第三章-基因克隆载体

第三章

基因克隆载体基因克隆载体(geneclonevector):

通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。也称DNA克隆载体。必备条件：1、克隆位点(一个或多个)2、能携带外源DNA片段进入受体细胞:能自我复制，或整合到染色体随受体细胞DNA复制而复制。3、有选择克隆子的标记基因4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞)意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。按克隆载体的来源分： 质粒～

病毒或噬菌体～

质粒与病毒或噬菌体DNA组成的～

质粒与染色体DNA片段组成的～按应用范围分：表达型～

启动子探针型～

cDNA

～按应用对象分：原核生物～

植物～

动物～分类３.１质粒克隆载体定义：以质粒DNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和cDNA基因文库。一、质粒适于载体构建的性质１、组成与构型质粒(plasmid)是染色体外裸露的双链DNA分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）构型：l-DNAoc-DNAccc-DNA２、分子大小： 100～102kb３、复制特点：在宿主细胞内进行单向复制。质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）（１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定。

严紧控制型：1～数个拷贝；大质粒

松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。（２）质粒复制的控制因素cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。rep基因：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制par序列：附着在细胞膜上，使质粒随细胞分裂而正确地分配到子细胞中，维持相对稳定的拷贝数４、质粒的不亲合性亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒

不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒。意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒５、质粒迁移（１）接合质粒：含tra基因→合成细胞表面物质（鞭毛）→质粒DNA入受体细胞 含tra基因的质粒称为接合质粒。如F、Ti等 不含tra基因的质粒称为非接合质粒。如ColE1、pPbS等（２）迁移作用： 不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非接合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称～质粒的迁移作用６、显性质粒和隐蔽质粒宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。显性质粒 Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap/Amp（抗性质粒）氯霉素Cm/Cap

卡那霉素Km/Kan

四环素Tc/Tet

链霉素SmCol质粒（产大肠杆菌素）Ｆ质粒（引起细胞结合的育性质粒） 降解毒物的降解质粒Ｔi质粒隐蔽质粒 蓝藻内源质粒二、质粒克隆载体构建的基本策略

１、克隆位点——组装MCS连杆２、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝）３、选择标记基因——抗性基因，(LacZ′基因)４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb转化率↓↓５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等三、质粒克隆载体构建过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）构建原则：

1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子。

2、正确获得构建质粒克隆载体的元件。

3、组装合适的选择标记基因。

4、选用合适的启动子。

5、构建过程力求简单。代表性实例

（一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建Ⅰ、pBR322构建※

目标是缩小基因组的体积，移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，限制酶识别位点。质粒载体命名法则：

“pBR322”

p：质粒（plasmid)

BR：两位主要构建者

322：实验编号

ColE1

松驰型，筛选系统复杂。衍生的pMB1为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好的选择标记基因和克隆位点）。

pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧型，含有Tcr

基因。构建过程(出发质粒：pMB1)R1（沙门氏菌中分离）变异R1drd19

（含易位子Tn3Apr）

R1drd19Tn3 ColE1pBR322的三个亲本：pMB1、pSC101、pSF2124pBR322分子大小：4363bppSF2124pBR322优点（1）较小的分子量

10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA（2）较高的拷贝数 经氯霉素扩培后达1000～3000copys/cell（3）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。插入失活（图解）插入失活筛选法Ⅱ、pUC18/19质粒载体与pBR322区别：乳糖操纵子的一个DNA片段（lacZ`基因）替换Tcr基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆命名pUC——UniversityofCalifornia的科学家首先构建。

pUC包括四个组成部分： （1）pBR322的复制起点(ori)

（2）Apr基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点（3）lacZ`基因（4）在lacZ`基因内部靠近5`端有一段MCS连杆LacZ`筛选机制：

含乳糖操纵子的启动子、调节因子和

β-半乳糖苷酶的N端146残基(α-肽)合成有活性的

基因（lacZ`）的质粒载体引入可编β-半乳糖苷酶码C端部分残基的宿主(与LacZ`互补的大肠杆菌)

在含IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和

X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）蓝色菌落

的诱导培养基上培养在N端α-肽的编码区插入MCS不影响lacZ`基因功能插入外源DNA灭活lacZ`基因白色菌落pUC质粒载体的优点 （1）分子量更小、拷贝数更高 （2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时 （3）MCS区方便转移外源DNA在不同载体系列中“穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源DNA能直接克隆入pUC载体pBR322衍生的质粒

