分子生物学实验

分子生物学试验指导

1实验概述

1.1实验目的

实验过程中，主要通过碱裂解法提取质粒DNA、对质粒进行双筋切、并连接构建成

重组DNA分子、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备、感受态细胞的转化以及目的蛋臼

质gfp的正常表达，来完成一系列分子生物学基础实验。

通过本实验，学习并掌握碱裂解法、双酶切、氯化钙法制备感受态细胞的制备及采

用a互补现象进行重组DNA鉴定的原理和方法。

1.2实验原理

质粒是细菌内共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表

型，经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种

基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途。

本次实验中，分子克隆质粒载体T所携带的外源基因是gfp绿色荧光蛋白，实验的最

终目的是将gfp基因插入表达载体P中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导

其表达，培养出绿色的大场杆菌菌落。

为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过HandHI和

NCOI两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段gfp和表达载体-P质粒的DNA,

然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其

在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp

和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断gfp基因工程菌的构建效果。

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2实验流程

2.1实验安排表

实验内容时间安排

质粒T、质粒P的提取3h

电泳检测质粒提取效果30〜45min

确定质粒提取成功后,利用HindHI、Ncol这2种限制性后

10〜11h

切陋分别对质粒T、质粒P进行双酶切

电泳检测前切情况，若能切成功，利用试剂盒回收DNA片断45min

利用T4DNA连接厢进行连接14〜16h

大肠杆菌感受态细胞的制备3h

转化（gfp基因导入受体细胞）2h

重组子的筛选（在含有Amp的LB平板上筛选）12〜16h

诱导表达与鉴定（加入诱导物IPTG诱导gfp表达）12〜16h

2.2实验流程图

①质粒DNA的提取与纯化碱液裂解法；乙醉洗涤纯化

（T-gfp质粒作为克隆载体、P32作为表达载体）

]

②通过观察电泳图片，来鉴定T、P两种质粒DNA的提取结果琼脂糖凝胶电泳的方法

③对成功提取的T、P两种质粒DNA进行双酶切限制性内切酶HandllLNeoI

④T-gfp、P两种质粒的DNA片段的回收割胶（试剂盒快速回收）

用刀片把凝胶上的目的DNA条带割取下来

⑤连接T-gfp、P两种质粒的目的DNAT4噬菌体DNA连接的

（重组DNA分子的构建）

2实验流程

⑥大肠杆菌感受态细胞的制备氯化钙法

⑦将连接后的重组DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞感受态细胞的转化

⑧重组子的筛选含有AMP「的重组子才

能在AMP平板上生长

⑨将含有gfp、AMP「两种目的基因的重组子进行诱导表达重组DNA分子的鉴定在平板

]gfp绿色荧光蛋白基因被诱导表达上加入底物IPTG

⑩gfp基因只有在诱导物IPTG和底物X-gal的存在时，才能正常表达，在平板上生成绿色的菌落

构建出含有gfp绿色荧光蛋白基因的工程菌

图2.1gfp基因工程菌的构建与表达

3实验操作方法

可以转录和表达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称

为表达载体。

大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，

即能将外源基因运载到大场杆菌细胞中

在本次实验中，我们所选择的表达载体是大肠杆菌PBR322质粒。

3、绿色荧光蛋白(GFP)

greenfluorescentprotein,简称GFP,这种蛋白质最早在一种学名Aequorea

victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，

会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个

冷光蛋白质与钙离子(C/+)可产生交互作用。

在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基

|2<|(reportergene)。

GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白(Pholobleaching)能力比荧光

素(fluorescein)强，特别在450〜490nm蓝光波长、.更稳定。

由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，

因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无

法比拟的。

3.1.2实验目的

1、通过用LB培养液培养含有T-gfp质粒和PBR322质粒的大肠杆菌。

2、利用“碱裂解法”从大肠杆菌中提取出T质粒和P质粒的DNA,然后用乙醇洗涤沉

淀，达到纯化质粒DNA的目的。

3.1.3实验原理

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在

NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA

分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而

呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法，通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

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例如，氯化钠-澳化乙锭梯度平衡离心、离子交换层折、凝胶过滤层析、聚乙二醉分级

沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA,可经过苯酚、

氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤来纯化质粒DNA,故在分子生物学实验

室中常用。

所以，在本次实验中，我们采用了“乙醇沉淀法”来洗涤DNA沉淀物，去除残余蛋

白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酹切、常

规亚克隆及探针标记等要求。

3.1.4实验仪器、材料及试剂

1、仪器

微量移液枪、微量离心管、台式高速离心机、干燥机、高压蒸汽灭菌锅、常用玻璃

器皿等。

2、材料

含有T-gfp质粒和PBR322质粒的大肠杆菌DH53。T质粒和P质粒的图示如下:

(2)PBR322质粒(表达载体)

3实验操作方法

图3.2PBR322质粒载体

3、试剂

（1）用于碱法提取质粒DNA的三种溶液

______________________-3」碱法提取质粒DNA的三种溶液

―试剂名称____________________________________试剂成分及含量

50mmol/L葡萄糖,10mmo/LEDTA,25mmol/LTri-HCl（H=8.0）,用前加

溶液I（GET缓冲液）p

溶菌酶4mg/mL

溶液II（变性液）0.2mol/LNaOH,1%SDS

溶液IH（乙酸钾溶液）__________60mL的5moi/LKAc,11.5mL冰醋酸，28.5mLH2（）

（2）缓冲液

TE缓冲液：10mmol/LTri-HCl,1mmol/LEDTA（pH=8.0）,其中含有RNase20

pg/Lo

（3）其他试剂

氨茉青霉素（AMP）,异丙醇，70%乙醇溶液，RNase液。

3.1.5操作步骤

1、培养大肠杆菌使质粒扩增

（1）配制LB液体培养基

将下列组分溶解到3.9L水中，让后再将水补足至1L：

表3.2LB液体培养基配方

成分含量

蛋白陈10g

酵母提取物5g

氯化钠10g

1mol/LNaOH调整至PH=7.0

1L的LB培养液配制好之后，分别分装到4个三角瓶中，250mL7个。然后放置

到高压蒸汽灭菌锅中灭菌1.5〜2h。灭菌后取出移至超净工作台，冷却到47℃左右，

每瓶培养液分别加入5HL的氨茉青霉素（AMP）。

（2）培养大肠杆菌

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将带有质粒T-gfp和PBR322的大肠杆菌单菌落，接种到含有氨苇青霉素的LB液

