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组合生物催化

（CombinatorialBiocatalysis）1/39汇报内容：1.组合生物催化理论基础与特点2.组合生物催化类型3.组合生物催化关键技术4.组合生物催化实例5.结论与展望2/39理论基础：在自然界生物体内，很屡次生代谢物往往是一些小分子初级代谢产物经过由不一样酶参加代谢路径而转化生成。比如，生物碱就是初级代谢产物氨基酸经过生物合成路径产生。受这种现象启发，一个新合成方法逐步发展完善起来，这就是组合生物催化。只不过生物合成路径是在生物体内完成，而组合生物催化是在体外完成。一、组合生物催化理论基础和特点3/39所谓组合生物催化，就是系统地利用生物催化技术对天然产物或合成化合物进行修饰，从而建立起高质量化合物文库，希望能从这些文库中筛选出活性更高或性能更佳新化合物。组合生物催化关键是生物催化，“组合”不过是一个合成策略。4/39组合生物催化和组合化学关系：联络：组合生物催化是酶催化、化学催化和微生物转化在组合化学中应用，即经过对先导化合物转化产生库。二者都是以建立化合物文库为目标。区分：在原理和方法上都有显著区分，组合化学主要经过某种反应进行合成，经常有各种化合物参加反应，而组合生物催化主要经过各种生物催化方法对某种化合物进行衍生，通常情况下先导化合物只有一个。5/39在自然模式下，创造新有机分子所需时间太长，不宜于药品发觉研究。组合生物催化就是要加速这个自然模式，且将其利用于发觉并优化医药和农业化合物中。如图1b所表示，这种方法能够利用天然催化剂(酶或完整细胞)丰富多样性，以及一些生长快速重组和工程酶，对一些有希望药品和农用化合物先导物直接进行衍生化(注意区分组合生物催化和组合物合成，后者是指在活微生物中，经过生物合成路径基因工程方法，从天然产物产生新分子)。图1组合生物合成新生物分子路径(a)从自然界合成子;(b)从细胞外先导化合物6/39组合生物催化特点：●广泛反应可能性;●高区域选择性和立体选择性,能进行位控修饰;●单步反应,防止了保护和脱保护步骤;●自动方便,在温和均匀条件下,重复进行单步反应;●反应条件温和,适宜于复杂、不稳定分子;●活性高,这么催化剂浓度低;●酶催化剂固定化后能够循环利用;●酶能被环境完全降解;7/39

组合生物催化优势主要是经过生物催化剂—酶反应特点来表达。酶最大优点在于它含有高度选择性，这么既能够免去在对一些多官能团先导化合物修饰中繁琐基团保护和去基团保护，又能够保护先导化合物手性特征不至于被破坏，适合普通都要求一定立体结构，而酶法修饰恰好能够满足这方面需求；另外酶反应还含有效率高、收率高和副产物少优点。相比猛烈化学反应，温和酶反应条件对于那些热敏感先导化合物合成也有很大优势。8/39

图2.先导化合物可能进行生物催化转化(L代表先导关键)所表示这些路径全部可能反应一部分,其目标为了说明仅由生物催化所产生一些衍生物(注:X=CI,Br或I;Vin=乙烯基)9/39组合生物催化中常见反应类型：10/39二、组合生物催化类型

在组合合成平台使用生物催化剂一个最大障碍是欲修饰很多底物难溶于水，而大多数酶体系微环境是水，这些酶在有机溶剂中催化活性大大降低，所以能够使酶在水环境中发挥合成功效方法经常使得反应在有机溶剂中无法进行。利用非水介质能够显著地扩大酶体外反应范围。即使酶在有机溶剂中能够保持其活性，不过其催化效率通常比水中要低几个数量级。但最近研究表明，适当地控制酶微环境能够大大提升酶在有机溶剂中活力。1.非水介质中生物催化11/39酶活化技术：1.盐活化法例子：在正已烷中，非缓冲盐对枯草溶菌素催化N-乙酰基-L-苯丙氨酸乙酯和正丙醇转酯化反应影响。详细以下：制备含98%盐生物催化剂时，将酶和KCI一起冷冻干燥，使得枯草溶菌素催化性质Kcat/Km提升了3700倍以上。该技术已被延用到非丝氨酸蛋白酶(包含嗜热菌蛋白酶),取得了类似活化性质。比如,盐活化嗜热菌蛋白酶已被用于紫杉醇2p-酯基衍生物合成。与天然嗜热菌蛋白酶相比，紫杉醇在叔戊醇中酰化活力提升了20倍。盐活化枯草溶菌素也被用于选择性酰化矮茶素、腺苷、3-羟基托烷和双环[2.2.2]辛-5-烯–2,3-二甲醇。这么，盐活化法代表了一个活化酶普遍技术,它使复杂分子能在有机介质中利用酶催化特征进行酰化。12/39

