细胞融合与单克隆抗体技术指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞(图2-33)。有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的的二倍体。1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术，图2-34所示是单克隆抗体制备流程。一旦有了抗体就可以从事多种研究。例如，抗体可用于蛋白质的纯化。将抗体添加到蛋白质的粗提取液中，相应的蛋白就会同抗体结合，然后一起沉淀下来。抗体还可用于许多免疫反应，在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术属显微操作技术。显微操作仪是在显微镜下对细胞进行显微操作的装置(图2-35)，可用于细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术。课程学习：2.细胞生物学研究方法>>2.3.3动物细胞核移植克隆技术1997年，英国苏格兰罗斯林研究所I.WI.Wilmut等首次成功通过细胞融合技术利用成年动物彻底分化的体细胞克隆出子代个体，开创了动物体细胞克隆的新时代。I.Wilmut等从成年个体母羊的乳腺组织分离单个乳腺细胞，然后与去核的羊的卵细胞融合，克隆得到一头绵羊体细胞克隆技术有什么意义？分离技术是一大类技术的总称，包括细胞组分的分离和生物大分子的分离。离心分离细胞组分和生物分子是最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密不同离心力的作用下沉降分离。常用的两类离心分离方法是速度离心(velocitycentrifugation)和等密度离心图2-37不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数■速度离心分离细胞器和大分子在速度离心分离中有两种不同的方法:将含有两种体积稍微不同的颗粒样品小心加在有轻微梯度的离心管介质的液面上(蔗糖或甘油)。离心适当时间，样品中的颗粒向管底部移动(不能离心太久，太久了两种颗粒都会沉淀到底部)，由于体积的不同，移动的区带速度不同。然后收集不同区带的样品进行分析。图2-40密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定(图2-41)。在速度离心时，被分离的分子越小，需要的离心速度越高。但是，离心机中影响速度高低的是转子的半径。离心力(g)是表示某种颗粒沉淀的最好方式，一般根据离心力和离心机转子的半径决定离心速度。常见细胞器离心沉淀所需的离心力列于表2-3。表2-3不同的细胞结构分离所需的离心力层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。三种不同的蛋白质根据它们大小的不同在层析柱中被分离。在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法(图2-43)。(a)琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异的受体结合(胰岛素);(b)亲和层析的基本步骤。离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法(图2-44)。通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。分子生物学是用于在分子水平上研究生物大分子的结构和功能的一系列方法，包括基因重组技术、基因转移、分基因克隆(genecloning)技术是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，它的发明和发展，使生物学家能够在体外进行基因操作、基因转移、基因定点突变等研究。