缺失bom（oriＴ）位点→pAT153、pBR327，不具被动迁移作用

均更安全练习：就克隆一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分：————、————、——————。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。如果两个自力不能稳定的共存于同一个寄主细胞中，则属于————群，这是因为它们的————所致。质粒拷贝数是指细胞中——————。pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于————，它的四环素抗性基因来自于————，它的氨苄青霉素抗性基因来自于————。pSC101是一种————复制的质粒。ColE1是唯一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒（）A是松弛复制型B具有四环素抗性C能被氯霉素扩增D能产生肠杆菌素下面关于松弛型质粒性质的描述种，不正确的是（）A质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数。B可以在氯霉素作用下进行扩增。C通常带有抗药性标记。D同严谨型质粒整合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子。（一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建※※※（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2的构建（略）（三）农杆菌Ti质粒克隆载体的构建（四）乳酸杆菌质粒克隆载体（略）（五）酵母2μm质粒克隆载体（六）TA克隆载体——针对PCR产物的克隆（略）（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2的构建（略） 大肠杆菌质粒不能转化蓝藻 蓝藻内的质粒属隐蔽质粒即：大肠杆菌源质粒复制起始点+蓝藻源质粒复制起始点。

pPbs（1511bp）

pPbs

pBR322

组装CaMV35s启动子、MCS、rbcS终止子、Kmr基因构建穿梭质粒ClaⅠ重组pPRS-1多次亚克隆pPKE2（三）农杆菌Ti质粒克隆载体的构建

Ti质粒：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称Tumorinducingplasmid（Ti质粒）。双链环状DNA分子，200～250kb。

1、4个功能区：T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区

（1）T-DNA区

Ti质粒进入植物细胞的约25kb部分，即T-DNA（transferDNA)。左右边界各有一个25bp正向重复序列（LTS和RTS）称为边界序列，为T-DNA的转移和整合所必需。只要保留T-DNA的边界序列，中间序列被外源DNA片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选育转基因植物。（2）Vir区 位于T-DNA区上游，其表达产物可激活T-DNA的转移，显示致瘤性。（3）Con区 含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)，可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌间转移，也即接合转移基因编码区。（4）Ori区 复制起始区，调控Ti质粒自我复制。

Ti质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作用。2、构建途径（1）取代型载体。用大肠杆菌质粒克隆载体取代Ti质粒的全部或部分T-DNA序列而构建。外源基因以同源交换而重组。

Onc-

Ti：T-DNA上的onc基因被取代而构建。

Onc+

Ti：pBR322取代T-DNA的部分序列但保留onc基因而构建。进入植物细胞诱发冠瘿瘤。（2）中间质粒克隆载体

T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom

位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒（四）乳酸杆菌质粒克隆载体（略）乳酸杆菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和饮料。 质粒宿主范围广泛：可用于其它G+菌及大肠杆菌。构建： 乳酸杆菌本身对km、Ap抗性较强。标记基因：选用lacZ，如有pLJ1复制启始位点的pBG10;选用ery，如有p353-2复制启始位点的pP3537（五）酵母2μm质粒克隆载体 几乎所有酿洒酵母中都存在（1）2μm质粒结构a、环状分子内有反向重复序列IR1和IR2，可发生重组，形成A、B型质粒；有ori复制起始点能自主复制。b、20～80个/细胞。有丝分裂时数目稳定，减数分裂时形成cir+/cir0图3-10

A型酵母2μm质粒（2）YEp克隆载体（酵母游离型质粒）

2μm质粒的ori→EcoRⅠ酶切pBR322质粒酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切

YEp24

（图3-11）特征（1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子

（3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变 优点

（1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制 故可用酵母菌高水平表达外源目的基因（六）TA克隆载体——针对PCR产物的克隆（略）原理

PCR产物在Taq酶的非模板依赖活性 作用下，于3`端加一非配对的A。 故可研制一种线性载体，其5`端各带一不配对T，可直接与PCR产物以TA连接进行克隆，即TA克隆。TA载体的再生方法（1）克隆载体线性化（2）克隆载体末端补平反应（3）克隆载体末端加T反应注：再生后的TA载体，原线性化的酶切位点消失思考题1、名词解释：基因克隆载体、迁移作用、接合质粒、亲和质粒、显性质粒。2、任一DNA分子都可作为克隆载体使用吗？为什么？3、构建质粒载体时需考虑哪些特性？讲究何策略？遵循什么设计原则？4、指出pBR322的结构来源，并图示pBR322的构建。5、简述LacZ`的筛选机制。6、pUC质粒的基本结构组成。3.2病毒（噬菌体）克隆载体病毒基本结构：DNA（或RNA）+外壳蛋白感染细菌的病毒，称为噬菌体(phage)。分类（根据病毒与宿主的关系）：