体培养基2〜5mL中，然后放置在恒温37℃的摇床中培养8〜16ho

加入AMP的目的：AMP可以抑制宿主的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的

复制，然而，松弛型质粒仍可以继续复制，若干小时后，拷贝数持续递增。

2、收集和裂解大肠杆菌

(1)取含有质粒T、P的大肠杆菌液体培养液1.5mL分别装于微型离心管中，转速

10000转/min离心1min,去掉上清液，加入1pL溶液I,充分混匀后室温下放置5min。

溶液I的作用：所含有的EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以

抑制DNase的活性和抑制微生物生长，加入EDTA可以把大肠杆菌细胞中所有的二价

金属离子都螯合掉。

(2)加入200pL新配制的溶液II,颠倒2〜3次使之混匀，冰上放置5min。

溶液II的作用：十二烷基酸钠(SDS)可以使细胞壁破裂。经SDS处理后，在

碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都会发生变性。

注意：一是操作时间不能过长，因为在此碱性条件下染色体DNA片段会慢慢断

裂；二是操作时动作要温利，振荡激烈也使染色体DNA片段断裂。

(3)加入15()卜1冰冷的溶液III,轻轻颠倒数次使之缠绕均匀，冰上放置5min。

实验现象及溶液ID的作用：溶液III加入后，我们可以观察到离心管内出现白色

沉淀。KAc中的K离子把SDS中的Na离子置换出来从而形成了不溶性的PDS,由于

K离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质也沉淀下来，同时大肠杆菌的染色体

DNA也一起被共沉淀了。醋酸可以中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,

一旦发生断裂，染色体DNA就不可能被共沉淀了。

此时，质粒DNA很快可以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来,

而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可以得到质粒DNA。

3、分离和纯化质粒DNA

(1)用台式高速离心机，转速10000转/min离心5min,将上清液移入另一干净的离

心管中，并加入等体积的异丙醇混匀，室温放置5min,转速12000转/min离心5〜8min,

弃去上清液。

(2)沉淀用70%乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。

加入异丙醇和乙醇的作用：因为有部分蛋白质还未被沉淀出来，所以要用异丙

醇进行抽提，然后进行乙醇沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA,不然时间一长就会因

8

3实验操作方法

为掺入DNase而发生降解。加入异丙醇后，溶液界面的分层就会更清晰，便于沉淀的回

收。

回收后的沉淀因为可能含有一定的盐类，因此要加入乙醇洗涤沉淀，将盐去除。

（3）每支离心管加入3FILRNase和30gL无菌水，然后室温放置10min,使质粒DNA

充分溶解。

加入RNase的作用：使样品中残留的、未降解的RNA降解，避免干扰电泳鉴

定的结果。

3.1.6实验结果

得到分别含有T-gfp质粒和P质粒的样品溶液，各装于两支干净离心管中，待进行电

泳检测。

3.2琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的提取效果

3.2.1实验概述

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由D型和L型半乳糖以a-1,3和P-1,

4糖首键相连形成的线状高聚物。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔

径范围从50nm到大于200nm的凝胶。

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一，这种方法简

便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装置中进行电泳，如

果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。

3.2.2实验目的

1、采用琼脂糖凝胶电泳的方法，对样品进行检测，目的主要是为了观察染色后的凝

胶上有否出现清晰的条带,

2、观察结果，如果出现清晰的条带，则证明了T-gfp质粒和P质粒被成功提取出来,

而且含量足够；如果条带不清晰，则说明了样品中提取的质粒含量较少，不利于后续操

作。

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3.2.3实验原理

DNA带负电，如果样品中含有质粒DNA,那么，在电场作用下，DNA可以在琼脂

糖凝胶板上向阳极移动。不同长度的DNA片段会表现出不同的迁移率，因而可根据DNA

分子的大小来使之分离。经过EB染色后，在紫外灯照射下可以观察到琼脂糖凝胶板上

有否出现清晰的条带，来判断质粒DNA的提取结果，

3.2.4实验仪器、材料及试剂

1、仪器

电泳仪、灌胶模具及梳齿、电泳槽和紫外投射仪°

2、材料

待检测的质粒DNA样品、琼脂糖。

3、试剂及上样液

(1)TBE缓冲液(10x)

称取Tri108g,硼酸55g,0.5mol/LEDTA(pH=8.0)40mL,用H2O定容到1000

mL,高压灭菌作为10x贮液：稀释1()倍后作为工作溶液使用。

(2)上样液

0.25%滨酚蓝，质量浓度为40%的蔗糖水溶液。

(3)溟化乙噬染色液(10mg/mL)

在20mLH2O中溶解0.2g溟化乙咤，混匀后于4℃避光保存。

3.2.5操作步骤

1、1%琼脂糖凝胶的制备

取250mL三角瓶，加入100mLTBE缓冲液，称取1g琼脂糖加入缓冲液中，用包

装纸封好瓶口，然后将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂溶解。

2、胶板的制备

将有机玻璃内槽洗净、晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至

65°C的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心地倒在内槽上，使胶液慢慢地展开直到整个玻璃板