这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行"外科手术"(图2-45)。课程学习：2.细胞生物学研究方法>>2.5.3选择性基因敲除与转基因鼠基因工程技术的建立使人们能够对DNA先进行克隆，随后筛选鉴定特定功能的基因，而不必预先知道所克隆的DNA具有何种功能，基因敲除是最有效的方法之一。基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离、转基因等。图2-47显示了获得敲除CFTR(cysticfibrosis课程学习：2.细胞生物学研究方法>>乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物(图2-48)图2-48用转基因绵羊生产重要的医用蛋白质课程学习：3.细胞质膜与跨膜运输>3.细胞质膜与跨膜运输3.4膜的分子结构及特点3.5.4主动与被动运输、动物与植物主动运输的比较学习指导3.细胞质膜与跨膜运输定，并参与同外界环境进行物质交换、能量和信息传递。另外，细胞质膜在细胞的生存、生长、分裂、分化中请比较质膜、内膜和生物膜在概念上的异同细胞膜是多功能的结构体系，图3-4勾画出它的主要功能:中划分了许多以膜包被的区室。如何理解细胞膜作为界膜对细胞生命活动所起的作用?一方面又作为某些物质出入细胞的障碍。■功能区室化细胞膜的另一个重要的功能就是通过形成膜结合细胞器，使细胞内的功能区室化。例如细胞质中的内质网、高尔基体等膜结合细胞器的基本功能是参与蛋白质的合成、加工和运输；而溶酶体的功能是起消化作用，酸性水解酶主要集中在溶酶体。■参与细胞间的相互作用(intercellularinteraction)在多细胞的生物中，细胞通过质膜行细胞间的多种相互作用，包括细胞识别、细胞粘着、细胞连接等。结合蛋白进行光能的捕获和转换，最后将光能转换成化学能储存在碳水化合物中。简述细胞膜结构的基本功能及对细胞生命活动的影响并且易于提纯和分离，是研究膜结构的最好材料。■红细胞的形态结构14.5μm2，表面积与体积的比值较大，有利于细胞变形、气体交换和携带。有人说红细胞是研究膜结构的最好材料，你能说说理由吗?红细胞的主要功能是将肺吸进的氧运送到身体的其他组织，并带走呼出的CO2(图3-6)。将红细胞分离后放入低渗溶液中，水很快渗入到细胞内部，使红细胞膨胀、破裂，从而释放出血红蛋白(是红细胞中惟一一种非膜蛋白)，此时的红细胞就变成了没有内容物的空壳，由于红细胞膜具有很大的变形性、柔韧性和可塑性，当红细胞的内容物渗漏之后，它的膜可以重新封闭起来(图3-7)，此时的红细胞被称为血影(ghost)。图3-7红细胞血影及封闭、未封闭小泡的形成课程学习：3.细胞质膜与跨膜运输>>■关于膜的化学组成和结构的早期研究18世纪90年代，Overton用植物的根毛作实验，发现脂溶性物质很容易进入细胞，而水溶性的物质却不能。实际还进一步推测，细胞的外被中很可能有胆固醇和卵磷脂的存在，这种推测后来被证明是完全正确的。(lipidmonolayer)的设想。脂单层概念是20世纪初膜结构研究的基础，导致了脂双层的发现。IrvingLangmuir如何通过实验提出脂单层的设想？■红细胞膜脂双层概念的提出展后所测的面积同实际测量的红细胞的表面积之比约为1.8～2.2∶1，为了解释这一结果，他们提出红细胞膜的基红细胞的寿命约为120天，在生存期中大约行程500，000米。在血液循环中，红细胞要穿过小于自身直径一半的微小通道(脾窦)、在脾脏内要经受氧少、低pH值等不利环境的考验、在心脏内又要受到瓣膜涡流冲击。不红细胞在这样长而艰险的运输途径中保持结构的完好，它的质膜起了重要作用，可以推测，红细胞的质膜一定有非常特别的结构，仅仅是双脂层可能难以解释。