基因工程基础知识复习归纳

基因工程基础知识复习归纳

第一章绪论

1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，通过严密的设计，将一种或者多种生物体（供体）的基

因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳

固遗传、并表达出新的性状的技术。

2.基因工程概念的进展：遗传工程一D\A重组技术一分子/基因克隆（Molecular/Gene-基因工程~

基因操作。应用领域以"基因工程"、"DNA重组”为主

基因工程基因工程的历史性事件

1973：Boyer与Cohen建立DNA重组技术

1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素

1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市

1988：PCR技术诞生

1989：我国第一个基因工程药物rhIFNa1b上市

2003:世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市

3.基因工程的三大关键元件

基因（供体）：外源基因、目的基因

载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳固遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。

宿主（受体）:，能摄取外源DNA、并能使其稳固维持的细胞（组织、器官或者个体）。

4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）

（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，通过酶切消化或者PCR扩增等步骤，分离出带有

目的基因的DNA片断。

（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）

的载体分子上。

（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。

（4）克隆鉴定：选择转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。

（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。

.“化1"Hrm

.加“化'[(oo

.解定

第二章DNA重组克隆的单元操作

一、用于核酸操作的工具酶

1.限制性核酸内切酶（耍紧存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵）。

限制性核酸内切酶的功能与类型

要紧特征I型II型in型

功能限切/修饰限切限切/修饰

蛋白结构异源三聚体单体异源二聚体

辅助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM

识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCC

AACN6GTGCCAGCAG

切割位点距识别序列Ikb处识别序列内距识别序列下游

24-26bp处

其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。

特点：1.识别、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶。2.识别序列为4-6碱基对的回文对

称结构（旋转对称结构）。3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性。4.切割产物末端：

5,突出末端、3,突出末端、平头末端.6.最适温度：大多为37C,适盐浓度：高盐、中盐、低盐。8.当

反应条件不适合时，识别与切割序列发生变化（星号反应）。

星活性（staractivity）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的

特殊性称星活性。

引起星活性的因素：①高浓度甘油（＞5%）、②酶过量（＞100U/pg）、③低离子强度（＜25mM）

@高pH（＞pH8.0）、⑤有机溶剂、⑥用其它二价阳离子代替Mg2+,如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+O

II型限制性核酸内切酶的命名

具体规则是：以生物体属名的第一个大写字母与种名的前两个小写字母构成酶的基本名称，假如酶

存在于一种特殊的菌株中，则将株名的一个字母加在基本名称之后，若酶的编码基因位于噬菌体（病

毒）或者质粒上，则还需用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子。酶名称的最后部分为罗马

数字，表示在该生物体发现此酶的先后次序。

例子：Eschericha（属名）coli（种名）R（质粒）大肠杆菌R质粒一EcoR\EcoRV

Haemophilus（属名）influenzae（种名）d（株名）嗜血流感杆菌d株--HindIIH

/ndIII。罗马数字表示同一菌株中所含的多个不一致的限制性核酸内切酶。

特殊性质的H型限制酶：同裂酶，同尾酶

同裂酶：又称异源同序酶或者异源同工酶，是指识别位点与切割位点均相同的不一致来源的酶识别

相同序列，如Hindi"-Hsul:A/AGCTT

同尾酶：是指识别位点不一致，但切出的DNA片段具有相同的末端序列的一类酶，如Bglll：A/

GATCT；BamHI:G/GATCCo同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别

序列均被破坏。

2.DNA连接酶（T4-DNA连接酶）

功能：体外连接DNA片段

常用的连接酶：T4DNA连接酶

参与连接反应的基团：3端羟基与5端磷酸基团，形成磷酸二酯键

DNA连接酶的基本性质：修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键、修复RNA-DNA杂合分子

中DNA链上缺口处的磷酸二酯键、连接多个平头双链DNA分子

T4DNA连接酶的活性单位定义：在20Hl反应体系中于16℃,使H/ndIII切过的XDNA（300

Pg/ml,0.12nM5'末端）在30分钟内连接50%所需的酶量为1个NEB单位。

3.DNA聚合酶

①大肠杆菌DNA聚合酶1（DNApoll）

基本性质：1.5，f3,的DNA聚合酶活性2.5，—3,的核酸外切酶活性3.3，f5,的核酸外切酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途：1.切口平移标记法2.Nicktranslation3.制备32P标记的探针。

所有的DNA聚合酶中只有此酶有该反应。缺口平移标记原理见ppto

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow酶）：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获