2.表面活性剂即指利用低浓度表面活性剂将酶溶解。即使酶在几乎全部有机溶剂中都不溶解(不过含有一定活力)，表面活性剂存在会形成疏水性离子对，这么使酶溶解在疏水性溶剂中。与悬浮天然酶相比,枯草溶菌素在辛烷中催化活性被提升了四个数量级。离子配正确酶在有机溶剂中溶解性对组合生物催化应用于对连接在固相上底物进行转化反应将尤其有用。13/39

酶反应和生物催化很多特征，使得组合生物催化能够利用到有机小分子以及那些用传统组合技术不轻易进行改变比较复杂天然产物上。图3所表示许多先导分子，包含核苷(如腺苷)、类黄酮(如矮茶素)、生物碱(如3,6-二羟基托烷)、聚酮化合物Polyketides(如红霉素)及萜类和Taxane(如紫杉醇)，被用于那些利用组合生物催化进行药品发觉和优化库生成。这些多样结构例证了怎样利用组合生物催化产生新库。14/39图3.几个已在组合生物催化中用于库生成先导分子例子15/39

酶作为组合生物合成脱保护工具，使得基团特异选择性能够在温和条件下进行，也使其能够应用于最脆弱分子。复合脂肪多肽多步合成中生物催化脱保护这些优势得到表达，青霉素酰化酶应用于高度标识S-软脂酰化寡肽选择性N-脱保护，如图4所表示，随即进行是酶催化除去4-（苯基丙酮）苄氧基羰基保护基团，S-软脂酰化寡肽作为深入合成步骤构建单元，包含偶联另一个单独固相合成寡肽连相同酶脱保护策略成功应用于酸标识和碱标识核酸多肽制备。2.酶作为组合生物合成脱保护工具16/39图4.青霉素乙酰化酶从脂蛋白保护基团上脱除酶标基因17/39在固相表面进行组合合成反应是建立含有丰富差异性化合物库所用最有效方法之一，多聚体-支持物合成后经过使支持物与合成化合物之间连接基团断裂方法而将得到库释放到溶液中去。在过去几年中，许多含有酶稳定性连接子研制成功，从而为把化合物自支持物上释放出来提供了一个可选方案。依据最近分类方法，酶稳定性连接子可被分成两类，即外连接子和内连接子。如图5、6所表示。3.固定化酶催化18/39

两类连接子都包含一个标识基因，它能使靶健被酶所识别，不过它们不一样之处于于健实际断裂方式不一样。内连接形成健被酶直接识别为作用靶点，而外连接健则经过生成中间体再由中间体自发碎裂而释放目标化合物。内、外连接化学反应式见图5、6。19/39在经过标准固相肽合成反应后，肽类内连接子被枯燥杆菌蛋白酶BPN’所断裂而释放出目标肽段。在另一个报道中，合成于可溶性多聚支持物表面低聚糖在胰凝乳蛋白酶作用下，被释放到溶液中，酶作用位点是内连接子上苯丙氨基酸残基标识基团。基于外连接子合成策略已经被证实是一些能被青霉素酰基转移酶、脂肪酶作用小分子。即使酶法裂解已经被成功应用于可溶性及不可溶性多聚体支持物，不过因为相对大酶分子难以进入聚合物串珠样结构内部而使得合成化合物不能完全释放，酶在固相载体上应用仍受到限制。20/39图5.从高分子支持物上酶切内连接子释放合成化合物21/39图6.从高分子支持物上酶切外连接子释放合成化合物22/39酶能够在组合生物催化领域得到成功应用和进展关键在于大量含有广谱底物特异性酶有效性。最近在新酶发觉发面进展得益于重组DNA技术，它提供了大量机会得以取得更多组合生物催化所需工具酶，从而为产生大量理想化合物库提供了条件。23/39三、关键技术1.微生物技术和酶技术组合生物催化关键技术就是生物催化。生物催化是指利用生物体系或其产生酶体系对外源性化合物进行结构修饰生物化学过程。用于组合生物催化生物体系最多一个是微生物体系，包含微生物采集、分离、培养、判定、保留等关键技术。因为有些催化反应要在非水介质中进行，而微生物又难于在其中生长，所以对于这些反应需用纯化酶进行催化。酶起源：1.购置；2.发酵，分离纯化。为了提升酶在非水介质中活力，需要对酶进行固定化处理。24/392.化合物快速分析判定因为组合生物催化目标在于建立化合物文库，所以产物数量较大，常规分析判定方法不能满足需要。在组合生物催化中使用快速分析判定方法有高通量质谱分析（一个样品/min）、用于在线判定高效液相色谱--质谱联用技术等。另外，新分析判定技术开发和应用，如液相色谱—核磁共振联用技术必定会促进组合生物催化发展。当然，要依据产物结构不一样来选择详细方法。25/393.高通量药品筛选