研究发现红细胞质膜的内侧有一种特殊的结构，是由膜蛋白和纤维蛋白组成的网架，它参与维持细胞质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。■红细胞膜蛋白的组成分离红细胞膜后可用阴离子去垢剂溶解膜蛋白，并通过SDS和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离膜蛋白。通过单向(A)是考马斯蓝染色的胶;(B)表示凝胶上主要蛋白质的位置。几种主要的红细胞膜蛋白是(其中血影蛋白、血型糖蛋白、带3蛋白约占膜蛋白的60%以上):■红细胞膜骨架的形成红细胞膜骨架蛋白的主要成分包括:血影蛋白、肌动蛋白、锚定蛋白、带3蛋白、带4.1蛋白等。红细胞膜骨架的网状支架的形成及与膜的结合过程大致分为三步：●首先是血影蛋白与4.1蛋白、肌动蛋白的相互作用●4.1蛋白同血型糖蛋白相互作用●第三是锚定蛋白与血影蛋白、带3蛋白的相互作用请简述红细胞膜骨架的装配过程构成膜的蛋白质与脂的比例依据膜的类型(如质膜、内质网膜、高尔基体膜)、细胞类型(肌细胞、肝细胞)、生物类表3-1不同生物膜中的蛋白、脂和碳水化合物的量干重的百分比(%)膜蛋白质脂碳水化合物线粒体所有的膜脂都具有双亲媒性(amphipathic)，即这些分子都有一个亲水末端(极性端)和一个疏水末端(非极性端)。这种性质使生物膜具有屏障作用，大多数水溶性物质不能自由通过，只允许亲脂性物质通过。有人说膜脂的功能仅作为膜的骨架，并作为非脂溶性物质进入细胞的障碍，你认为此说有何不妥？■膜脂的主要类型膜脂是生物膜的基本组成成分，约占膜的50%，主要有三大类:磷脂、糖脂、胆固醇。含有磷酸基团的脂称为磷脂，是细胞膜中含量最丰富和最具特性的脂。它有一个极性的头部和一个疏水的尾部(图●胆固醇(cholesterol)细胞膜上另一类脂是固醇类的胆固醇(图3-13)，胆固醇存在于真核细胞膜中。动物细胞膜胆固醇的含量较高，有的占膜脂的50%，大多数植物细胞和细菌细胞质膜中没有胆固醇，酵母细胞膜中是麦角固胆固醇的分子较其他膜脂要小，双亲媒性也较低。胆固醇的亲水头部朝向膜的外侧，疏水的尾部埋在脂双层的中■膜脂的特性和功能●不同类型的膜含有不同类型的膜脂，使这些膜具有不同的特性(表3-2)。表3-2某些生物膜膜脂的组成(脂总重量百分数)脂人的红细胞人的髓鞘牛心脏线粒体E.coli心磷脂鞘磷脂糖脂胆固醇●膜脂都是两性物质，都具有亲水的极性头和疏水的非极性的尾，大多数磷脂和糖脂在水溶液中能够自动形成双分子层结构。当这些兼性分子被水环境包围时，它们就聚集起来，将疏水的尾部埋在里面，亲水的头部露在膜脂的主要功能是构成膜的基本骨架，此外还有其他一些重要功能(表3-30)。脂存在的膜功能主要磷脂磷脂酰胆碱存在于大多数膜中形成脂双层磷脂酰乙醇胺存在于大多数膜中起界膜的作用，防止水磷脂酰丝氨基存在于大多数膜中溶性物质的自由扩散次要磷脂心磷脂线粒体内膜激活染色体磷脂酰肌醇(PI)存在于大多数膜作为三磷酸肌醇的供体鞘脂大多数哺乳动物细胞，特别是神经细胞屏障作用，激活某些酶糖脂叶绿体类囊体的膜的主要脂类屏障作用胆固醇大多数动物细胞膜大多数动物细胞膜膜的流动性膜中的碳水化合物约占膜重量的1～10%，糖含量的多少依细胞的不同而不同。细胞质膜上所有的膜糖都位于质膜的外表面，内膜系统中的膜糖则位于内表面。■膜糖的种类自然界存在的单糖及其衍生物有200多种，但存在于膜的糖类只有其中的9种，而在动物细胞膜上的主要是7■膜糖的存在方式真核细胞质膜中的糖类是通过共价键同膜脂或膜蛋白相连，即以糖脂或糖蛋白的形式存在于细胞质膜上。糖同氨基酸的连接主要有两种形式，即O-连接和N-连接(图3-17)。●N-连接:是糖链与肽链中天冬酰胺残基相连■膜糖的功能膜糖在细胞的生命活动中具有重要作用，它们可以提高膜的稳定性，增强膜蛋白对细胞外基质中蛋白酶的抗性，帮助膜蛋白进行正确的折叠和维持正确的三维构型。同时膜糖也参与细胞的信号识别、细胞的粘着。如同某些糖脂一样，膜蛋白中的糖基是细菌和病毒感染时的识别和结合位点。