1.2.1 微生物的基本培养技术课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第1章

发酵工程微生物的培养技术及应用传统发酵技术以混合菌种进行发酵制作食品，并且利用的菌种很多是原材料中天然存在的微生物。

向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。实验室培养微生物的条件:提供微生物合适的营养和环境条件；要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。本章提及的微生物主要是指用于发酵的细菌和真菌。一、培养基的配制1.培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。2.培养基种类：（按照物理状态划分）固体培养基液体培养基加凝固剂如：琼脂琼脂仅作为凝固剂，不为微生物生长提供物质和能量。工业化大规模生产以及培养对象的扩大化培养微生物的分离与鉴定、活菌计数、菌种保存一、培养基的配制2.培养基种类：（按照功能划分）选择培养基鉴别培养基微生物在琼脂固体培养基的表面或内部生长，形成肉眼可见的菌落。一、培养基的配制组分含量提供的主要营养物质牛肉膏5g碳源、氮源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g碳源、氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000mL水▼1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养结构称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15~20g琼脂，用蒸馏水定容至1000mL。▼

马铃薯琼脂培养基的配方注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。100g马铃薯中含有：水75-80g，蛋白质约2g，碳水化合物17-20g、

维生素、无机盐等上述两种培养基的营养构成有哪些相同点？又有哪些不同？都含有水、碳源、氮源、无机盐和维生素等，其中马铃薯琼脂培养基中主要由糖类提供碳源，蛋白质提供氮源；牛肉膏蛋白胨培养基中主要由牛肉膏提供碳源，主要由蛋白胨提供氮源。一、培养基的配制3.培养基的营养构成：各种培养基的配方不同，但一般都含有水、无机盐、碳源和氮源等营养物质。碳源氮源水无机盐无机碳源--CO2、CO32-、HCO3-有机碳源--葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物无机氮源--N2、NH4＋、NO3-、NH3等（有机碳既是碳源又是异养微生物的能源物质。）有机氮源--蛋白胨、尿素、氨基酸等含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。--微生物生长和代谢必不可少的营养物质。--提供无机营养、调节酸碱平衡、

维持渗透压。一、培养基的配制（1）为什么培养基需要氮源？思考：氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。（2）培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？不一定。例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中的氮气。微生物碳源氮源能源蓝细菌CO2NH4＋、NO3-等光能硝化细菌CO2NH3NH3的氧化根瘤菌糖类等有机物N2有机物大肠杆菌糖类、蛋白质等有机物蛋白质等有机物自养微生物异养微生物一、培养基的配制培养基的其他需求：微生物对pH、特殊营养物质、O2的需求微生物生长所必须的、微量的、自身不能合成或合成很少的有机物，如维生素、氨基酸、碱基等。培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时，需要将培养基调至酸性；培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性；培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。具体处理原理目的选择培养基加入青霉素青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用不加氮源固氮微生物能利用空气中的氮气不加有机碳源自养型微生物能利用无机碳源鉴别培养基加入酚红培养基尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。加入刚果红刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离自养微生物鉴别分解尿素的细菌鉴别纤维素分解菌

对培养基的成分进行控制可以起到不同的作用：微生物种类繁多，培养条件也各不相同。下列关于微生物培养基的描述正确的是(

)A．同一物质不可能既作碳源又作氮源B．凡是碳源都能提供能量，氮源有些也能提供能量C．牛肉膏蛋白胨培养基是培养细菌、病毒等常用的培养基D．培养硝化细菌，可用无机碳源的培养基D该表为某培养基的配方，下列叙述错误的是()成分NaNO3KH2PO4MgSO4·7H2O(CH2O)蒸馏水青霉素含量3g1g0.5g30g定容至1000mL0.1万单位A．根据物理性质划分，该培养基属于液体培养基B．根据用途划分，该培养基属于选择培养基C．根据培养基的配方可知，该培养基培养的微生物的同化作用类型是异养型D．固体培养基中加入少量水即可形成液体培养基D（多选）下列四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，正确的是()硝化细菌乳酸菌酵母菌衣藻能源氧化NH3分解乳酸固定N2利用光能碳源CO2糖类糖类CO2氮源NH3N2N2NO3-代谢类型自养需氧型异养需氧型异养需氧型自养需氧型ADA.硝化细菌B.乳酸菌C.酵母菌D.衣藻下图所示为某微生物培养基的配方，请据此分析回答问题：成分NaNO3K2HPO4FeSO4H20琼脂青霉素含量3g1g0.01g定容至100ml15g0.1万单位（1）该培养基可用于观察微生物的菌落特点，是因为培养加中添加有_______。（2）此表中含有的微生物所需的营养成分是___________________。从培养基的营养成分看，此培养基可用于培养的微生物的同化作用类型为_____________。利用该培养基培养微生物时，微生物所需的碳源来自________________。（3）该培养基________（填“能”或“不能”）用于培养细菌，原因是________________________________________________。（4）去掉NaNO3后以及青霉素后，该培养基________（填“能”或“不能”）用于培养硝化细菌。硝化细菌利用的氮源为__________。（5）若去除NaNO3后不再加入含氮元素的有机物，则此培养基可培养的微生物种类是_______________________。琼脂氮源、水、无机盐自养型空气中的CO2不能青霉素为抗生素，会杀死细菌，筛选出真菌。不能NH3自生固氮微生物二、无菌技术