表面形成均匀的胶层。室温下静置15min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，将铺好

胶的玻璃内槽放入装有电泳缓冲液TBE的电泳槽中。

10

3实验操作方法

3、加样

使用微量移液枪将3匹溟酚蓝上样液与15gL质粒DNA样液混合均匀，然后用移

液枪将总共18匹的样品加入到胶板的样品孔内。每加完一个样品，要换一个松头。加

样时要避免将样品滴出到样品孔外。

4、电泳

加样后的凝胶板可以通电进行电泳。采用在150V的电压下进行室温电泳。因为

DNA是带负电的，通电时，我们可以观察到样品向阳极移动。电场强度不应高于5V/cm,

当澳酚蓝移至距离胶板下沿约1cm时・，停止电泳。

5、染色和观察

从电泳槽中小心地取出凝胶，并将凝胶置于EB染色剂中染色8min左右，然后用

清水冲洗凝胶。最后将凝胶置于紫外灯下观察。DNA存在处会显示出红色的荧光条带。

EB染色原理：EB能插入DNA分子的碱基对之间，完成与DNA结合，DNA所吸

收的260nm的紫外线传递给EB,或者结合的EB本身在300nm和360nm吸收的射线

均可在可见光谱的红橙区，以590nm波长发射出来，

注意：①EB是一种强诱变剂，取用含有这一染料的样品时必须戴手套；②紫外线

对人体、眼睛有危害性，在紫外灯下观察时，应带上防护眼罩或面.罩，避免受紫外线损

伤。

3.2.6结果分析

1、在紫外灯下，可以观察到样品分别含T质粒和P质粒的情况，如下图所示:

图3.3样品中T质粒和P质粒电泳鉴定结果

我们可以从图4中看到电泳道2、4、10和18中有明显的、亮度较好的质粒DNA

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条带，电泳道1、16中虽然也可以看到条带，但是条带区分不清晰，可能是因为样品中

还残留蛋白质，影响分析结果。如果没有看到荧光条带，则说明样品中不含有质粒DNAo

2、鉴定原理

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带。

II点样孔

_-----一开环DNA

~线形DNA

超螺旋DNA

图3.4质粒DNA的琼脂凝胶电泳示意图

在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在，在提取质粒过程中，除了超螺旋

DNA外，还会产生其它形式的质粒DNAo如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处

或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环

DNA(ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA)。

同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其次序为：cccDNA>直线DNA>

ocDNAo

因此在本次实验中，我,门可以看到琼脂糖凝胶电泳道上出现的是3条清晰的DNA荧

光条带。

3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素

在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响，例如：DNA分子的大小；琼脂糖的浓度;

所加电压等等。DNA片段越长，泳动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。一

个给定大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同，DNA电泳迁移

率的对数与凝胶浓度成线性关系。用低浓度的荧光染料，如溟化乙噬染色后，凝胶中的

DNA可以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到20pg的双链DNAo

12

3实验操作方法

3.3T-gfp质粒、P质粒的双酶切及电泳分离目的片段

3.3.1实验目的

利用步骤1所得到的含有T质粒和P质粒的样液，分别同时加入HandlllftNCOI

两种限制酶进行双酶切，然后对酶切后的样品进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶板上分离出

目的片段。

3.3.2实验原理

能识别双链DNA分子中的某一特定核昔酸序列，并由此切割DNA双链结构产生粘

性末端或平端的酶，称为限制性核酸内切酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。

本次实验，我们采用了HandHI和NCOI这两种常用的限制酶，其识别序列和切口是:

HandlH：NeoI:

GIAATTCCiCATGG

II

---------------1---------------1

CTTAA1GGGTACC

如图所示GAATTC和CCATGG核甘酸序列表示酶识别位点，线条表示酶切口。限

制酶对特定环状质粒DNA有多少酶切位点，就能产生多个酶切片段，酣切后的片段可

以用琼脂糖凝胶电泳来分离鉴定。

3.3.3双酶切的作用

因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能：一种是单酶切，另一种是双

酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。

1、对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这

样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5,除磷酸处理，

原理是连接酶只能连接DNA片断的3,0H末端与5,端，所以除磷后载体不会自环。一

旦有外源片断插入时，由外源片断提供5,端就能与载体进行连接。

2、对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载

体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定

向连接到载体上。

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3.3.4实验器材、材料及试剂

微量移液枪、电泳仪、恒温水浴锅、紫外投射仪、HandHI及M）x酶切缓冲液、NCOI

及l（）x酶切缓冲液、无菌水、浪酚蓝上样液、TBE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶板、EB染

