肺癌分子病理诊断进展

非小细胞肺癌分子病理检测引言

肺癌仍是最常见恶性肿瘤；肺恶性肿瘤95％NSCLC(75-80%)VS

小细胞癌鳞癌（44/25％），腺癌（28/42％），小细胞癌20/13％，大细胞癌9/2%影像诊断技术的进步：癌前病变、早期肺癌病例明显增多临床治疗对诊断要求提高，推动了病理的进展诊断技术差异VS病因改变？一、肺癌病理分类：分子病理类型小细胞癌（%）腺癌（%）鳞癌（%）突变BRAF0<50EGFR高加索人群

亚洲人群<1<510-2035-45<1<5ERBB2/HER20<50KRAS高加索人群

亚洲人群<1<115-355-10<5<5PIK3CA<5<55-15RB>905-155-15TP53>9030-4050-80扩增EGFR<15-1010ERBB2/HER2<1<5<1MET<1<5<5MYC20-305-105-10FGFR1<1<515-25基因重排ALK05<1RET01-20ROS101-20NTRK10<10NRG10<10肺癌中的主要基因改变（2015WHO分类）国际各大指南（CAP/IASLC/AMP、NCCN、ATLAS、ESMO指南）均给予晚期NSCLC分子病理诊断与组织病理同等重要的地位含腺癌成分必须检测EGFR&ALK鳞癌小标本推荐检测EGFR&ALK（东）亚洲血统女性不吸烟者腺癌伴贴壁生长特征、乳头型、微乳头型TTF-1阳性往往伴有EGFR突变起源于II型肺泡上皮细胞、Clara细胞、非纤毛支气管上皮EGFR突变肺腺癌Curvesforexon21usingtheARMSmethod.Curvesforexon19usingtheARMSmethod15–basepairdeletionatexon19K-ras突变肺腺癌西方（高加索人-30%）吸烟者,东亚病人:-10%;浸润性黏液腺癌（黏液型BAC）、肺癌伴杯状细胞特征、实体型腺癌；与EGFR突变、EML4-ALK相互排他；EGFR-TKIs抵抗。（东）亚洲血统年轻病人不/轻度吸烟者腺癌伴印戒细胞特征最多见、实体型较常见，各种类型均有报道与EGFR突变、K-RAS相互排他起源：比EGFR突变肺癌更大、更近端的细支气管。EML4-ALK肺腺癌ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征特征EGFR突变EML4/ALK组织学腺癌TTF1+腺癌TTF1+亚型非粘液型粘液型吸烟状态不吸烟不吸烟人种东亚所有人种发病年龄66岁52岁性别女性无差异ShawAT,etal.JClin

Oncol2009;27:4247-4253.ALK阳性NSCLC年龄50岁左右偏年轻中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期中华结核呼吸科杂志2014年3月第27卷第3期ALK阳性非小细胞肺癌已成为NSCLC特定的亚型不同的驱动基因不同的治疗方法不同的临床&病理特征AT.Shaw,etal.JClin

Oncol,2009不同的患者预后ALK阳性NSCLC定义ALK阳性非小细胞肺癌：是指包括ALKFISH检测阳性、ALK序列融合变异或ALK融合蛋白表达阳性的肺癌，肿瘤细胞中存在ALK融合基因表达，是非小细胞肺癌的一个分子亚型，常见于腺癌，该类患者通常可从ALK抑制剂治疗中获益。张绪超等.中华病理学杂志2013;42(6):402-406.ALK阳性NSCLC的诊断-三大指南推荐适宜人群诊断方法中国EGFR与ALK阳性NSCLC诊断及治疗指南（2014）所有含腺癌成分的NSCLCFISH,经权威机构批准的IHC与RT-PCR，其余IHC可做为筛选CSCO中国专家共识所有含腺癌成分的NSCLC，富集人群可优先检测FISH,VentanaIHC,RT-PCR,常规IHC可做初筛晚期非小细胞肺癌分子靶向治疗专家共识所有含腺癌成分的NSCLCFISH,RT-PCR，VentanaIHC中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期中华结核呼吸杂志2014年3月第37卷第3期2015NCCNV1:小标本的鳞癌也需检测EGFR&ALKNSCLC活检组织标本阴性或未知；据组织类型选择合适技术§新鲜标本VentanaIHC常规IHC检测*

阳性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者石蜡标本3+/2+/1+阴性ALK阳性非小细胞肺癌EGFR突变检测中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期VentanaALK(D5F3)的CFDA注册临床实验