温和性病毒：

溶原性增殖→构建病毒载体烈性病毒：

溶菌性增殖→改造后一、λ噬菌体克隆载体（一）λ噬菌体性质λDNA+外壳蛋白1.λDNA(48.5kb)噬菌体中：线性宿主细胞：环状(cos位点)2.λ噬菌体基因组有基因50个以上

J与N、P与Q之间为非必需序列3.限制性核酸内切酶位点:56种（p477）

4.λ噬菌体的生长途径

溶菌生长途径

溶原生长途径→某种胁迫条件下→合成six

基因产物→λDNA脱离细菌染色体→溶菌（二）构建依据1.λ噬菌体是一种温和噬菌体2.能承载较大的外源DNA片段

λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kbλDNA可缺失（生长非必需）3.在λDNA上有多种限制性内切酶位点（三）构建的基本策略与技术路线策略:

切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点;插入选择性标记基因;建立体外包装系统。技术路线1.用限制性酶切去部分非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以gtWES–λβ为例，EcoRI（如图）。 （48.5kb）λDNAEcoRI6个片段

A=21.6B=4.9C=5.5D=7.5E=5.9F=3.3B片段是λ噬菌体生长非必需的；

C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；

E片段去掉不影响溶菌生长途径的min5序列（2.6kb）。E两端EcoRI位点经点突变或甲基化处理，即得gtWES–λβ：（48.5-5.5-2.6=40.4kb）克隆能力： 替换B（置换重组）：最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb

最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb插入B的任一侧（插入重组）最大：51-40.4＝10.6

最小：无 实际应用时克隆能力略有出入（p109,表3-5）

2.在λDNA的非必需区内插入选择标记基因 （1）取代red和gam基因 外源DNA取代获Spi-表型在P2噬菌体溶原性细胞中能生长野生型λ噬菌体(Spi+表型)在P2噬菌体溶原性细胞中不能生长

局限性：只能以P2噬菌体溶原细胞作为受体。（2）最常用的筛选标记：LacZ´基因3.建立重组λDNA分子体外包装系统 体外重组DNA分子必须经体外包装成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。 野生型λ噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。

D-（D基因缺失噬菌体）→受体细胞→积累除D蛋白以外所有蛋白质

E-（E基因缺失噬菌体）→受体细胞→积累除E蛋白以外所有蛋白质

混合D、E互补包装λDNA分子λ噬菌体如:菌株BHB2688(E-)+BHB2690(D-)（四）λ噬菌体克隆载体的应用（自学） 建立cDNA基因文库克隆外源目的基因（五）重组λDNA分子的体外包装（自学）质粒克隆载体与λ噬菌体克隆载体有哪些区别？思考：二、cosmid克隆载体（柯斯质粒载体）（一）构建策略 由质粒和含cos位点的λDNA片段组装成的载体，即cosmid（二）cosmid的特征1.环形双链DNA分子2.具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制3.含有一个cos位点A蛋白

cos末端→体外包装成为噬菌体，但不含λ噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNA复制系统，不会产生子代噬菌体

.4.cosmid较小，可承载更大的外源DNA

若cosmid为6.5kb，则可承载44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。因此，cosmid克隆广泛用于构建基因组文库。（三）使用cosmid载体的基本程序 利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的λ噬菌体性质→转导受体细胞思考题1.名词解释：Cos位点2.构建λ噬菌体载体的策略及其技术路线。3.试从cosmid克隆载体的构建策略上说明其特征。4.简述病毒的溶原性和溶菌性增殖途径。已知λDNA分子大小为48.5kb，EcoRI在该λDNA上有5个识别位点，依次在3.1、9、16.5、22、26.9。若完全酶切，切割的片段依次用A、B、C、D、E、F表示。（酶切后片断大小变化忽略不计）。其中，E片段是λ噬菌体生长非必需的；D片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；B片段去掉不影响溶菌生长途径的min5序列（2.6kb）。gtWES–λβ是切去D片段，保留E片断两端的位点，B两端甲基化处理，去掉B片段内min5序（2.6kb）。试问：gtWES–λβ置换和插入外源DNA片断的范围。三、M13噬菌体克隆载体（一）M13DNA