色剂。

3.3.5操作步骤

1、双酶切（酶切体系）

表3.3酶切反应体系加样表

溶剂名称体积

10x前力缓冲液12gL

T、P质粒DNA样品

无菌水XML（调整加样量至总体积100pL）

限制性核酸内切酶2pL

总体积100pL

37℃温浴3h,可根据实际情况放大反应体积

（1）取出两支分别装有T质粒和P质粒样品的离心管，然后微量移液枪向两支离心

管中分别加入12RL相应的两种酶切缓冲液，虽然有L、M、K型三种缓冲液选择，但

是选择M型缓冲液可以使HandW的酶切效率达到100%,而NCOI达到80%,

（2）然后再用无菌水补足溶液体积至100RL。

（3）用微量移液枪向两支管内分别同时加入HandlH和NCOI两种酶液2gL,用手指

轻弹管壁使溶液混匀。

（4）将离心管置于37°C水浴中酶切10h使酶切反应完全，放置于冰上对限制酶进行

灭活,并待进行电泳分离°

2、琼脂糖凝胶电泳分离目的片段

（1）酣切完成后，取分别含有T、P两种质粒DNA的样液15pL,然后分别与3pL

澳酚蓝上样液混合均匀，用微量移液枪将样品加入到凝胶样品孔内。加样后的凝胶板可

以通电进行电泳。

（2）将电泳完成后的凝胶进行EB染色8min、自来水冲洗干净，然后置于紫外灯下

观察。

14

3实验操作方法

3.3.6结果分析

在紫外灯下可以观察到酶切后琼脂糖凝胶板上条带的情况，如下图所示:

图3.5质粒DNA酶切鉴定结果

从图6可以看出，样品进行双酶切后，有些电泳道上呈现出清晰的条带，有些则因

为酶切效果不好而没有出现荧光条带。电泳道1、9上所呈现出的荧光条带是狗对清晰

的，说明其酶切效果较好，成功分离出目的片段。

337DNA酶切过程的影响因素

1、要注意控制好酶切的时间，酶切时间达到后要立刻移至冰中，将酶切效应解除，

避免破坏质粒DNA的结构。

2、盛装限制酶的离心管不能暴露在空气当中，因为环境中存在多种能破坏限制酶三

维结构的物质，使其酶切活性降低，直接影响结果，所以要将盛装限制酶的离心管盖盖

好。

3、与DNA的构象有关（SC、L、OC）；同时也与DNA的纯度有关（蛋白、氯仿、

SDS、EDTA、甘油等）。

3.4目的酶切DNA片段的回收

3.4.1实验目的

DNA酶切样品经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外投射仪下确定所需回收的

DNA片段（gfp基因和P质粒载体）的位置，用刀片将其切下，称重，放入两支灭菌的

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Eppcndorf管中，以0.1g相当于100RL折算。

3.4.2实验原理

经内切酶消化的DNA片段，在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，

不同大小的DNA分子由于迁移率比不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，

再利用“DNA快速纯化/回收试剂盒”来回收目的DNA片段。

本次实验所用的试剂盒可以从溶液或者琼脂糖凝放中回收DNA片段，不含盐、蛋白

质、RNA等杂质，纯度与CsCl密度梯度离心相仿。500bP以上片段，回收率80%以上,

200bp〜50()bP回收率达60%以上，1()()bP〜20()bP回收率达60%,可以回收单链、双

链DNA片段及环状质粒DNAo

此方法原理：本试剂盒带有Resin质子化以后，具有在高盐、低PH值情况下吸附

DNA,低盐、高PH值情况下释放DNA的性质。

3.4.3实验仪器、材料及试剂

1、灭菌的刀片、台式高速离心机、微量移液枪。

2、DNA快速纯化/回收试剂盒，其组成如下：

组成成分含量作用

离心柱50个柱上含有树脂

溶液A60mL溶胶液

溶液B1.5mL中和液

溶液C13mL漂洗液(使用前加52mL无水乙醇!)