获得纯净微生物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌污染展开，主要包括消毒和灭菌。指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。1.消毒：方法适用范围操作方法煮沸消毒法巴氏消毒法化学药物消毒法紫外线消毒法某些实验器具、家庭餐具等在100℃下煮沸5~6min不耐高温的液体，如牛奶等62~65℃下煮30min或80~90℃处理30s~1min用于皮肤、伤口、动植物组织表面等利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。用（70%）酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等接种室、接种箱，超净工作台等可用30W紫外灯照射30min二、无菌技术2.灭菌：指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体。当环境适宜时，芽孢可以形成一个细菌。芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞，能直接长成新个体。二、无菌技术常用的灭菌方法：（1）湿热灭菌利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌。

其中高压蒸汽灭菌的效果最好。实验室常用的高压蒸汽灭菌锅，就是以水蒸气为介质在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，维持15~30min来对培养基进行灭菌的。

高压蒸汽灭菌锅适用范围：培养基及多种器材等二、无菌技术常用的灭菌方法：（2）干热灭菌

干热灭菌箱内，在160-170℃的热空气中维持下2-3h达到灭菌目的。适用范围：耐高温，需保持干燥的物品干热灭菌箱玻璃器皿（如试管、培养皿、吸管、注射器）金属器具

（如针头、镊子、剪刀等）二、无菌技术常用的灭菌方法：（3）灼烧灭菌

直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。适用范围：接种工具如涂布器、接种环、接种针以及试管口或瓶口等容易被污染的部位。123接种环的灼烧灭菌（1、2、3表示先后顺序）涂布器接种环和接种针消毒与灭菌对比比较项目消毒灭菌概念使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子作用强度作用程度芽孢和孢子适用对象常用方法较为温和的理化因素强烈的物理、化学因素杀死物体表面或内部的部分微生物杀死物体内外所有的微生物消灭部分芽孢能杀灭全部芽孢和孢子操作空间、活体生物材料、操作者的衣着和双手操作工具、玻璃器皿、培养基等煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法湿热灭菌法、灼烧灭菌法、干热灭菌法思考：1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？还能有效避免操作者自身被微生物感染。2.为什么体积分数为70%～75%的酒精杀菌效果最好？若酒精浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；若酒精浓度过低，杀菌能力减弱。3.避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触。为了避免周围环境微生物污染应在哪里进行后续操作？在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。以下物品所采用的灭菌或消毒方法依次是：培养基：_____________培养皿：_____________接种环：_____________实验操作者的双手：________________实验室：_____________牛奶：_____________

高压蒸汽灭菌干热灭菌灼烧灭菌化学药物消毒法紫外线消毒法巴氏消毒法关于消毒、灭菌的方法，下列描述错误的是（

）A.接种用的无菌操作台要进行灭菌处理B.用巴氏消毒法处理牛奶是因为高温易破坏牛奶的营养成分C.煮沸半小时后的凉开水中可能仍含有部分芽孢和孢子D.先喷洒消毒液，再用紫外线照射可增强消毒效果B生产、生活和科研实验中常用到无菌技术。下列相关叙述不正确的是()A.腌制泡菜时，泡菜坛内缺氧、呈酸性的环境不利于杂菌生长B.实验室中的玻璃涂布器、吸管、培养基等均可以用干热灭菌法处理C.生活中用巴氏消毒法处理牛奶既可消毒，又基本不会破坏牛奶中的营养成分D.湿热灭菌是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法B三、微生物的纯培养1、相关概念（1）培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体。（2）纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。（3）纯培养：获得纯培养物的过程。2、纯培养的步骤：配制培养基灭菌接种分离培养酵母菌的纯培养1.实验原理：微生物群分散或稀释单个细胞繁殖单个菌落菌落是指分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。酵母菌菌落大肠杆菌菌落金黄色葡萄球菌菌落青霉菌菌落菌落大小、形状、隆起程度、颜色等是鉴定菌种的重要依据。获得单菌落的方法：平板划线法和稀释涂布平板法酵母菌的纯培养2.材料用具：酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。酵母菌培养液提供接种用的酵母菌配制酵母菌固体培养基马铃薯葡萄糖（或蔗糖）蒸馏水琼脂酵母菌的纯培养3.实验步骤：①

