分子医学实验 实验二外周血染色体制备学习课件

实验二人类外周血染色体标本制备一、实验目的

熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。初步掌握人类染色体标本制备的基本方法。

在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素（phytohaemagglutinin,PHA），可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。本方法在遗传病的诊断等方面广泛应用。二、实验原理

三、实验步骤

1.采血、接种

2.细胞培养（lymphocytesculture）

RPMI1640培养液(含PHA)，37℃

0.5℃恒温中培养72小时。

3.秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。

4.离心（centrifugation）

以1000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀，并用吸管打匀。

5.低渗处理（hypotonictreatment）加８毫升预温(37℃)的0.075MKCl低渗液（hypotonicsolution），用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。6.预固定（pre-fixation）低渗后，加新配的固定剂（甲醇︰冰醋酸=3︰1）１毫升，用滴管打匀。7.离心

1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。8.固定(fixation)

加入固定液（甲醇︰冰醋酸=3︰1）5ml，将沉淀打匀，固定15分钟。

9.离心

1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。

10.固定：加入固定液（甲醇︰冰醋酸=1︰3），固定15分钟。

11.离心

1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。

12.固定加入固定液（甲醇︰冰醋酸=1︰1）打匀，固定15分钟。13.制片

固定后，1000rpm离心10分钟，留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液在冰水浸泡过的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（airdrying）。切记不要离火太近，以免烤焦玻拨片，影响后面的实验。

14.染色（Giemsastaining）用Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。

15.镜检（microscopicexamination）在显微镜下寻找分裂相，并加以观察和分析。制片方法（冷片）每组制3-4片

四、试剂和药品

1、培养液的配制

RPMI1640培养基（含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠）80％小牛血清（56℃水浴灭活30分钟）20％植物血凝素PHA

4％青霉素100单位/毫升链霉素100单位/毫升用3.5%NaHCO3调pH到7.0-7.2，玻璃滤器抽滤灭菌。在超净工作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基5毫升）。培养基置于-20℃冰箱保存。使用前从冰箱中取出，温育至37℃。

2、肝素（heparin）：浓度0.2％，200毫克肝素粉末溶于100毫升生理盐水中。高压灭菌，冰箱保存备用。

3、秋水仙素：10微克/毫升，作为有丝分裂的阻止剂，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。称10毫克秋水仙素溶于100毫升生理盐水中，配成100微克/毫升的原液，分装小瓶，高压灭菌，-20℃冰箱保存。临用时取上述原液用生理盐水稀释成10微克/毫升。

4、0.075MKCl：0.559克氯化钾溶于100毫升双蒸水中。

5、甲醇（methanol）二者以不同比例配合使用

6、冰醋酸（aceticglacid）新鲜配制

7、吉姆沙染液（Giemsa）吉姆沙由天青、伊红和甲基蓝组成先将0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60℃预热的纯甘油，在研钵中研磨，在60℃水浴中保温90分钟。冷却后，再加入33毫升甲醇，滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。

1份Giemsa原液＋9份磷酸缓冲液

８、磷酸缓冲液（pH

6.8）溶液A：磷酸二氢钾(KH2PO4.2H2O)9.078克溶于1000毫升蒸馏水中。溶液B：磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)11.876克溶于1000毫升蒸馏水中。

100毫升缓冲液：需溶液Ａ50.8毫升，溶液Ｂ49.2毫升。

五、注意事项

1、采血接种培养时，注意加入适量的肝素。

2、培养基中不含L-谷氨酰胺，则溶解有RPMI1640培养基的液体可先用浓盐酸调pH值等于4，然后高压灭菌（注意121℃，15磅，灭菌15分钟）。冷却后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、PHA、灭活小牛血清和双抗。

3、接种的血样愈新鲜愈好，最好在24小时内培养。如果不能立刻培养，应置于4℃冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。

4、温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血中淋巴细胞培养最适温度为37℃

0.5℃，温度过高过低都将影响细胞的生长，但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培养时间。培养液的最适pH7.2-7.4。pH偏酸，细胞发育不良，偏碱细胞会出现轻度固缩。

5、PHA的质量和浓度是培养成败的关键问题。PHA如果保存时间太长，效价会降低，应在培养基中多加一些。

6、培养过程中，如发现血样凝集可轻轻震荡，使凝集块散开，继续培养。

7、最好使用水平式离心机，离心速度不易过高，否则沉降在管底的细胞团不易打散；反之，离心速度太低，细胞会丢失。

8、培养失败的可能原因：

培养瓶等器材洗涤不合要求。