得N端三分之二的大肽段，即为Klenow陋。Klenow醉仍拥有5，一3,的DNA聚合酶活性与3，一夕的

核酸外切酶活性，但失去了5一＞3"的核酸外切酶活性。

Klenow酶的基本用途：1.补平由核酸内切酶产生的5,粘性末端2.DNA片段的同位素末端标记

3.CDNA第二链的合成4.双脱氧末端终止法测定DNA序列。

②T4-DNA聚合酶

基本特性：1.5，f3,的DNA聚合酶活性与3，f5,的核酸外切酶活性（极强）2.在无dNTP时，能够从

任何3'-0H端外切3.在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

基本用途：1.切平由核酸内切酶产生的3,粘性末端，该陋也能降解双链DNA,只是其活性比单链降

解活性低很多。2.DNA片段的同位素末端标记。

③依靠于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）

基本用途：1.以RNA为模板合成cDNA链2.双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链

4.核酸酶

单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVH）；双链核酸外切酶：核酸外切酶III（Exolll）；双链核酸外

切酶：入核酸外切酶（入Exo）【特异性地从5,端外切】；单链核酸内切酶：S1核酸能【降解单链

DNA的速度比降解双链DNA快75000倍，比降解单链RNA快7倍】

5.核酸修饰酶

末端脱氧核昔酰转移前（TdT）：碱性磷酸单酯酶【小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）&大肠杆菌的

碱性磷酸单酯酶（BAP）】；T4-多核甘酸磷酸激酶（T4-PNP）

二、用于克隆的载体

1.载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或者表达的工具。

载体应具备的条件：

1.具有针对受体细胞的亲缘性或者亲与性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相习惯的复制位点

或者结合位点3.具有较高的外源DNA的载装能力4.具有多种单一的核酸内切醐识别切割位点

（多克隆位点）5.具有合适的筛选标记

2.载体类型：

（1）根据要紧用途能够分为：克隆载体与表达载体

①克隆载体：要紧用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或者在大肠杆菌或者酿酒酵母细胞中构建

基因文库。

克隆载体关键元件：A.多克隆位点B.筛选标记基因C.复制起始位点

②表达载体：除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件，用

于在特定的宿主中表达目的基因。

（2）按传代特性分：

①自主复制型载体：含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代（穿梭载体：装有针对两种不一

致受体的兔制起点，便于基因克隆）。

②整合型载体：不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主基因组。

3.分子克隆载体常用类型：

（1）质粒：15kb下列

严紧型复制操纵的质粒：1・5拷贝，如pSClOl

松弛型复制操纵的质粒：30-50拷贝，如ColEl

氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素抑制蛋白质合成、关闭要紧代谢途径，以使

松弛型质粒迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。

质粒载体的特点：分子量小，便于操作；易于构建，可作为其他宿主系统载体的骨架；用途广泛；

缺点：装载量小（小于10kb）,不能用来克隆大片段。

重要的大肠杆菌质粒载体：PBR322：松弛型复制；氯霉素可扩增；拷贝数50-100/cell；用于基

因克隆。还有PUC1&19；T载体，详见ppt,熟悉一下。

实验室通常使用下列三种方法制备质粒DNA：

①氯化钠密度梯度离心法：质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、浜乙锭污染；②碱裂解法（最

常用）：质粒DNA纯度、操作周期介于氯化他法与沸水浴法之间；③沸水浴法：质粒DNA纯度

底、快速、操作简便。

质粒的不相容性的分子机制

两种含有相似复制子结构的不一致质粒，在复制时受到同一种拷贝数操纵系统的干扰，致使两种质

粒的最终拷贝数不一致，可导致子代细胞质粒构成不一致，且这种差异具随机性，通过若干代后宿

主细胞中处于数量弱势的质粒必定被淘汰，而仅剩强势质粒。

质粒载体不稳固性的类型

分离的不稳固性：在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，有的细胞班有获得质粒DNA拷贝，

并最终增殖成为无质粒的优势群体。

结构的不稳固性：由转位作用与重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。

影响质粒载体稳固性的要紧因素

新陈代谢负荷对质粒载体稳固性的效应；拷贝数差度对质粒载体稳固性的影响一一低差度•稳固/

高差度-不稳固；寄主重组体系对质粒载体稳固性的效应一一形成重组质粒二聚体，便会以高出质粒

单体分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒塞聚体的克隆增殖。

（2）lamda噬菌体DNA:25kb

人噬菌体是大肠杆菌的温与型噬菌体，由外壳包装蛋白与IQNA构成。DNA重组技术通常需要入噬

菌体进入溶菌状态

底DNA是线性双链DNA分子，全长48502个核甘酸。入-DNA两端各带有一个12bp的粘性末端，

称之8S位点。噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状。

①插入型载体：改造后的长度正好为包装的下限，因而本身也能被包装，叫插入型载体

l.cl基因失活：cl基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬

菌斑。2.LacZ基因插入失活：在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛

选）。

②取代型载体：长度为40kb,在非必需区域有前切位点，距离为14kb。载量为10-25kb。

用取代型载体克隆外源DNA可能需要通过什么步骤？

第一，应用适当的核酸内切限制酶消化工载体，除去基因组中可取代的DNA区段。

第二，将上述所得的人DNA情同外源DNA片段连接。第三，对重组体的NDNA分子进行包装与增

殖，以得到有感染性的人重组噬菌体,

X-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。

入-DNA作为载体的优点：1.入-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌2.X-DNA

教体的装载能力为25kb,远远大于质粒的装载量3.重组I-DNA分子的筛选较为方便4.重组入・DNA

分子的提取较为简便5,入-DNA载体适合克隆与扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。

cos质粒：lamdaDNA的cos区与质粒构成的载体:31-45kb

（3）考斯质粒载体的特点：

1.能像人-DNA那样进行体外包装,并高效转染受体细胞2.能像质粒那样在受体细胞中自主复制3.