丝状噬菌体，内有一环状单链DNA分子（“+”链DNA） 大小：6.4kb

结构：10个区基因间隔区507bp（IS区）

含复制起始位点及可插入外源DNA的位点M13DNA载体构建：野生型M13RF-DNAM13mp系列载体IIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIpolylinkerlacZ´（二）M13DNA复制和M13噬菌体增殖

M13DNA“+”链进入雄性大肠杆菌→合成“-”链→产生双链M13DNA（复制型DNA或RF-DNA）→按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转录包装蛋白→RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链→结果只能以“-”链为模板合成“+”链

→“+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体→挤出受体细胞→宿主细胞不被溶菌。

根据M13DNA复制特征：以双链DNA为中间媒介 培养物→高速离心→上清中含噬菌体颗粒→“+”链DNA

沉淀菌体→破碎后，可提取RF-DNA（三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径

策略：在RF-DNA的IS区插入选择标记基因，并组装合适MCS。

RF-DNA上有10个BsuI位点→部分酶切→获得全长线形RF-DNA,与含LacZ`标记的HindⅢ酶切片段进行平末端连接→M13mp1载体。为获得合适的克隆位点,可在LacZ`区插入MCS连杆构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+”链一起复制包装。（四）M13克隆载体的优点与应用优点：1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作。2、制备的M13DNA单、双链都能转染大肠杆菌受体细胞。3、单链DNA不受包装限制，可包装M13DNA分子6倍的DNA分子。4、可产生大量纯化的含外源DNA插入的单链DNA分子。主要用途：克隆、分离单链外源DNA片段 ,获得的“+”链可直接用于DNA测序四、CaMV克隆载体

花椰菜花叶病病毒（CaMV）

环状双链DNA分子（一）CaMV

DNA分子 大小：8kb

结构：在病毒颗粒中呈开环形式，负链有一缺口，正链有两缺口。进入植物细胞后单链部分被酶解，缺口自行闭合，成为环状DNA分子。G1G2G3（二）CaMV基因区8个阅读框（ORF）和3个间隔区（IR1～3）

IR1－ORFVI与ORFVII之间

IR2－ORFVII与ORFI之间

IR3－ORFV与ORFVI之间

IR1和IR3区各有一个启动子结构，分别启动同方向转录35SRNA和19SRNA，而两者的终止子都在IR1区。

35S启动子——组成型强启动子。组装了35S启动子的外源基因可在植物细胞高效表达，在蓝藻细胞内也有效表达。（三）CaMV的增殖和感染

1、增殖途径：

CaMV颗粒→蚜虫→病毒DNA进入植物细胞核→ 转录19SRNA→翻译

35SRNA→翻译反转录“-”链DNA→复制出“+”链2、CaMV-DNA可转染植物细胞 在ORFII和ORFVII区插入外源DNA后仍能转染植物细胞包装成新的CaMV颗粒（四）构建CaMV克隆载体的基本策略和途径

策略：

CaMV-DNA能侵入植物细胞而将目的基因导入，并且清除CaMV对植物的致病性基因.途径1、构建互补克隆载体。组装(目的基因+标记基因)而无感染能力+两种基因和感染能力都无→彼此获得对方产物→感染能力。很少被采用。2、构建置换型克隆载体。置换的外源基因较小3、构建混合型克隆载体。

CaMV-DNA→合适的限制性酶切→组入Ti的T-DNA区→完成构建4、构建CaMV-融合基因克隆载体系统。 将35S启动子与目的基因融合，高效表达目的基因。五、烟草花叶病毒（TMV）克隆载体 单链正义RNA，6395bp特点：复制量和外壳蛋白表达量高，寄主范围广，能在整株植物上快速扩散。TMV载体构建策略有四种基本形式（自学）（图3-20）六、SV40克隆载体——哺乳动物基因克隆载体 （猿猴空泡病毒40）（一）SV40基因组双链闭环DNA：5243bp酶切位点：早期转录区：BamHⅠ、BstⅠ、TapⅠ识别序列晚期转录区：AccⅠ、NaeⅠ、HaeⅡ、HpaⅡ