另外，糖蛋白中的糖基还帮助新合成蛋白质进行正确的运输和定位。●ABO血型决定子(determinant)，即ABO血型抗原，它是一人的血型是A型、B型、AB型还是O型，是由红细胞膜脂或膜蛋白中的糖基决定的。A血型的人红细胞膜脂寡糖链的末端是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，B血型的人红细胞膜脂寡糖链的末端是半乳糖(Gal)，O型则没有这两种糖基，而AB型的人则在末端同时具有这两种糖。由膜脂构成膜的基本结构，但是生物膜的特定功能主要是由蛋白质决定的。功能越复杂的膜，其上的蛋白质种类■膜蛋白的分类据膜蛋白与膜脂的关系分为整合蛋白、外周蛋白、脂锚定蛋白。非共价键附着在脂的极性头部，或整合蛋白亲水区的一侧，间接与膜结合(图3-20)。脂锚定蛋白(lipid-anchored)又称脂连接蛋白(lipid-linkedprotein)，通过共价键的方式同脂分子结合，位于脂双层的外侧。同脂的结合有两种方式，一种是蛋白质直接结合于脂双分子层，另一种方式是蛋白并不直接同脂结合，而是通过一个糖分子间接同脂结合(图3-21)。■膜蛋白的功能胞质膜有着许多重要的生物学功能，这些功能大多数是由膜蛋白来执行的(图3-22，表3-4)。表3-4某些膜蛋白及其功能功能蛋白示例作用方式运输蛋白Na＋泵主动将Na+泵出细胞，K+泵入细胞连接蛋白整合素将细胞内肌动蛋白与细胞外基质蛋白相连酶腺苷酸环化酶在细胞外信号作用下，导致细胞内cAMP产生■膜蛋白的研究方法●膜蛋白的分离●去垢剂的作用机理去垢剂是一端亲水一端疏水的双亲媒性分子，它们具有极性端和非极性的碳氢链。当它们与膜蛋白作用时，可以用非极性端同蛋白质的疏水区作用，取代膜脂，极性端指向水中，形成溶于水的去垢剂-膜蛋白复合物，从而使膜蛋白在水中溶解、变性、沉淀(图3-23)。(a)去垢剂分子，具有极性和非极性端;(b)去垢剂包裹在膜蛋白的疏水区，极性区朝向外侧，使蛋白质成为水溶性，●膜蛋白在膜中位置测定请设计一种方法检测跨膜蛋白的哪一部分位于膜的外侧，哪一部分位于膜的内侧?3.4膜的分子结构及特点虽然细胞质膜是包裹在细胞最外层的界膜，但由于细胞的新陈代谢活动必须同细胞外进行物质交换，这就要求细胞质膜具有特殊的结构，以保证生命活动的正常进行。结构，并将膜结构同所观察到的生物学理化性质联系起来，对后来的研究有很大的启发。1959年，J.D.Robertson利用电子显微镜技术对各种膜结构进行了详细研究，在电子轨结构("railroadtrack")，两条暗线被一条明亮的带隔开，显示暗——明——暗的三层，总厚度为7.5nm，中间层为3.5nm，内外两层各为2nm。并推测:暗层是蛋白质，透明层是脂，并建议将这种结构称为单位膜（这一模型强调了膜的流动由性和不对称性，较好地体现细胞的功能特点，被广泛接受，也得到许多实验的支持。■大肠杆菌细胞质膜●流动镶嵌模型同样适合原核生物。●具有双层膜结构的只是革蓝氏阴性菌，如大肠杆菌（图3-27）。对于革蓝氏阳性菌，如链球菌、葡萄球菌等只●在革蓝氏阴性菌的外膜上有丰富的孔蛋白。细胞质膜的不对称性是指细胞质膜脂双层中各种成分不是均匀分布的，包括种类和数量的不均匀。■不对称性的表现膜的主要成分是蛋白、脂和糖，膜的不对称性主要是指这些成分分布的不对称以及这些分子在方向上的不对称。●膜脂的不对称性膜脂的不对称性表现在脂双层中分布的各类脂的比例不同，各种细胞的膜脂不对称性差异很●膜蛋白的不对称每种膜蛋白在膜中都有特定的排布方向，与其功能相适应，这是膜蛋白不对称性的主要因素。膜蛋白的不对称性包括外周蛋白分布的不对称以及整合蛋白内外两侧氨基酸残基数目的不对称（图3-30）。图3-30红细胞血型糖蛋白A在质膜中不对称分布●膜糖的不对称膜糖以糖蛋白或糖脂的形式存在，无论是糖蛋白还是糖脂的糖基都是位于膜的外表面（图3-31、■不对称性的意义膜脂、膜蛋白及膜糖分布的不对称性导致了膜功能的不对称性和方向性。