重组操作简便，筛选容易4.装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围5.不能体内包装,

不裂解受体细胞.

（4）人工染色体载体

人工染色体实际上是一种“穿梭”克隆载体：含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源

质粒复制起始位点（ori）,还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒与复制起始位点

的序列，与合适的选择标记基因。

①细菌人工染色体要紧用于基因文库构建一一易于发生重组、缺乏稳固性、制

（BAC）:50-300kbz

备工艺繁琐

②酵母人工染色体（YAC）:350-400kb,要紧用于基因文库构建一一克隆大型基因簇（geneduster）

结构&构建动植物基因文库

三、用于基因转移的受体菌或者细胞

（1）受体（宿主）应具备的条件

1.限制性缺陷型一一外切酶与内切酶活性缺陷（hsdR-）2.重组整合缺陷型一一用于基因扩增或者

高效表达的受体细胞（recA-,recB；recC-）3.具有较高的转化效率4.具有与载体选择标记互

补的表型5.感染寄生缺陷型一一防匕重组细菌扩散污染，生物武器除外。

（2）各类基因工程受体（宿主）的特性

A.大肠杆菌-一遗传背景清嘶，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳固。适用于

外源DNA的扩增与克隆、基因文库的构建与外源基因的高效表达，是DNA重组实验与基因工程的

要紧受体菌。产生结构复杂、种类繁多的内毒素。

B.枯草芽抱杆菌一一遗传背景清晰，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素。

遗传欠稳固，载体受体系统欠完备。适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表

达。

C.链霉菌一一抗生素的要紧生产者，相对操作简便，不产内毒素。遗传不稳固，生长相对缓慢。要

紧用于抗生素生产菌株的改良。

D,酵母菌一一具有真核生物的特征，遗传背景清晰，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完

善，遗传稳固。内源性蛋白产物种类繁多且含量高。适用于外源DNA的扩增、克隆与真核生物基因

的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验与基因工程重要的

真核性受体菌。

E.昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统）一一具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对

较快，培养成本低廉，遗传稳固。DNA重组操作系统欠完善。适用于真核生物基因的高效表达。

F.哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）一一与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的

糖基化修饰系统。细胞培养条件苛刻，生长缓慢。适用于哺乳类动物与人的基因表达调控研究、基

因药物的生产，是DNA重组实验与基因工程的要紧哺乳动物受体。

G.植物细胞（拟南芥菜、烟叶）一一农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培

养简单且成本低廉，具有光合作用。遗传操作繁琐。适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药

物的生产，农作物品质的改良。

实验室常用的基因工程受体（宿主）：大肠杆菌；真菌：酵母菌（毕赤酵母，汉森酵母，啤酒酵母）

&丝状真菌（黑曲霉、青霉）；哺乳动物细胞CHO

（3）大肠杆菌转化常用方法

感受态（compentent）：受体（宿主）细胞通过一些理化或者生物学方法处理后，细胞膜的通透性发

生暂时性的改变，成为能同意外源DNA进入的一种生理状态。感受态细胞（compententcell）

①CaCI2法原理

G2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理

是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，转化混合物中的DNA与其形成抗Dnase的羟基-钙

磷酸复合物黏附于细胞表面，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞如今的状

态即为感受态。

具体大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化详见ppto

②电转化法③热激法

转化率的定义：每微克DNA分子转化宿主菌能获得的转化子数。

比如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108,即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞.一

微克PUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660）,也就是说，每3400个pUC18分子才有

一个分子进入受体细胞。

另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个

大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA。

不一致转化方法转化率：

G2+诱导转化——106-107/mgDNA原生质体转化——105-106/mgDNA

X-DNA转染——107-108/mgDNA电穿孔转化——106-109/mgDNA

转化子的筛选与鉴定（检）

由于重组率与转化率不可能达到理想极限，因此务必借助各类筛选与鉴定方法区分转化子与非转化

子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。

转化子筛选与鉴定流程

1、筛选一选择性平板筛选-2、重组子初步鉴定一一显色、PCR、比大小、酶切、分子杂交、生物/

免疫学活性一3、重组子确证一DNA序列分析一4、外源基因表达产物检测一一仅当外源基因克隆于

特定表达载体与宿主中时才需要。常规基因克隆则否。

转化子筛选方法：

抗药性筛选法；营养缺陷型筛选法；显色筛选法一一/acZ'基因（蓝色反应）、链霉菌质粒plJ702携

带的me/C基因（黑色反应）等；DNA电泳检测【直接电泳检测法；限制性酶切图谱法；PCR扩增

检测法】；原位杂交法（高通量筛选）；DNA序列分析一一双脱氧末端终止测序法；外源基因表达产

物检测法【聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS）；酶联免疫吸附法一EUSA；免疫印记（Western