、EcoRⅠ、BanⅠ、EcoRⅤ、AflⅡ转录启动区：BglⅠ、SfiⅠ都只有一个识别序列（二）SV40-DNA复制与增殖 猿猴细胞——受纳细胞 嚙齿动物（小鼠、仓鼠）——非受纳细胞；细胞癌变 人：1～2%细胞产生病毒颗粒，不会插入染色体，相对安全SV40病毒在感染了CV-1和AGMK猿猴细胞之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。我们称这种感染效应为裂解感染(lyticinfection)，而猿猴细胞则叫做受纳细胞(permissivecell)。但如果感染的是啮齿动物(通常是仓鼠和小鼠)的细胞，就不会产生感染性颗粒，此时病毒基因组整合到寄生细胞的染色体上，于是细胞便被转化，也就是说发生了癌变。我们称这种啮齿动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞(non-permissivecell)。

（三）构建策略和途径 包装严格，不能包装大于SV40-DNA的分子，只能构建取代型载体或SV40-DNA与质粒DNA的重组型载体1、取代型 被取代的DNA序列不能超过SV40-DNA的30%

（1）晚期转录区取代型：需辅助载体共同转染受体细胞 （2）早期转录区取代型：辅助细胞系 （将SV40早期转录区DNA序列整合到敏感细胞基因组上）

2、病毒-质粒重组克隆载体：质粒载体的衍生物

（1）病毒-质粒重组克隆载体（穿梭质粒）：含SV40完整早期转录区和DNA复制起始点，及质粒DNA的复制起始点和选择性标记 （2）微型病毒复制子质粒载体：只含SV40复制起始点七、反转录病毒克隆载体：一类RNA病毒（一）劳斯肉瘤病毒的生物学特性RSV：含两条相同的38SRNA（右图）;与宿主细胞提供的tRNATrp结合处：PBS+ve、PBS-veRSV的复制与增殖：（右图）接上长末端重复序列（LTR）策略：RNA病毒不能直接构建，必须从感染动物细胞中分离出原病毒DNA，按不同需求删去部分序列，组入选择标记、目的基因、调控元件，再克隆入质粒转化大肠杆菌，才可获重组载体。（二）构建RSV载体的策略和途径1、反转录病毒-质粒载体 关键步骤：体外删去原病毒的gag、pol、env等序列，保留5’和3’LTR序列以及PBS+ve、PBS-ve和psi（包装）位点，插入合适的选择标记如neo、gpt等。(如图)需辅助反转录病毒↓Gag、Env蛋白↓识别包装位点psi↓将重组的反转录病毒包装成新的病毒颗粒新病毒能合成各种所需的蛋白质。特点：更高的转化效率，基因转移成功率100%改进：鉴于危险性，已建立了不需辅助反转录病毒的克隆载体系统。将缺失psi位点的原病毒DNA转化动物受体细胞，获得全部包装蛋白质，即辅助细胞。2、广宿主反转录病毒克隆载体组入能感染多种动物细胞的env基因3、反转录病毒表达克隆载体可插入6kb的外源基因。若剪短原病毒DNA，则可承载20kb八、腺病毒克隆载体（一）腺病毒的一般生物学特性

Ad：无囊膜的20面体，含一个线形双链DNA分子，约36kb。

Ad-DNA两端具有逆向末端重复序列（IRT），5`端共价结合一种5.5kD的蛋白质（TP），进入宿主细胞后Ad-DNA自行环化。（二）腺病毒载体构建特点：易感染性、宿主范围广、毒性低（安全）、可容纳的外源基因大、不整合入宿主染色体DNA。

基因转移中最有前途的克隆载体之一人类腺病毒有51个血清型，常用的是Ad5和Ad2型。进入宿主细胞后以复制为界分早晚两个基因表达时期。早期基因(E1～E４)编码调节因子，晚期基因编码病毒结构蛋白。野生型腺病毒容纳最大外源DNA为2kb。理论上，除基因组两端约500bp的顺式结构和包装必需结构外，其他结构均可被替换成外源DNA。策略：构建一个含MCS和筛选标志的质粒（有病毒基因组某端早期序列）将一表达盒（启动子—外源基因—PolyA）插入E1、E3区或E4至右IRT之间穿梭质粒；再构建含非必须区基因缺失的环状腺病毒质粒，在菌体复制；穿梭质粒+环状腺病毒质粒同源重组重组载体。