保证了生命活动的高度有序性。■不对称性的研究方法研究膜结构不对称性的方法有很多种，其中最重要的就是冰冻断裂技术，此外还有同位素标记法、酶水解法等。●冰冻断裂(freezefracture)法冰冻断裂法不仅可用于研究膜组份分布的不对称，也是膜的脂双层结构的直接证据图3-33冰冻断裂技术显示的脂双层及膜蛋白分布的不对称性实验中首先要分离细胞膜，然后用乳过氧化物酶进行膜蛋白标记。过氧化物酶的分子较大而不能透过细胞膜，这样可以用于标记膜外表面的蛋白，标记后，分离膜蛋白，电泳分离和放射自显影进行鉴定。图3-34放射性标记法测定膜蛋白分布的不对称性在酶法标记测定膜蛋白的定向实验中若是要标记膜内侧的蛋白，该如何处理？●脂酶处理法既可以用胰蛋白酶处理法研究膜蛋白的定位，也可以用磷脂酶处理法来研究膜脂在脂双层中的定图3-35用脂酶处理法研究膜脂分布的不对称性请说明用磷脂酶处理法研究红细胞膜脂在脂双层中定位的原理膜的流动性是指构成膜的脂和蛋白质分子的运动性。膜的流动性不仅是膜的基本特性之一，也是细胞进行生命活■流动性的表现形式●膜脂的运动方式脂的流动是造成膜流动性的主要因素，概括起来，膜脂的运动方式主要有四种。③伸缩运动（flex●膜蛋白的运动由于膜蛋白的相对分子质量较大，同时受到细胞骨架的影响，它不可能象膜脂那样运动。主要有以下几种运动形式（图3-37）:①随机移动有些蛋白质能够在整个膜上随机移动。移动的速率比用人工脂双层测得的要低。②定向移动有些蛋白比较特别，在膜中作定向移动。例如，有些膜蛋白在膜上可以从细胞的头部移向尾部。③局部扩散有些蛋白虽然能够在膜上自由扩散，但只能在局部范围内扩散。■膜流动性的研究方法●人、鼠细胞融合实验●淋巴细胞的成斑和成帽反应通过抗体交联膜蛋白分子聚集成斑(patching)、成帽(capping)的现象也是证明膜蛋白在膜平面侧向扩散的例子。这种方法不仅能够证明膜的流动性，同时也能测量膜蛋白扩散的速率。图3-40光脱色荧光恢复技术检测膜流动性得的。他们先标记非膜脂肪，然后让这种脂分别处于室温和零下65℃去检测共振谱，同时将标记的脂插入到细胞膜中再检测共振谱。图3-41电子自旋共振谱技术检测膜脂的移动■影响流动性的因素影响膜流动性的因素主要来自膜本身的组成成分、遗传因子及环境的理化因素(如温度、pH、离子强度、药物等)。●温度(temperature)温度是影响膜流动性的最主要的因素。膜的骨架成份是脂，如同其他的物质一样，既可以晶态，又可以液态存在，主要是根据温度的变化而定。●膜脂的组成对流动性的影响脂的组成对膜流动性的影响主要在三个方面:脂肪酸链的长度、脂肪酸链的饱和程度、脂双层中胆固醇的含量。●胆固醇的影响真核细胞膜中有大量的胆固醇插在膜磷脂之间，可以加强膜脂双层的稳定性，增加膜脂有序性并降低其流动性，●影响膜蛋白运动的因素常见的限制膜蛋白运动的因素有：①细胞质膜下的骨架结构与膜整合蛋白结合限制膜蛋白移动（图3-44）;②细胞外基质中的某些分子与膜整合蛋白结合限制列膜蛋白的移动;③膜蛋白与另一细胞的膜蛋白作用限制了自身的移动;④膜中其他不动蛋白限制了膜蛋白的移动。细胞质膜不仅仅作为物质出入细胞的障碍，还要具有控制分子和离子通过的能力(图3-45)。换句话说，细胞质膜必须具有选择性地进行物质跨膜运输、调节细胞内外物质和离子的平衡及渗透压平衡的能力。■物质运输的范畴细胞进行的物质运输有三种不同的范畴:●胞内运输(intracellulartransport)是真核生物细胞内膜结合细胞器与细胞内环境进行的物质交换;■膜运输机制:被动运输与主动运输●被动运输与主动运输的差异有三个主要的差异(图3-46):起始条件不同、运输方式不同、产生的结果不同。请从起始条件、运输方式、产生的结果等三个方面对主动运输和被动运输进行比较●物质输入细胞的四种方式溶质分子可通过四种不同的方式跨膜运输到细胞内(图3-47)。图中用较大号字母表示溶液的高浓度。