blotting）；蛋白质生物功能测定法（高通量筛选）一淀粉酶基因；原位免疫沉淀法（高通量筛选）；

放射免疫原位杂交鉴定】

四、基因克隆

基因文库：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构

建方法的不一致，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因〉&CDNA文库（含有全部蛋白质编码

的结构基因）。在高度分化的生物体中CDNA文库的信息量远小于基因组文库

基因克隆常用方法:

①鸟枪法

基本策略：染色体DNA的切断：超声波处理一一片段长度均一，大小可控，平头末端；全能切一

片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控；部分酶切一一片段

长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。与载体连接：假如转化子使用菌落原位杂交法或者限制

性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；假如转化子使用基因产物功能检测法筛选，则选择表

达型载体。转化受体细胞一一假如转化子使用菌落原位杂交法或者限制性酶切图谱法筛选，则选择

大肠杆菌作为受体细胞；假如转化子使用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受

体细胞。筛选含有目的基因的目的重组子：菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建

立）。

②CDNA法

基本策略：［cDNA第一链的合成一cDNA第二链的合成（自身引导法、置换合成法、引导合成法、）】

/双链cDNA的克隆一离目的基因（完备分离程序、特异分离程序、差异分离程序）

③PCR法

使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：己知待扩增目的基因或者DNA片段两侧的序列，根据该序

列化学合成聚合反应必需的双引物

基本策略：由TaqDNA聚合的扩增的PCR产物中，其3,末端总是会带有一个非模板依靠型的突出

碱基，而且这个碱基几乎总是A,由于TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基

的存在，克隆时即能够采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也能够使用专门的T载体克隆。

④化学合成法（全基因合成）

基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数

N之间的关系可用下式表示：N=In（1-P）/In（1-f）

其中：P二任一基因被克隆（或者存在于基因文库中）的概率，f=克隆片段的平均大小/生物

基因组的大小。

基因文库的构建程序

1.基因组DNA的制备：

2.基因组DNA的切割：用于基因组文库构建的DNA片段的切割通常使用超声波处理与制性内限切酶

部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；第二，保证DNA片段大

小均一。连接前，上述处理的DNA片段务必根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA

片段随机连为一体

3.载体与受体的选择：出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的

入-DNA或者考斯质粒；关于大型基因组（如动植物与人类）需使用YAC或者BAC载体。cDNA文库

构建的载体通常选质粒；用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或者酵母菌。

4.从基因文库中筛选目的基因：能够使用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技

术等）直接筛选外，通常的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。原位杂交法。

第三章大肠杆菌基因工程

一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点

大肠杆菌表达系统的优点

1.遗传背景清晰（4405个ORF）,便于基因操作2.表达水平高，遗传较稳固

3.优良的工业性能：繁殖迅速、培养简单、操作方便4.被美国FDA认定为安全的重组药物生产系

统

大肠杆菌表达系统的缺点

1.缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等）2.胞内缺乏高效的表达

产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善3.细胞周质内含有种类繁多的内毒素

二、大肠杆菌系统高效表达原理

①大肠杆菌系统表达载体的基本元件

A、目的基因：编码外源蛋白的结构基因B、转录元件：启动子、终止子

C、翻译元件：核糖体结合位点、翻译起始位点

D、克隆元件：克隆位点、复制原点、标记基因

E、翻译后元件（非务必）：信号肽、融合肽

②外源基因在大肠杆菌中高效表达原理

A、启动子（Promoter）

是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始RNA合成的序列。是基因表达最关键与最强的表达调

控元件，启动子的强弱对表达水平有决定性影响。（没有启动子，基因就不能转录）。

启动子有种属特异性（如真核的在原核宿主中无效），有构成型（构成型表达系统）与诱导型（诱

导型表达系统）二大类。

原核基因启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核甘酸序列构成：（l）Pribnow盒，位于转录起

始位点上游5—10bp,通常由6〜8个碱基构成，富含A与T,故又称之TATA盒或者一10区。（2）

一35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称一35区，通常由10个碱基构成。

常用原核基因启动子：【lac（乳糖后动子）；trp（色期酸启动子）；tac（乳糖与色氨酸的杂合启动

子——Ptac=Ptrp的-35区+Plac的-10区）：T7启动子】——IPTG诱导；PL与PR（人噬菌体的

左向与右向启动子）——温控（热诱导），30C/37℃培养，42℃诱导。

T7启动子一一最成功的启动子

A.强大的T：启动子完全专一受控于TvRNA聚合酶，

B.T?RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶的快5倍

C.由于大肠杆菌本身不含T7RNA聚合酶，需要将外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌（使用DE3