溶液D2mLTE缓冲液

3.4.4操作步骤

1、DNA酶切样品经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外投射仪下确定所需回收

的DNA片段(gfp基因和P质粒载体)的位置，用刀片将其切下，称重，放入两支灭

菌的Eppendorf管中，以0.1g相当于100pL折算。

Maker

6k

4k

16目的片断

3实验操作方法

2k

Ik

500bp

200bp

lOObp

2、切取含DNA片段的琼脂糖(100mg—300mg),尽量切得小一点，用吸头捣碎按

重量比1:3(切重量：溶液A的体积比)加入溶液A。

3、50°C水溶10min,胶完全溶化即可，其间可振荡助溶2-3次，待后置室温加入

15HL溶液B,充分混匀。

4、将溶液置于离心柱中，静置2min,N8000rpm离心30s,若一次加不完，可分两

次离心。

5、倒掉液体，加入500RL溶液C于离心柱中8Q00rpm离心30s,弃液体。重复步

骤4。

6、120()()rpm再次离心1min,甩干剩余液体以除去残余酒精。

7、将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5-1()min,使乙醇挥发殆尽。

加入20-30卜1溶液D(50℃水浴)，静置2min。

8、12000rpm离心2min,管底溶液即为所需DNA,将DNA贮存于-20℃可长期保

存。

3.4.5影响回收率和回收质量的因素

1、影响回收率和回收质量的最主要因素是PH值和切胶薄厚。溶液A为橙黄色，有

利于观察琼脂糖凝胶是否完全溶解，也是PH指示剂。当回收时样液总体积大于500HL

可适量多加溶液B,切胶越薄越好。

2、水浴温度范围为50〜65°C,溶液D的用量视实验对DNA浓度要求而定。

3、回收质量可用OD260/280比值来判断，本次实验所采用的试剂盒所得DNA比

值大于1.4,比值偏低主要是一些无级离子的存在吗不影响其他分子生物学操作。

3.5质粒DNA连接(重组DNA分子的构建)

3.5.1实验概述

DNA重组，就是把外源目的基因“装进”载体的这一过程，即DNA的重新组合。这

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种重新组合的DNA分子是由两种不同来源的DNA组合而成，所以称作重组体或嵌合

