植物生物学实验-二-2根系活力的测定a-萘胺氧化法省公开课金奖全国赛课一等奖微课获奖课件

试验二、根系活力测定

——a-萘胺氧化法

植物生物学试验(二)植物生理学基础与综合试验南京师范大学生命科学学院1/21一、试验目标了解根系活力生理意义；掌握a-萘胺氧化法,测定根系活力原理与方法。掌握分光光度计使用过程和注意事项2/21二、试验原理（一）植物根系生理功效:

吸收：水分、无机盐、CO2。输导固着合成贮藏3/21根系吸收无机盐过程：部位：根尖，根毛区最活跃。步骤1.呼吸释放CO2；2.形成H2CO3；3.H+与HCO3-吸附在根表面。4.溶液中阴阳离子分别与HCO3-、H+交换。5.吸收，进入根内部。6.运输。4/21根系活力即根生长情况和代谢水平。它直接影响植物地上部生长和营养情况以及产量。植物根系中过氧化物酶能氧化α-萘胺，生成红色α-羟基-1-萘胺，并沉淀于根表面，将根系染成红色。普通来说根呼吸强度越大，即该酶活力越强，对α-萘胺氧化力也越强，染色也越深。能够依据根系表面着色深浅，定性观察并判断根系活力大小，也可经过测定溶液中未被氧化α-萘胺量，以定量测定根系活力。（二）根系活力意义与测定方法5/21定性观察根系表面红色越深，说明根系活力越强。6/21定量测定剩下α-萘胺在酸性环境中可与对氨基苯磺酸（sulfanil-amide）和亚硝酸盐作用生成稳定红色偶氮染料。7/21定量测定对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺生成红色偶氮化合物在pH7.0时在510nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定光吸收值，从而利用此反应来间接测定溶液中α-萘胺量。8/21注意：OD510越大→α-萘胺剩下越多→根系活力越弱反应液酸度大则增加重氮化作用速度，但降低偶联作用速度，颜色比较稳定。增加温度能够增加反应速度，但降低重氮盐稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。9/21三、试验材料与仪器设备（一）试验材料水稻(OryzasativaL.)等水生植物须根系。（二）仪器与用具分光光度计、天平、恒温培养箱、三角烧瓶、量筒、移液管、剪刀、玻棒。（三）试剂α-萘胺溶液：先用少许95%酒精溶解，然后加水定容。分别配制50μg/mL、25μg/mL溶液。0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.0。1%对氨基苯磺酸溶液：溶解于30%醋酸溶液中。0.01%亚硝酸钠溶液。10/21四、试验步骤（一）定性观察：处理：挖取处于不一样生长状态须根系植株（如水稻、豌豆苗根系等）数株，洗净根部后再用滤纸吸去根上附着水分。11/212.观察将植株根系浸入盛有25μg/mLα-萘胺溶液并用黑纸包裹容器中，静置24-36小时后观察根系着色情况。比较不一样植株根系活力大小，并与植物生长势比较，分析植物生长势与根系活力之间关系。12/21（二）定量测定取50μg/mLα-萘胺溶液和0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液各25mL，置于三角瓶中，混匀。称取根系2g浸没于三角瓶中溶液中。一样地，取50μg/mLα-萘胺溶液和0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液各25mL，置于另一三角瓶中，混匀，不放根系作为对照。步骤1、试验处理13/21步骤2、试验初始值测定5min后，分别从两瓶中各取2mL溶液，按照步骤4作第一次测定。统计OD（试验组）与OD0（对照组）。14/21步骤3、试验终了值测定将两三角瓶置于25℃恒温箱中避光保温60min后，各取2mL，按照步骤4作第二次测定。统计OD’（试验组）与OD’0（对照组）。15/21步骤4、a-萘胺含量测定取2mL培养液加10mL水混匀，再顺次加入1mL对氨基苯磺酸溶液与1mL亚硝酸钠溶液，混匀，观察溶液颜色改变，再定容至25mL。室温25min后，于510nm处测定吸光度（OD）值。16/21步骤5．标准曲线制作：以50μg/mLα-萘胺溶液为母液，配置40、30、20、10、5、0μg/mL溶液各10mL。各取2mL，按照步骤3分别反应，并测定OD值。以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制α-萘胺溶液标准曲线。或者依据浓度与OD值关系直接计算回归方程。17/216．换算浓度分别查对标准曲线，或利用回归方程直接计算出试验组与对照组溶液试验前后对应α-萘胺浓度（C、C’与C0、C’0）。18/217．计算根系活力依据试验结果计算不一样植株根系对α-萘胺生物氧化强度（mgα-萘胺/gFW·h），并与植物生长势比较，分析它们之间关系。

-萘胺生物氧化强度=48mL×（C-C′）-48mL×（C0-C0′）