溶源菌，T,RNA聚合酶置于LacUV5启动子操纵下，IPTG间接诱导）。

B、终止子

转录过头现象：A.RNA聚合晦滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的B.D'A序列，形成长短不一的

mRNA混合物。

防止转录过头策略：A、使用强终止子一一大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnTIT2T7&噬菌体DNA上的T

eB、二聚体终止子串联的特殊结构

C、核糖体结合位点（RBS）

mRNA5'端非翻译序列，包含SD、起始密码子、SD与起始密码子间的序列、起始密码子下游序列。

SD序列（Shine-Dalgarno）：位于翻译起始密码子上游的6-8个核甘酸序列（5‘UAAGGAGG3'）,

它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16srRNA3'端区域3'AUUCCUCC5'并与之专一性结合，

将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。

D、质粒拷贝数策略：较低拷贝质粒（几个至数十个）&调控重组质粒的扩增

E密码子满足宿主对密码子偏爱性的策略:外源基因全合成&同步表达有关tRNA编码基因

三、大肠杆菌工程菌的构建策略

1、包涵体型异源蛋白的表达

包涵体：胞内高效表达时，工程菌因大量合成异源蛋白质所形成的水不溶性积聚物。

性质：致密（密度大于细胞碎片与所有细胞器）、还含有标记蛋白、RNA聚合酶与少量的DNA、RNA

与脂多糖等非蛋白分子。裸露或者被膜包裹。

包涵体形成原因：大肠杆菌细胞内呈“还原”型环境，不不利于二硫键的形成，当高效表达时，新

合成肽形成二硫键的速度与折叠效率跟不上合成速度。

表达产物结构形式：a）部分属于折叠过程中的产物；b）部分为无序卷曲与聚集，分子内二硫键错配;

c）分子间存在大量错配二硫键。

以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点

包涵体表达形式的优点：

①、便于表达产物分离一包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片与细胞成分，菌体经超

声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来

②、利于表达产物在宿主细胞内稳固存在一在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本

上对异源重组蛋白的稳固性已构不成威胁

包涵体表达形式的缺点：

—以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，务必通过有效的变性复性操作，才能回

收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标

产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，特别当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时,

体外复性蛋白质的成功率相当低，通常不超过30%

包涵体的溶解与变性

包涵体的溶解与变性的要紧任务是拆开错配的二硫键与次级键在人工条件下，使包涵体溶解并

重新进入复:性途径中。常使用高浓度变性剂：8M尿素、6MGuC打开各类次级键，以DTT等疏基试剂

打开二硫键。

能有效促进包涵体溶解变性的试剂与条件包含：

促溶剂最常用，盐酸胭、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的弱酸盐污染，后

者能与多肽链中的氨基反应

表面活性剂SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性与纯化

混合溶剂如尿素与醋酸、二甲基碉等联合使用，溶解力增强

极端pH廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应

包涵体的复性与重折叠：二硫键形成（将多肽链中被拆开的游离筑基氧化重新形成二硫键（关键））;

