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文档简介

医学遗传学实验俞萍

pingyu@

88208259

科A713

遗传病基因突变分析（SSCP）实验内容7.5

lPCR产物冰水浴中骤冷10分钟混匀后，100

C沸水中加热变性10分钟加样电泳(140V,~2hr)银染,约50分钟7.5

lloadingbuffer（95%甲酰胺）1.5ml离心管遗传病基因突变分析实验原理1）DNA抽提2）聚合酶链反应3）单链构象多态性分析1）DNA抽提核基因组DNA可以从任何有核细胞中提出Agarosegelelectrophoresis

双蒸水10*BufferMgCl2

dNTPs（ATP/CTP/GTP/TTP）

Primer（引物）R+FDNA模板

Taq-DNA聚合酶石蜡油PCR2）聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的扩增方法.变性：95℃,1min退火：温度和引物有关

延伸：

时间和待扩

增产物长度有关

72℃forTaqStep1(1个循环)94

C5分钟Step2(30个循环)94

C30秒

59

C30秒

72

C30秒

Step3(1个循环)72

C5分钟3）单链构象多态性分析单链构象多态性Trp(色氨酸)→Arg(精氨酸)双甲基丙烯酰胺（methylene-bisacylamide,Bis)单体丙烯酰胺（acrylamide,Acr）TEMED：四甲基乙二胺，加速丙烯酰胺凝胶的聚合

10%APS：（过硫酸胺）催化剂

H2O丙烯酰胺凝胶电泳凝胶组分用于SSCP的药品和试剂：显影液Na2CO32.96g

双蒸水加至100ml,临用时配,夏天4℃冷藏甲醛临用时加54

l10%硫代硫酸钠临用时加10

l10%乙酸10%乙醇1%HNO3AgNO3载样缓冲液（loadingbuffer）

95%甲酰胺

20mMEDTA

溴酚蓝少许二甲苯氰少许垂直板电泳槽示意图

A.电泳槽B.玻璃板C.加样槽D.制胶架

银染：

利用银离子可与核酸结合的特性，在甲醛作用下银离子还原为Ag，使凝胶中DNA条带显黑色。其操作过程如下：①电泳完的聚丙烯酰胺凝胶用10％的酒精浸泡5分钟。②弃酒精，加入1%HNO33分钟，不停摇动。③弃HNO3液，用双蒸水清洗两次。④加入AgNO3染液，染色10-20分钟。⑤用双蒸水清洗一次。⑥加入显影液，至清淅的DNA单链电泳条带出现为止。最好是先显影，弃预显影液后，第二次再加入显影液，显影至

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