例：重组Ad-hFVⅢ构建（如图）改进：构建能在野生型Ad感染的各种靶细胞内选择性复制的Ad载体。（三）Ad克隆载体的应用1、基因治疗癌症（1）导入肿瘤抑制基因和反义癌基因（2）导入前体药物转换酶基因——病毒引导的前体药物治疗（3）导入核酶基因，降低癌基因的表达水平2、表达真核基因3、研究疫苗

九、痘苗病毒克隆载体（一）生物学性质 线形双链DNA分子，180～200kb，编码200多种蛋白（二）构建方法：痘苗病毒的基因组结构复杂，尚无质粒型的痘苗病毒克隆载体，因此必须采用同源重组方法构建痘苗病毒克隆载体特点：

1）表达产物与天然产物的活性和理化性质相近

2）外源目的基因和载体的免疫原性均较好

3）外源基因的插入量大

4）宿主细胞广泛

5）表达产物可翻译后修饰，无需佐剂，纯化简单，产物稳定，易于保存运输十、杆状病毒克隆载体自学要点：基因组特性，同源重组方式，阳性克隆检测，表达特点。思考题1、名词解释：Cos位点、受纳细胞、非受纳细胞2、构建λ噬菌体载体的策略及其技术路线。3、试从cosmid克隆载体的构建策略上说明其特征。4、简述病毒的溶原性和溶菌性增殖途径。5、M13噬菌体载体有何优点和用途？6、简述腺病毒克隆载体的策略及其主要用途。7、痘苗病毒克隆载体有何特点？为什么要用同源重组方式构建？8、如何构建反转录病毒载体？举例说明。思考题：基因工程有三种主要类型的载体：——、——、——。某些严谨型和松弛型质粒整合后，正常性况下——的复制起点可能被关闭。酵母

2μm质粒有——，可以配对形成哑铃结构。pUC18质粒是通过——改造而来，它的复制子自来于——。λ噬菌体载体的基因组DNA为——kb，插入外源片段后，总长度应在噬菌体基因组的——范围内。λ噬菌体DNA可线形可环形，是由于在其线形两端各有——碱基组成的粘性末端，成环后粘性末端的部位叫——。粘粒是质粒和噬菌体杂合载体，它的复制子来自——，cos位点来自——，最大克隆达到——kb。M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：——、——、——。从酶切位点来看，插入型为——个，取代型（置换型）为——个。下列质粒载体中属于天然质粒的是——pBR322pUC18pSC101pAT153下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大——质粒粘粒酵母人工染色体λ噬菌体关于反向重复序列正确的是——可以回折形成发夹结构可以是某些蛋白质的结合位点参与转座子的转座以上都不对Ti质粒——可从农杆菌转到植物细胞中在植物中导致肿瘤介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素需要细菌的vir基因帮助转移PUC系列载体的抗性筛选标记为：（）A.

卡那霉素B.

四环素C.

氨苄青霉素D.

G418E.

氯霉素

用蓝白斑筛选重组子时，IPTG的作用是：（）A.

诱导载体上的LacZ基因表达B.

作为显色反应的指示剂C.

作为酶的作用底物D.

诱导载体上的抗性基因表达E.

诱导宿主上的LacZ基因表达常用的连接外源性DNA和载体DNA的酶是：（）A.

DNA聚合酶IB.

T4DNA连接酶C.

T4RNA连接酶D.

RNA聚合酶E.

Taq酶

关于重组体的叙述，下列哪项不正确：（）A.

重组体中含有载体成分B.

重组体中含有外源基因C.

重组体可直接表达外源基因D.

重组体只能在宿主细胞或体外表达系统中表达外源基因E.

重组体是由目的基因和载体通过连接酶连接而成的重组DNA分子导入受体细胞的方法有：（）A.

转化B.

转染C.

转导D.

转位E.

转录基因重组的载体必须具备下列哪些特点：（）A.

本身是一个复制单位，能在受体细胞中复制B.

插入外源DNA后也不影响自身的复制C.

能够进入受体细胞D.