通过次级键的形成使蛋白质重折叠

形成二硫键的方式要紧有：A化学氧化法一需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形

成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠B二硫键交换一一需要还原型

与氧化型谷胱甘肽（GSH与GSSG）,二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好

包涵体复性操作的方法：缓慢降低变性剂浓度，并尽量减低蛋白浓度。详见老师ppt。

包涵体的复性与重折叠的要紧挑战是：聚集沉淀

2、融合型异源蛋白的表达

以融合形式表达目的蛋白的优缺点

①目的蛋白稳固性高特别对分子量较小的多肽效果更佳②目的蛋白易于分离利用受体蛋白成

熟的抗体、配体、底物进行亲与层析，能够快速获得纯度较高的融合蛋白③目的蛋白表达率高与

受体蛋白共用一套完善的表达元件④目的蛋白溶解性好由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能

在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性⑤缺点：融合蛋白需要裂解与进一步分离，才能

获目的蛋白。在实际生产中，产品要素的成本往往就在该工段

用于融合蛋白构建的Tag（5种）

A、His6易于亲与层析、不影响目的蛋白结构、无免疫原性B、谷胱甘肽转移酶（GST）维持

良好空间构象C、硫氧化还原蛋白（TrxA）维持良好空间构象pTrxFusD、麦芽糖结合蛋白（MBP）

促进分泌E、内含肽（Intein）：类似内含子的多肽，与目的能蛋白融合表达，在表达后可进行自

剪接，兼有蛋白酶与蛋白连接酶的特性。4℃、DTT条件下切割。

目的蛋白的回收

⑴化学裂解法-溟化鼠（CNBr）法

原理：CNBr与Met的硫酸基反应，生成高丝氨酸（HMS）残基留于上游肽段C端

基因操作：在二个多肽基因融合处设置Met的密码子

⑵酶促裂解法

原理：利用蛋白前的专一性识别残基与位点切开融合肽

基因操作：在二个多肽基因融合处设置蛋白酶识别残基的密码子

常用多残基识别位点蛋白酶

Thrombin（凝血酶）Leu-Val-Pro-Arg^Gly-Ser

Enterokinase（肠激醒）Asp-Asp-Asp-Asp-Lys▼

FactorXa（X因子）Ile-Glu/Asp-Gly-Arg▼

PreScission（5C切割!GE）Leu-Glu-Va1-Leu-Phe-G1n▼Gly-Pro

TEVprotease（Invitrogen）Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln^Gly

Ir.tein（内含肽，自切割，NEB）dithiothreitolcleavage!

3、分泌型异源蛋白的表达

蛋白质的分泌机制

A、在信号肽牵引下跨膜，进入周质腔；B、信号肽酶切下信号肽，释放目的蛋白于周质腔。

以分泌形式表达目的蛋白的优缺点

A、分泌表达形式的优点：①目的蛋白以呈正确折置的可溶形式存在（周质为氧化型环境，利于二

硫键形成）②目的蛋白稳固性高（周质腔蛋白酶少）③目的蛋白末端完整相当多的真核生物成熟

蛋白N端并不含有的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去

B分泌表达形式的缺点：

相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中

进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达水平通常要比包涵体方式低很多，因此

目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。要紧用于实验室小规模制备。

4、寡聚型异源蛋白的表达

以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点

①稳固表达小分子短肽一短肽由于缺乏有效的空间结构，易受蛋白酶攻击，易降解，串联短肽

具有与蛋白质相似的长度及空间结构，可抗蛋白酶降解。②目的蛋白高效表达——在不提高质

粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数③目的产物回收困难

四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化

⑴工程菌构建与分析

工程菌构建与分析技术路线

表达载体构建与分析

|3程菌菌种保有

⑵工程菌遗传稳固性分析

在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒存在状况、结构完整性与功能完整性进行一

下三项分析:

