DB37T 2031-2012 奶牛DNA亲子鉴定技术规程　　

DB37DB37/T2031—2012奶牛DNA亲子鉴定技术规程TechnicalSpecificationforDNAParentageIdentificationinDairyCattle2012-02-09发布2012-03-01实施山东省质量技术监督局发布I1NY/T1672-2008绵羊多胎主效基因FecB分子SN/T1917-2007牛地方流行性白2又称多重引物PCR或复合PCR，是指在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的双蒸水；高压灭菌3从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入500μL生理盐水，混匀，12000rpm离弃除上清液，保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA抽提液400μL及5μL蛋白酶K，旋小心吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加入150μL酚和150μL氯仿，轻加入400μL双蒸水，充分溶解，4℃或-20℃产物扩增分4次PCR反应完成。同一扩增组合的引物加入同一PCR反应管中。25µL反应体系：10×Buffer2.5µL、50mmol/LMg组合)各1.0µL、待测个体模板DNA（或者阳性对照DNA）100ng、加双蒸水至反应总体积为25µL。PCR扩7.6.3将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝4PCR产物、去离子甲酰胺和TAMRA内标按0.5μL:lOμL:O.5μL比例混合，95℃变性5min，ABIPRISM3100仪器测序，ABIPRISM3100DATACOLLECTION软件分析微卫星的基因型。FAM、HEX和TAMR注：1-TGLA53、INRA023位点两重PILSTS006位点三重PCR产物；CSRM60、BM1824、ETH10所示，根据相对荧光强度和片段大小，可获得待测个体不同STR标记的基因型。不同亲缘关系的个其微卫星标记的等位基因大小不同，表现出不同的基因型。阳性对照样品12个STR标记不同等位基因的根据待检个体STR标记的基因型，利用Cervux3.0软件分别计算其亲子指数的LOD值。当LOD＞05主要试剂配制8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶A.40.5mol/LNaCl（将121.1gTris溶于800mLA.9TE缓冲液6取1mol/LTris.HCl（p1mol/LTris.HCl(pH=在10mL水中加入100mg的溴化乙锭（EB溶解后分装成A.142%的琼脂糖7主要仪器设备2μL，10μL，20μL，100μL，8使用温度范围45-135℃,最高使用压力0.255Mpa。温控范围50-300℃,箱内尺寸350mm×350mm×450mm。9记1AAGATGTGATCCAAGAGAGAGAGGACCAGATCGTGAAAGGCA15AAAGTGACACAACAGCTTCTCAACGAGTGTCCTAGTTTGGCT22973ACAGACAGAAACTCAATGAAAAATCACATGGCAAATAAGTACA4ATCTTCACATGATATTACAGC3TAACTACAGGGTGTTAGATCSRM60(98，100)BMBM1824(182，184)ETH10（215,221）SPS115（245,245）TGLA227（92,105）TGLA227（92,105）BMBM2113(124,134)ILSTS006（288,288）ETH225（14