通常带有抗性基因，易于筛选和鉴定某质粒含有tetr和LacZ基因，tetr内有一BamHⅠ位点、LacZ基因中有一BstⅠ位点。如果这两种切割载体一并连接入相应的外源片段，则带有该重组质粒的细胞将——A有四环素抗性，在X-gal平板上呈现蓝色B对四环素敏感，在X-gal平板上呈现蓝色C有四环素抗性，在X-gal平板上呈现白色D对四环素敏感，在X-gal平板上呈现白色

3.3 染色体定位整合克隆载体质粒与病毒克隆载体的不足：1、转基因生物中游离的外源DNA分子能多拷贝复制，但易丢失，导致转基因生物的不稳定性。2、随机插入染色体的外源DNA片段能稳定维持，但因插入的位点不确定，可能干扰受体细胞基因组的自稳系统，进而导致有害突变，造成选育转基因生物不可知性，增加难度。基因整合平台系统——基因定位同源重组(基因打靶)

整合平台：即受体细胞基因组上给定的DNA区域，是外源DNA定位整合的位置。

定位整合克隆载体：除一般质粒克隆载体必备的元件外，还含有一个或两个与整合平台DNA区域核酸序列同源的DNA片段（长度最好＞1kb）。

一、定位整合克隆载体的几种模式（一）内源平台双交换置换克隆载体（二）外源平台双交换置换克隆载体（三）内源平台双交换插入克隆载体（四）内源平台单交换插入克隆载体二、定位整合效率与受体细胞的种属和同源DNA片段的长短有关整合效率偏低，有待改进三、定位整合克隆载体受体生物：原核生物蓝细菌、高等植物（拟南芥、水稻等）的原生质体、动物鼠的胚胎干细胞、人的细胞整合平台：内源isiAB、cpcB2A2、hprt、rDNA

外源hptΔ、aphⅡ（一）蓝藻染色体定位整合克隆载体1、丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601获得含藻蓝蛋白基因cpcB2A2的DNA片段，以之为同源序列，构建～ 2、从其cpc2操纵子中扩赠出cpc2启动区（约0.6kb）、同源DNA片段L（约1.2kb）和R（约1.15kb）构建如下载体：3、Synechococcus

从sp.PCC7942获得含isiAB基因的约1.5kb的DNA片段，构建pZL： 不含蓝藻源质粒复制起始位点，故不能在蓝藻细胞质中自行复制（二）酵母菌染色体定位整合克隆载体（三）植物染色体定位整合克隆载体易于控制；避免插入失活或突变。（四）动物染色体定位整合克隆载体

３.４人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体含义和特点 实际上是一种“穿梭”克隆载体(shuttlevector)

：含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。特点：能容纳长达1000至3000kb的外源DNA片段。二、人工染色体克隆载体的构建

YAC（酵母人工染色体）常用载体：pYAC3、pYAC4、pYAC5三、人工染色体克隆载体的应用构建基因组文库基因治疗基因功能鉴定

３.５特殊用途克隆载体一、启动子探针(promoterprobe)型克隆载体应用范围：研究生物的发育机制提高目的基因表达产量进行基因治疗组成结构：必备转化系统+检测部件检测部件：1)一个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因,2)克隆位点。1、Kanr标记：用于植物细胞

Kanr基因→Kanr蛋白 卡那霉素磷酸化卡那霉素→不能进入细胞

ATP2、gfp标记:用于真核及原核细胞gfp基因→GFP（绿色荧光蛋白)395nm/470nm发射510nm（绿色荧光）3、hph标记:用于真核及原核细胞 潮霉素B磷酸转移酶基因（hph）二、诱导型表达克隆载体

指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达克隆载体.诱导条件：二价金属离子、红光、热、干旱1、金属硫蛋白（MT）启动子2、干旱诱导表达克隆载体通过转基因技术使细胞内积累果聚糖和海藻糖能不同程度地提高转基因植物的耐旱性。干旱诱导性启动子：Prd29A3、红光诱导表达克隆载体藻蓝蛋白操纵子2（cpc2)→蓝藻表达克隆载体pUTK2（图3-34）(p143)4、热诱导表达克隆载体groESL启动子→蓝藻基因整合平台表达克隆载体pZL（图3-35）(p144)三、反义表达克隆载体-人工干预基因表达利用人工合成或重组的、与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性地与靶基因结合，从而达到封闭其表达的目的。应用：基因治疗和基因功能的研究1、SOD基因反义表达克隆载体2、NHE1基因反义表达克隆载体人肺癌细胞Na+/H+交换泵1（NHE1）四、组织特异性表达克隆载体1、乳腺组织特异性表达克隆载体基因工程药物的生物反应器人凝血因子Ⅸ另外，E