A、存在状况：宏观逃逸率

B、结构完整性：酶切图谱分析、序列分析

C、功能完整性：表达水平

工程菌遗传不稳固性的表现形式

分配不稳固性（要紧）：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）

结构不稳固性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失

重组质粒的逃逸：工程菌部分细胞因质粒丢失而不再携带重组质粒的现象。

重组质粒逃逸的原因

①目的基因本底表达产物引起的毒性反应一一关闭质粒DNA合成途径，启动降解程序

②目的基因高效表达诱导宿主细胞产生应激反应③抗性标记基因过表达，抗生素消耗过快。④目

的基因表达盒“转录过头”，影响Ori区域。⑤☆环境因素诱导的重组质粒渗漏一一高温、表面活

性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（口丫咤）

重组质粒的宏观逃逸率：工程菌培养液中丢失质粒的细胞占细胞总数的百分比。

★宏观逃逸率（％）=（非选择性平板菌落数一选择性平板菌落数）/非选择性平板菌落数X100

⑶发酵工艺研究

工程菌生长与表达要紧影响因素

1、培养基：影响菌体生长、质粒稳固性、表达水平、产物可溶性等

碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等应避免外源基因表达的“葡萄糖效应”。

氮源：有机氮：酵母提取物、蛋白陈、酪蛋白水解物、玉米浆

无机氮：氨水、硫酸钱、硝酸钱、氯化钱等

其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等

2、菌龄与接种量

菌龄：自接种起培养的时间（小时）

影响停滞期、质粒宏观逃逸率

接种量：是指接入的种子液体积占培养液体积的百分比

过小：延长菌体停滞期，质粒宏观逃逸率高

过大：菌体生长过快，代谢产物积存过多，抑制后期菌体的生长，降低表达水平。

3、pH值、温度与溶解氧

pH值：影响生长速度、表达水平与产物可溶性。生长最适pH范围在6.874,表达最适pH为

6.0-6.5

温度：影响生长速度、表达水平与产物可溶性。生长最适37℃,较低温度利于可溶表达。

溶解氧：影响生长速度与表达水平

4、诱导时机与收菌时机

诱导时机：过早影响生物量、过晚影响表达水平。通常在生长曲线对数中期或者对数后期进行诱导

收菌时机：过早影响表达水平、过晚影响产物稔固性、可溶性、并造成浪费。通常在表达曲线平台

期（诱导后3・4小时）收菌

工程菌摇瓶水平生长与表达试验

要紧研究参数：培养基、接种量、pH值、温度、诱导与收菌时机等

要紧观察指标：表达水平（％）、生物量、表达产物积存（包涵体形成）情况、质粒宏观逃逸率

等

结果：生长曲线与表达曲线

（4）工程菌工业发酵工艺研究

工程菌发酵工艺基本要求与重点问题：

基本要求：高表达、高生物量、便于放大、低成本

重点问题：

1）质粒稳固性问题

2）表达与生长的矛盾问题（诱导时机）

3）发酵方式问题：分批式or流加式发酵？常规发酵or高密度发酵？

发酵方式：

1）批式发酵：较常用，高表达、但菌体量较少。

2）流加发酵：较常用，要紧补充碳源，菌体量大、表达水平下降，碳源流加时机与速度是关键。

☆高密度发酵：无机盐介质，通过碳源限制与流加实现高密度发酵。

3）连续发酵：少用，高表达、高总生物量、难操纵。

工程菌工业发酵工艺流程（如图所示）：

发发塞罐

工程萌发酵工艺流程

⑸表达产物分离纯化工艺研究

表达产物分离纯化原则：

1）要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度;