高通量筛选(Highthroughputscreening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平试验方法为基础，以微板形式作为试验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速检测仪器采集试验结果数据，以计算机对试验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以对应数据库支持整体系运转技术体系。26/39四、组合生物催化实例

Adamczyk等人曾报道,利用脂酶(尤其是洋葱假单胞菌Pseudomonascepacia脂酶)来产生一个酰胺库。以芳香二酯，二苄基-1,2-苯二氧二醋酸酯为关键物,以单-(N-叔丁氧羰基)二胺作为二酯反应伴体。该二酯和五个单-(N-叔丁氧羰基)二胺混合物反应生产一个26个不一样产物库,包含15个双酰胺,5个单酰胺单酯和五种较少许单酸产物。此例说明洋葱假单胞菌Pseudomonascepa2cia脂酶含有将苄酯转变成酰胺广泛专一性,这么完成了一个双酰胺库组合合成。1.

从聚苄酯取得酰胺库27/392.自动合成矮茶素库

利用广泛生物催化反应对类黄酮矮茶素进行衍生化，能够自动、重复地合成得到一个含600个衍生物库。利用一个多探头液控自动仪在96-槽平板中对候选生物催化剂进行初始筛选,发觉有16个纯化酶和25个微生物能够接收矮茶素为底物。利用这些酶来改变矮茶素，所得衍生物即产生了一个多样化库(图4)。28/39图7.经过组合生物催化自动生成矮茶素衍生物过程29/39可对矮茶素进行反应包含:在该先导分子中引入新官能团(如羟化和卤化),改变现有官能团(如氧化和还原),以及在现有官能团上增加新基团(如酰化、糖基化和磷酸化)等等。反应中生成每种衍生物可用高通量质谱或先选择性地衍生化后再用13C核磁共振谱进行证实。所产生库能够针对包含黄嘌呤氧化酶(治疗痛风和各种硬化症潜在标耙)和尿激酶(一个抗癌标耙)在内一些标耙进行生物活性筛选。在起初筛选中，发觉了对这些标耙抑制作用比矮茶素高两个数量级新抑制剂，然后又对其最有效衍生物进行再合成和确证。30/393.医药化合物生物催化合成

肽环化作用：几乎全部非核糖体多肽合成酶（NRPS）都含有环化作用，这是终端硫酯酶(TE)结构域起作用，线性肽区域选择环化是那些含有药用作用化合物必不可少，不过极难经过化学方法来合成。伴随各种TE结构域发觉及其作用机理研究，发觉能够利用带有TE结构域NRPS经过生物合成路径大量生产环肽，或利用一些分离出来TE结构域对化学合成多肽底物进行环化，以取得所需环肽。所以，终端硫酯酶(TE)已经被作为一个独立含有环化作用生物催化剂。许多环形肽利用NRPS已经从固相多肽合成中得到。31/39Figure8.StandaloneTycTEdomaincatalyzesthechemoenzymaticsynthesisofcyclicpeptidesfromthelinearprecursors.32/39先在PEGA树脂上固相合成300各种线性短杆菌酪肽抗生素衍生物，然后将这些含有线性肽树脂与重组表示TycTE蛋白（环化酶）一起温育，经过环化酶在树脂上催化环化反应，高效地释放出环肽，从而建立了短杆菌酪肽环肽文库。他们从环肽文库中筛选到对细菌细胞膜选择性提升30倍短杆菌酪肽环肽，该环肽价值在于能大大降低短杆菌酪肽引发溶血副作用。最终他们依据该环肽结构，构建基因工程NRPS，经过发酵来大规模生产该环肽。33/39酰基化作用：

酰基转移酶是一类合整天然产物主要酶类之一，含有底物特异性，它在合成紫杉醇、柔红霉素、洛伐他汀中含有选择性催化作用。辛伐他汀是一个主要降低血液中胆固醇含量药品。辛伐他汀是洛伐他汀半合成衍生物（图9），而洛伐他汀可由土曲霉代谢产物分离取得。传统辛伐他汀生产工艺是以洛伐他汀为原料，经化学合成得到。伴随当代生物学发展，辛伐他汀生物合成受到越来越多重视。34/39Figure9.LovDcatalyzesthesynthesisofsimvastatinacidfrommonacolinJacidandtheacyldonorDMB-SMMP35/39

糖基化作用：

许多主要天然产物经过糖基转移酶而得到修饰，糖基化修饰对那些天