DNAo

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中,

将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接，

3.5.2实验目的

在T4噬菌体DNA连接酶作用下，被HandU［和NCOI双酶切所形成的粘性末端DNA

分子可以连接上，形成可能含有目的基因gfp的重组质粒DNA分子。

3.5.3实验原理

DNA连接前有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA

连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA

连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分

子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA

连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：①T4DNA连接瞄与辅因

子ATP形成酶-ATP复合物；②酶-ATP复合物再结合到具有5,磷酸基和3,羟基切口的

DNA±,使DNA腺首化；③产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常

将两个不同大小的片断相连。

3.5.4实验仪器、材料及试剂

1、仪器

微量移液枪、恒温水浴锅、电泳仪

2、材料及试剂

已经回收的gfp基因片断和P质粒DNA片断溶解液、T4噬菌体DNA连接酹及缓冲

液（10x）o

表区连接反应加样表

试剂名称加样体积

10XT4DNA连接酶缓冲液5HL

外源DNA（gfp基因）根据回收DNA的浓度设计反应体系，载体DNA

载体DNA（PT32）与外源DNA的摩尔数比约为1:3

18

3实验操作方法

T4DNA连接酶12HL

3.5.5操作步骤

1、互补粘性末端连接：将回收后的两种DNA片段溶解液混合于一管中，其中gfp

基因片段溶解液为30pL,P质粒DNA溶解液为10（按照载体DNA与外源DNA的

摩尔数比约为1:3来加入）。

2、往混合液中加入5|iLT4DNA连接酶缓冲液和12gLT4DNA连接酶，小心混匀，

于14℃水浴中保温14〜16h。

3、电泳检测：取2RL连接后的样液作电泳检测，鉴定连接反应的产物。若连接产

物符合预期结果，则可以迅速作转化实验。

3.5.6连接反应改进措施

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结

合是不稳定的。因此采取折中的温度，BP12-16℃,连接12-16h（过夜），这样既可最

大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

3.6大肠杆菌感受态细胞的制备

3.6.1实验概述

连接反应中形成的重组子及其它质粒分子的混合群体必须通过转入宿主细胞将它们

相互分离，进而进行自主复制。

但是，在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人

工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个

细胞到另一个细胞的接合转移.如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生

一种短暂的感受态以摄取外源DNAo

人们发现，用含Ca?+的溶液处理的大肠杆菌细胞将会易于吸收外源DNA,这一过程

称为转化。

3.6.2实验原理

受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaC12,KC1）等化学试剂法的处理后，细胞

广东工业大学现代分子生物技术实验报告

膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入

受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传

性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源DNA

分子的受体细胞。

本次实验所采用的制备感受态细胞的方法是氯化钙法，CaCL法简便易行，且其转化

效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积

15%的无菌甘油于-70。。保存（半年），因此CaCL法为使用更广泛。

3.6.3实验目的

通过采用氯化钙法，使大肠杆菌DH53的细胞的通透性发生改变，从而制备出能容许

含有外源DNAgfp荧光蛋白基因的质粒载体通过的感受态细胞。

3.6.4实验仪器、材料及试剂

1、仪器

恒温摇床、电热恒温水浴、分光光度计、超净工作台、微量移液枪、高速冷冻离心

机、无菌微量离心管、10mL离心管、常用玻璃器具。

2、材料及试剂

E.coliDH5S作为受体组胞、LB培养液、0.1mol/LCaCl2（含20%甘油）、冰块、无

菌水。

3.6.5操作步骤（氯化钙法）

1、将单个菌落接种子含LB培养液的试管中，37c振荡（250转/min）培养过夜。

2、向装有100mLLB培养液的500mL三角瓶中各加入1RL（接种量为1%）过夜

培养细胞，37°C振荡培养至光密度（OD6OO）值为0.4〜0.6（需2h）。

3、将装有培养液的三角瓶一并移至超净工作台，然后用移液枪将培养物分别移入1（）

mL的离心管中，并置于冰上保持20min。于4°C离心3min,弃去上清液。

4、使用移液枪再往离心管中加入培养液，于4℃离心3min,弃去上清液，这时，

我们可以观察到离心管底部积聚着菌体。

5、往离心管中加入无菌水并再离心6min,弃去上清液（用于去除溶液中残留的盐）。

6、向离心管中加入10mLeaCL溶液，小心混合均匀，并于4℃离心3min,弃去上

20

3实验操作方法

清液。

7、再往离心管中加入冰冻的含有20%甘油的().1mol/LCaCb溶液，并使沉淀悬浮于

溶液中，再于4°C离心3min,小心地将官底沉淀刮离管壁，并使之混匀。

甘油的作用：保护细胞免受冰晶形成的伤害。

8、将所得溶液分装于20个微量离心管中，100^17个，并置于4c冰箱中贮存备用。

3.6.6提高细胞感受态效率的方法

1、培养基的装量：培养基的装量关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还

是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值

为：培养基体积/三角瓶容量二100mL/500mL,50mL/250mL0

2、培养基的pH值：这里讲的pH值还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接

种前的pH值在6.8-7.2,等菌株振荡培养好后，pH值不要低于6.0,最好在6.5以上。

这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，有利于保持感受态效率。

3、培养基中的各种离子：经实验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该

方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用MgCb作为培养基的添加物，

在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。

4、在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

5、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超

低温冰箱内。

3.7重组质粒DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞(转化)

3.7.1实验目的

将连接后、带有gfp基因的P质粒载体分子导入到大肠杆菌感受态细胞中，从而制备

出转化子。

3.7.2实验原理

转化，是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是

微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

广东工业大学现代分子生物技术实验报告

在一定条件下，将带有外源DNA载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分

子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受

体细胞表现出新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以筛选出

转化体，即带有外援DNA分子的受体细胞。

3.7.3实验仪器、材料及试剂

1、仪器

恒温水浴锅、恒温摇床、微量移液枪。

2、材料及试剂

连接后的产物、待用的大肠杆菌感受态细胞、冰块。

3.7.4操作步骤

1、用移液枪将连接后的产物(即重组DNA分子)100RL分装于4支干净离心管中，

25比7支。

2、从冰箱中取出制备好的大肠杆菌感受态细胞，并放在冰上待其溶化后，取100匹

加入每支离心管中，混匀并在冰上静置20min。

3、将离心管放入42℃水浴中2min对细胞进行热处理。

目的：热处理会诱导涉及DNA修复的酶以及其他细胞成分的生成，这样可以导

致细胞从转化过程的不正常状态恢复过来，提高了转化效率。

4、向上述试管中，加入1mL预热(37℃)的LB培养液，于37°C下，振荡培养(25()

转/min)lho

3.7.5提高转化率要考虑的因素

1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从一70°C

或-2()℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进

入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5a菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5x10’个/mL左右(不同的菌株情况

有所不同)，这时比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。

2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转

化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体

22

3实验操作方法

积过大时，转化效率就会降低。

3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCh等均需是最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯

水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，

如离心管、tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防

止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，

为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

3.8重组质粒DNA分子的平板筛选

3.8.1实验目的

将转化后的大肠杆菌培养液接种于含有氨茉青霉素（Amp）的LB培养基中，培养后

观察培养基上菌落的生长情况，从而判断受体细胞有无成功转入含有目的基因gfp的重

组质粒分子。

3.8.2实验原理

由于本实验所采用的T、P两种质粒上都携带有抗生素（氨芳青霉素）抗性基因Amp「,

我们可以通过Amp抗性来筛选转化子。若将转化的细胞涂布于含有氨茉青霉素的平板

上，则只有那些含有被转化质粒（即带有Ampr的转化子）的大肠杆菌细胞才能够在平

板上生长繁殖。

如果受体细胞没有转入P质粒，那么则不能在含有Amp的培养基上生长。而能够在

含有Amp的培养基上生长的受体细胞（转化子）就可以确定是己经成功导入了P质粒。

3.8.3实验原理

1、仪器

超净工作台、微量移液枪、37°C恒温培养箱、常用玻璃仪器。

2、材料及试剂

转化培养液、LB培养液、氨羊青霉素。

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3.8.4操作步骤

I、制备含有氨年青霉素Amp的LB固体培养基

（1）在超净工作台中，月微量移液枪将Amp加入到装有LB培养液的三角瓶中（每1

mL培养液加入1pL的Ainp）,并轻摇混匀。

（2）将培养液倒入培养皿中，以制备LB平板（10个）。

2、接种

（1）取10pL转化培养液平铺于各个含有Amp的LB培养基上，平板静置10min待

培养液被吸收。

（2）将平板倒置并置于37°C恒温培养箱中培养12〜16h,观察菌落的生长状况。

3.8.5结果分析

我们可以观察到10个含有Amp的LB平板中，每个平板上都均匀地生长着零星的

大肠杆菌菌落，菌落带有淡绿色。这说明转化反应中，成功导入含有Amp「的P质粒的

受体细胞能够在抗氨节的LB培养基上生长，这些受体细胞正是我们要获取的转化子。

但是，由于琼脂平板中缺乏诱导底物IPTG,所以重组子所含有的gfp绿色荧光蛋白

基因不能大量表达，所以我们在自然条件下所看到的菌落只是带有轻微的淡绿色。

3.91PTG存在时，gfp荧光蛋白在大肠杆菌种的诱导表达

3.9.1实验目的

用6互补现象进行重组DNA的鉴定，即将经过氨羊青霉素抗性平板筛选的菌落接种

到加入了诱导底物IPTG的含有Amp的平板上，且同时作一组对照（即接种到不含有

IPTG的Amp平板上），观察菌落的生长情况，包括菌落大小、菌落密度、菌落颜色等

特征。

3.9.2实验原理

基因表达是指基因转录成mRNA后再翻译成蛋白质的过程，生物在生长发育过程中,

遗传信息的展现可以按照一定的时间程序发生改变，而且随着内外环境条件的变化而加

以调整，这就是时序调节和适应调节。

24

3实验操作方法

乳糖操纵子就是适应调节的一种，所谓操纵子即基因表达的协调单位，它们有共同

的控制区和调节系统，操纵子由功能上彼此相关的结构基因、操纵基因和调节基因所组

成。

乳糖操纵子及其诱导表达的模型如下：

启动子调节基因终止子启动子操纵基因结为基因

图3.6乳糖操纵子诱导表达模型-1

当没有诱导物（乳糖或IPTG）存在时，调节基因lac/转录的mRNA翻译产生的阻

遏蛋白与操纵基因lacO结合，阻止了结合在旁边启动子上的RNA聚合酶向前移动，使

结构基因（3-半乳糖糖甘酶基因被插入gfp荧光蛋白基因）不能转录mRNA,也就不能

3.9.5操作示意图

150止菌液

经过Amp抗性筛选

4（X）pL的无菌水

后的重组子菌落

稀

释

10

倍

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图3.8gfp绿色荧光蛋白诱导表达操作不意图

4实验结果分析

4.1结果观察

4.1.1只含有Amp的LB平板

在自然