2;分离步骤要尽可能少，每一步便于工业放大；

3;尽量使用柱层析技术，各步骤间样品应无需复杂处理；

4;初步分离要快速、大规模，精纯要高分辨率；

5）尽可能避免带入有害物质；

6）每步需统计：得率、纯度、纯化倍数

分离提纯有三步策略：粗提、中度纯化、精细纯化

下列是粗提的图示

粗提

胎内表达工艺流程分迎表达

I应酵液一I

*

包谣体JEL

洗涤、裂角翠

I裂:解液「

复性

复性液一I粗堤液

第四章非肠道原核细菌基因工程

「芽抱杆菌系仁鬻蠹云:篙r杆菌

1链霉菌系统一n高效分泌表达外源基因

二棒状杆菌系统：氨基酸高产

―其它系统_

（新品种）—乳杆菌系统：食品基因工程

E菌系统，利用纤维素、木质素发酵产乙醇

一假单布菌系统，环保基因工程

硫杆菌系统：煤生物脱硫

芽胞杆菌基因工程

1、芽徇杆菌表达系统的优、缺点

优点：1、强大的分泌功能：如蛋白醛、淀粉酶，20g/L2、不形成包涵体，产物可正确折叠3、非

病原菌，无内毒素与外毒素，被美国FDA认定为GRAS（总体安全）系统4、容易操作，背景清晰5、

易于培养、生长旺盛

缺点：同源蛋白表达高（g/L）、异源蛋白低（mg/L）

2、大肠杆菌与芽胞杆菌在表达外源基因方面的比较

模式生物是否

革兰氏染色G-G+

表达产物的分泌功能极少大多数

包涵体形成不形成

表达水平高对同源蛋白高，异源蛋白较低

生物安全性高高

分离纯化过程复杂：复性、去内毒素简单

糖基化修饰无无

3、高效表达原理

1）异源启动子：大肠杆菌系统的启动子结构与芽泡杆菌的高度相似，异源启动子有效

2）短小芽抱杆菌胞壁蛋白操纵子调控元件：中壁蛋白（MWP）与外壁蛋白基因构成一个操纵子（。明）,

由后动子、SD序列与分泌信号肽序列构成的5'端（0.6kb）序列可用于外源基因分泌表达。

调控机制：完整的胞壁阻遏转录，生长平台期胞壁蛋白的脱落与介质中的低浓度的Mg++诱导（去阻遏）。

3）利用枯草芽抱杆菌胞外果聚糖酶操纵子调控元件

果聚糖酶操纵子（sacB）由启动子PsacB、上游正调控序列DegQ与SacU、果聚糖酶基因（sacX）、下

游终止子样序列与抗终止蛋白SacY基因构成。

第五章真菌基因工程

一、真菌表达系统的优缺点

具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清晰的优点，具有真核系统蛋刍翻译后加工与分泌系统大

规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，为GARS系统

缺点：产物糖基化位点与结构特点与高等真核的有差距

二、酿酒酵母载体系统

1、野生型质粒：211质粒（酿酒酵母）

2、人工构建质粒:5种

酵母附加型质粒（YEp）酵母复制型质粒（YRp）

酵母着丝粒质粒（YCp）酵母人工染色体（YAC）

酵母整合型质粒（Yip）

3、标记：营养缺陷型的互补基因/抗性基因

宿主细胞：为氨基酸或者核甘酸生物合成缺陷型突变子，要紧有：住5、TRP-,HIS：URA-

载体：携带相应的合成基因，如：Ieul/leu2、trpl.his3/his4、ura3

选择压力：不完全培养基，如：YNB、无机盐培养基

4、酵母菌转化方法

A、原生质体转化法：

细胞：去壁的原生质体

原理：以PEG等渗缓冲液稳固原生质体，以Ca2+诱导细胞摄取外源DNA。

特点：30%以上为多质粒共转化

转化效率：可达原生质体总数的1-2%,但操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。

B、碱金属离子介导转化法：

细胞：带壁的完整细胞

原理：通过碱金属离子（如Li+等）、PEG与热休克处理诱导细胞汲取外源DNA。

特点：方法简便，容易掌握，有用性强；汲取线型DNA的能力明显大于环状DNA,两者相差80倍；

共转化现象极为罕见。

C、电激转化法：

细胞：带壁完整细胞或者原生质体

原理：通过电脉冲对细胞膜造成DNA摄取通道

特点：转化率高（105/mgDNA）.操作简便、适用范围广

5、用作外源基因表达的酵母宿主菌

酿酒酵母：最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化

甲醉酵母：能够利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理

毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）

汉逊酵母：多型汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）

其它酵母：已有60多种酵母菌建立了转化系统

乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）

6、酿酒酵母糖基化系统

糖基化位点：Asn-X・Thr/Ser（X代表任何氨基酸）

N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳固性及活性较重要。

0-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化

三、甲醇酵母表达系统

1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子：指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母，如：毕赤酵母、汉森酵母、

假丝酵母

甲醇氧化酶启动子：A、目前已发现的、最强的真核启

B、严谨调控型启动子：

A0X1：甲醇诱导，葡萄糖阻遏，甘油脱阻遏

MOX：甲醇诱导，葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏

2、甲醇酵母表达系统的优缺点

A、表达水平高（最高水平的系统）

B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化

C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vsl00；50个甘露糖）

D、产物可正确折叠与高效分泌（最高分泌表达系统）

E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。

F、实验室与工业操作简单

G、不能满足结构要求严格的糖基化

3、甲醇酵母二大宿主系统要紧特点

项目毕赤酵母汉逊酵母

最适温度30℃37℃

最适pH值4.54.5

甘油阻遏是否

糖基化部分过度较正常

高密度发酵100g/L100g/L

选择标记his4^G418、Zeocin、Cu++Ieu2^his3、ura3、G418

5、多拷贝整合重组子筛选

必要性：目的基因表达盒的多拷贝整合是高效表达的基础，但多拷贝整合是低概率事件（1-10%）

G418抗性筛选：

表达载体引入卡拉霉素基因（Kanamycin）作二级筛选标记，从His4+转化子中筛选高G418抗性转

化子，抗性越高整合拷贝数越高。

杂交筛选：菌落原位或者Dot-Blotting杂交筛选

6、His+转化子甲醇表型筛选

必要性：A、不一致目的基因的表达偏爱不一致甲醇表型

B、工程菌表达诱导条件的优化需要根据甲醇表型

C、限切酶线性化方式诱导靶向整合（下表），但即使非AOX1取代型整合方式，也有可能因

同源重组而破坏AOX1基因，产生MutS表型。

线性化位点整合事件GS115株KM71株

（限切位点）（位点）（AOX1野生）（AOX1缺失）

Sal\orStu\插入，his4His+Mut+His+Muts

Sac\插入，S'AOXlHis+Mut+His+Muts

NotlorBg/ll取代，AOX1His+MutsHis+Mut+Arg-

7、转化子PCR鉴定

必要性：

证明外源基因确实整合在宿主基因组DNA,并排除意外丢失目的基因（机理不明）的His+表型转

化子。

PCR鉴定：以GS115的His+转化子为例

模板：转化子基因组DNA

引物：Primer5'：来自5'AOX1；Priner3,：TT（3'A0X1）

产物：a.目的基因（AOX1缺失，Muts型转化子）

b.目的基因+完整AOX1基因（Mut+型转化子）

高密度发酵工艺流程与碳源操作

种子液制BMGY,至对数期，16-24hr,OD600=2-6

4%甘油+无机盐培养基，至甘油耗尽，18-24hr

以50%甘油限制性流加，增加细胞密度，4hr,180-220g/L

以100%甲醇限制性流加，诱导表达，增加细胞密度，48-68hr,

350-450g/L

第六章昆虫基因工程

1、DNA转座子的类型

插入序列(IS)：最简单的转座子称之插入序列(Insertionsequence,IS)o

IS家族有很多成员，它们的结构相似

特征：两端都有短5-9bp的正向重复序列(directrepeats,DR)(靶序列)，略长15-25bp的反向

重复序列(invertedrepeats,IR)lkb左右的编码区，它仅编码与转座有关的转座酶。

复合转座子(compositetransposon)

复合转座子是由两个重复序列夹着一个或者多个结构基因如某些抗药性基因与其它基因构成。存在于R

因子及其它质粒中。复合转座子两端的组件由IS与类IS构成。

2、DNA转座的通常模式

转座可被分为复制性与非复制性两大类。

在复制性转座中，所移动与转位的是原转座子的拷贝。转座酶(transposase)与解离酶(resolvase)

分别作用于原始转座子与复制转座子。TnA类转座要紧是这种形式。

在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、血及Tn5等都以这种方

式进行转座。

3、果蝇转座元件

Copia反转座子；FB家族；元件

P因子

P因子全长2907b