(a)通过脂双层的简单扩散；(b)通过膜整合蛋白形成的水性通道进行的被动运输;(c)通过同膜蛋白的结合进行的帮助扩散，也同(a)和(b)一样，只能从高浓度向低浓度运输;(d)通过载体介导的主动运输，这种载体主要是酶，能够催化物质从低浓度向高浓度运输。无论是被动还是主动运输，都有膜蛋白的参与，这些蛋白被称为膜运输蛋白。上:亲和标记法，在此法中常常用到特异的运输系统的抑制剂。下:膜重建法。■离子载体在膜运输蛋白功能研究中的应用人们对自然状态下的膜运输特性的认识主要来自离子载体(ionophore)●短杆菌肽A(gramicidinA)是一种形成通道的离子载体，它具有疏水的侧链，两个分子在一起形成跨膜的通道。它能够有选择地将单价阳离子顺电化学梯度通过膜(图3-49)，可被短杆菌肽A离子通道运输的阳离子有∶H+〉●缬氨霉素(valinomycin)是一种由12个氨基酸组成的环形小肽。将缬氨霉素插入脂质体后，通过环的疏水面与脂双层相连，极性的内部能精确地固定K+。它在一侧结合K+，然后向内侧移动通过脂双层，在另一侧将K+释放从上面介绍的两个离子载体的例子可以得到两个基本结论:①膜运输蛋白具有选择性;②膜运输蛋白通过两种机制进行物质运输，一是形成水性通道，二是同被运输的物质结合，以可动的形式穿膜，即可动载体(mobilecarrier)非电解质通过扩散跨过细胞质膜必须具备两个条件:第一，该物质在细胞外的浓度很高;第二，细胞质膜必须对这种物质具有通透性。膜对某种溶质具有透性，必须满足两个条件之一：(1)这种物质能够直接穿过脂双层，或是(2)膜中有可允许该溶质通过的跨膜孔道。■扩散与渗透细胞质膜具有两个基本的特性∶允许小分子物质通过扩散穿过细胞质膜，也可以让水通过渗透进出细胞质膜。但是扩散和渗透是两个不同的概念(图3-51)。●扩散(diffusion)是指物质沿着浓度梯度从半透性膜浓度高的一侧向低浓度一侧移动的过程，通常把这种过程称为它们都是从自由能高的部位向自由能低的部位置ATP移动。简单扩散是被动运输的基本方式，不需要膜蛋白的帮助，也不消耗ATP，而只靠膜两侧保持一定的浓度差，通过扩散发生的物质运输。简单扩散的限制因素是物质的脂溶性、分子大小和带电性。图3-52溶质的脂溶性与通过细胞膜能力的关系●相对分子质量:相对分子质量小，脂溶性高的分子才能快速扩散。根据实验结果，推测质膜的通透性孔径不会大●物质的带电性:为什么所有带电荷的分子(离子)，不管它多小，都不能自由扩散?大的不带电的极性分子（如葡萄糖）和各种带电的极性分子都难以通过质膜(图3-53)。促进扩散是指非脂溶性物质或亲水性物质，如氨基酸、糖和金属离子等借助细胞膜上的膜蛋白的帮助顺浓度梯度或顺电化学浓度梯度，不消耗ATP进入膜内的一种运输方式。促进扩散同样不需要消耗能量，并且也是从高浓度促进扩散同简单扩散相比，具有以下一些特点∶●促进扩散的速度要快几个数量级。●具有饱和性:当溶质的跨膜浓度差达到一定程度时，促进扩散的速度不再提高(图3-54)。●具有高度的选择性:如运输蛋白能够帮助葡萄糖快速运输，但不帮助与葡萄糖结构类似的糖类运输。●膜运输蛋白的运输作用也会受到类似于酶的竞争性抑制，以及蛋白质变性剂的抑制作用。■通道蛋白与促进扩散并且是从高浓度向低浓度运输，所以不消耗能量。(a)由单亚基膜蛋白形成的通道;(b)由多亚基蛋白形成的通道。现已鉴定过的离子通道蛋白在膜中都有开和关两种构型相当于门，所以将通道蛋白形成的通道称为门控通道(gated这类通道的构型变化依据细胞内外带电离子的状态，主要是通过膜电位的变化使其构型发生改变，从而将"门"打含羞草的叶片在触摸时发生的叶卷曲就是通过电位-门控通道传递信号的(图3-57)。图3-57含羞草展开与收缩受电位-门控通道的控制这类通道在其细胞内外的特定配体(ligand)与其表面受体结合时发生反应。这种通道的打开受一种力的作用，听觉毛状细胞的离子通道就是一个极好的例子(图3-58)。图3-58听觉毛状细胞的机械敏感门通道作用原理载体蛋白需要同被运输的离子和分子结合，然后通过自身的构型变化或移动完成物质运输。