制备培养基：

配制培养基→灭菌→倒平板称取去皮的马铃薯200g切成小块加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂用纱布过滤得到滤液滤液中加入20g葡萄糖，15~20g琼脂用蒸馏水定容至1000mL酵母菌的纯培养3.实验步骤：①

制备培养基：

配制培养基→灭菌→倒平板取5~8套培养皿培养皿叠成一束用几层牛皮纸包紧放入干热灭菌箱内，160~170℃灭菌2h将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞包上牛皮纸，并用皮筋勒紧压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min酵母菌的纯培养3.实验步骤：①

制备培养基：

配制培养基→灭菌→倒平板拔出锥形瓶的棉塞。12将瓶口迅速通过火焰。3用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。4等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。待培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。酵母菌的纯培养3.实验步骤：①

制备培养基：

配制培养基→灭菌→倒平板思考：(1)培养基PH要适宜，调PH是在灭菌前还是灭菌后？如果需要调节培养基的PH，应该在定容完成后，灭菌之前进行操作。计算称量溶化定容调PH灭菌倒平板(2)在灭菌前，用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用。(3)培养基灭菌后需要冷却到50℃左右时才能倒平板，为什么？用什么办法来估计培养基的温度？琼脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固。高于50℃会烫手，温度过低琼脂会凝固。用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手时即可。酵母菌的纯培养3.实验步骤：①

制备培养基：

配制培养基→灭菌→倒平板思考：(4)倒平板时，为什么将锥形瓶瓶口迅速通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？不可以，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，从而污染培养基。(6)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？既可以避免培养基中的水分过快蒸发，保持培养基的水分；又可防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。如果未接种的培养基在恒温箱中保温1-2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。(7)如何判断所倒平板是否被杂菌污染？酵母菌的纯培养3.实验步骤：②

接种和分离酵母菌接种是指通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后，可以（在培养后）分离得到单菌落。--平板划线法平板划线法接种酵母菌的纯培养3.实验步骤：②

接种和分离酵母菌5将试管口通过火焰，并塞上棉塞。6在火焰旁打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划3~5条平行线，盖上皿盖。7灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。12在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的棉塞。3试管口通过火焰。4在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。酵母菌的纯培养3.实验步骤：②

接种和分离酵母菌平板划线法的注意事项：12345接种环灭菌第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同

位置连续划线多次。划线首尾不能相接。每次划线前后灼烧接种环进行灭菌。划线操作结束后，仍需灼烧接种环。划线后，培养皿倒置培养。酵母菌的纯培养3.实验步骤：②

接种和分离酵母菌思考：(1)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环，为什么？灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。杀死接种环上原有微生物，防止杂菌污染。杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。酵母菌的纯培养3.实验步骤：②

接种和分离酵母菌思考：划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。(3)为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？(2)在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是？最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细胞的数目，达不到纯化的效果。3.实验步骤：②

接种和分离酵母菌酵母菌的纯培养(4)在观察时发现第一区有菌落生长，而第二区域无菌落生长，可能是哪个操作失误造成的？思考：接种环灼烧后未冷却直接进行划线；划线未从第一区域的划线末端开始。(5)平板划线时不能划破培养基的原因？一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。3.实验步骤：③

培养酵母菌酵母菌的纯培养

完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24-48h。为什么要同时放入未接种的平板？作对照，通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。警示酵母菌的纯培养4.实验结果分析：在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是：菌液不纯，混入其他杂菌；或在实验操作过程中被杂菌污染。酵母菌的纯培养有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水，密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。水果“酵素”是什么？其制作原理是什么？其中可能含有哪些成分？其是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？其中的所有成分都有益于人体健康吗？酶的另一种说法。其制作是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。其中可能有糖类（包括一些简单的糖和膳食纤维等）、蛋白质（包括多种酶）、有机酸等成分。不存在它独有的、特殊的营养物质。其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。以下关于倒平板的操作，错误的是(

)A．在火焰旁取下装有培养基的瓶塞B．倒平板前，让锥形瓶的瓶口迅速通过火焰C．倒平板时将培养皿的盖拿开，以方便将锥形瓶中的培养基倒入培养皿D．平板冷却凝固后要倒过来放置C如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是(

)A．①步骤使用的培养基是已经调节过pH并灭菌的培养基B．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行C．③到④的过程中，接种环共灼烧了5次D．④步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连C在分离、纯化细菌的实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如下图，a、b、c、d是划线的四个区域。下列叙述错误的是（

）A.每次划线前后都要对接种环灼烧灭菌B.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落C.甲图中的a区域为划线的起始区域D.蘸取菌液和划线要