葡萄糖可通过载体蛋白进行促进扩散。运输葡萄糖的载体蛋白主要是通过构型的变化进行葡萄糖的运输(图3-59)。图3-59红细胞质膜载体蛋白促进葡萄糖扩散示意图水是一种特别的物质，之所以特别是因为水分子虽然不溶于脂，并且具有极性，但也很容易通过膜。大多数水是直接通过脂双层进入细胞的，也有些水是通过水通道蛋白进行扩散的。动物和植物细胞中已经发现几种不同的水通道蛋白。水通道蛋白AQP1是人的红细胞膜的一种主要蛋白。它能够让水自由通过(不必结合)，但是不允许离子或是其他的小分子(包括蛋白质)通过(图3-60)。AQP1是由四个相同的亚基构成，每个亚基的相对分子质量为28kDa，每个亚基有六个跨膜结构域，在跨膜结构域主动运输涉及物质输入和输出细胞和细胞器，并且能够逆浓度梯度或电化学梯度。如何理解"被动运输是减少细胞与周围环境的差别，主动运输则是努力创造差别"?■主动运输的特点主动运输具有四个基本的特点:①逆梯度运输;②依赖于膜运输蛋白;③需要代谢能，并对代谢毒性敏感;④具有选择●建立浓度梯度或电化学梯度细胞靠主动运输建立和维持各种离子在细胞内的不同浓度(表3-5)，这些离子的浓度差异对于细胞的生存和行使功表3-5典型动物细胞内外离子浓度的比较成份细胞内浓度(mM)细胞外浓度(mM)固定的阴离子**高0*表中给出的Ca2+和Mg2+的浓度是游离存在于胞质溶胶中的浓度;Mg2+在细胞中的总浓度为2mM，Ca2+则是1-2mM。但它们大多是与蛋白质结合在一起的，C**指细胞内存在的带负电的有机分子，它们不能通过细胞质膜。●消耗能量主动运输是消耗代谢能的运输方式，有三种不同的直接能量来源（表3-7）表3-7主动运输中能量来源载体蛋白功能能量来源直接能源Na+-K+泵Na+的输出和K+的输入ATP细菌视紫红质H+从细胞中主动输出光能磷酸化运输蛋白细菌对葡萄糖的运输磷酸烯醇式丙酮酸间接能源Na+、葡萄糖泵协同运输蛋白Na+、葡萄糖同时进入细胞Na+离子梯度●选择性和特异性不同的运输泵转运不同的离子。泵，运输时需要ATP供能，但不需要磷酸化。在范围很广，包括细菌和人。四种运输ATPase在结■主动运输的方向■P-型离子运输泵的作用机理P型泵的主要特点:都是跨膜蛋白，并且是由一条多肽完成所有与运输有关的功能，包括ATP的水解、磷酸化和离Na+/K+泵是动物细胞中由ATP驱动的将Na+输出到细胞外同时将K+输入细胞内的运输泵，又称Na协同运输又称偶联运输，它不直接消耗ATP，但要依赖离子泵建立的电化学梯度，所以又将离子泵称为初级主动物细胞中，质膜上的钠泵和载体协作完成葡萄糖、氨基酸等的逆浓度梯度的协同运输(图3-67)。■细菌中的主动运输在细菌中发现一些特殊的主动运输方式，如磷酸化运输、运输ATP酶、细菌的视紫红质等，这些运输方式的能量又称为基团转运。其机理是通过对被转运到细胞内的分子进行共价修饰（主要是进行磷酸化）使其在细胞中始终维持"较低"的浓度，从而保证这种物质不断地沿浓度梯度从细胞外向细胞内转运(图3-68)。请简述细菌细胞中葡萄糖的磷酸化运输机理。该蛋白含有七个α螺旋，每个螺旋长3-4nm，在蛋白的中部有几个能够吸收光的视黄醛基团，又称发色基团；当该基团被一个光量子激活时，就能引起整个分子的构型发生变化，导致两个H+从细胞内运送到细胞外(图3-69)。圆柱形代表α螺旋区，视黄醛基团吸收光质子，诱导了构型的变化，驱使H+通过蛋白的中央通道运输。●ABC运输蛋白与主动运输ABC运输蛋白是一大类运输蛋白，最早在细菌中发现。E.coli具有两层膜，ABC运输蛋白位于细菌的内膜。ABC运输蛋白主要参与运输糖、氨基酸和小肽，运输时需要水解ATP提供能量(图3-70)。ABC运输蛋白主要参与运输糖、氨基酸和小肽，运输时需要水解ATP提供能量(图3-70)。简述ABC运输蛋白对甘露糖运输的机理课程学习：3.细胞质膜与跨膜运输>>3.5.4主动与被动运输、动物与植物主动