三家公立医院超过1100例NSCLC样本进行VentanaALK(D5F3)与FISHALK结果的对比验证实验结果表明VentanaALK(D5F3)与FISHALK的一致性为99.23%ParallelFISHandImmunohistochemicalStudiesofALKStatusin3244Non–Small-CellLungCancersRevealMajorDiscordancesLargestseriesthusfarofparallelFISHandIHCALKtestingin3244consecutiveNSCLCcasesanalyzedattwoindependentFrenchcenters.FISH-positiveand/orIHC-positiveresultsweredemonstratedin150of3244cases(4.6%).Strikingly,only80of150specimenswereclassifiedasALKpositivebybothtechniques.Thus,asingleFISHorIHCanalysisperformedalonewouldhavefailedtodetectapproximatelyone-fourthoftheALK-positivecasesJThorac

Oncol.2014;9:295–306VentanaIHC试剂盒已于2013.8全部获得CFDA批准，用于检测ALK阳性NSCLCALK阳性NSCLC诊断方法比较FISH：昂贵的金标准PCR：结果详细(ForALKonly)FISH(AbbottVysis)IHC(Ventana/RTD)IHC(手动/CST)PCR（Amoy）SFDA批准时间2014年10月28日2013年8月8日/2013年3月26日可检测融合类型所有融合类型，但不能区分所有融合类型，但不能区分所有融合类型，但不能区分已知的多数融合类型操作要求高，需经培训且有经验医师判读简便简便简便所需组织量厚度3-5μm的石蜡切片，1张厚度3-5μm的石蜡切片，2张厚度3-5μm的石蜡切片，1张0.1-0.5μgRNA蜡块4-5片胸水，新鲜组织优点特异性高操作简便、价格便宜、可直接诊断操作简便、价格便宜、可筛选操作简便、敏感性高价格高低低高Ventana：最具性价比的标准*依照规范化流程处理的FFPE样本，其RNA质量已完全满足实时RT-PCR的检测要求中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期肺鳞癌分子靶点检测FGFR1：FGFR酪氨酸激酶家族，有扩增预后差，复发和死亡的显著独立预后影响因子；最有希望的针对性靶向药物PI3KCA突变对抑制剂疗效有预测价值EGFR扩增和EGFRVIII突变：预后差，但TKI疗效不相关大细胞癌（2015WHO）大细胞癌大细胞NE癌（归入神经内分泌肿瘤）复合型（伴鳞癌/腺癌等，单独分类）基底样癌（归入鳞癌）淋巴上皮样癌（单独分类）透明细胞癌（保留但不做为独立亚型）大细胞癌伴横纹肌样表型（保留但不做为独立亚型）免疫表型分型ModernPathology,2013,26:511-522102例TTF1+/△Np63-：LCC-ADC（LCC伴腺癌表型）TTF1-/△Np63+：LCC-SQCC（LCC伴鳞癌表型）TTF1-/△Np63-：LCC-null（LCC-无任何免疫表型）TTF1+/△Np63+LCC-AD-SQC（LCC伴腺癌和鳞癌表型）

不同免疫亚型大细胞癌的生存分析ModernPathology,2013,26:511-522生存期：LCC-AC＞LCC-SQCC＞LCC-null分子遗传学改变

EGFRKRASALKBRAFMAP2K1/MEK1ModernPathology,2013,26:511-522不同免疫亚型大细胞癌的总体基因突变分布情况二、肺癌分子病理检测技术肿瘤靶向治疗中分子靶点检测方法免疫组织化学（IHC）－蛋白表达荧光原位杂交(FISH)、SISH、CISH

－基因扩增、融合/易位基因突变检测（DNA测序、荧光实时定量PCR、焦硫酸测序、ARMS突变、SSCP、高效变性液相色谱、基因芯片……）－有无基因突变、突变类型及位置新方法敏感性高，短时间内进行大样本筛选最终结果仍需直接测序法验证。绝大部分实验室都已经接受直接测序法是最可靠的评估方法，是判断突变的“金标准”SuggestedalgorithmformoleculartestingforpatientswithNSCLCAD基因突变检测流程肿瘤标本采集标本处理及评估突变检测患者临床医生胸外科医师内镜医师收集肺癌组织标本病理科医生准备样本实验操作及结果分析实验室人员报告结果给临床医生肿瘤科医生放疗科医生呼吸科医生胸外科医师WHO2015肺癌病理分类重视活检和细胞学分子病理诊断70％肺癌病理诊断（多为晚期病人）活检和细胞学组织不仅仅用于常规诊断、免疫组化，还要进行分子靶点的检测NSCLC患者EGFR检测送检率低

全国2013年EGFR送检率为20%，远低于欧洲以及日本，台湾的送检率，一方面，中心城市的送检率还有待提高，另一方面，目前已有的70家检测平台，超过80%集中在省会城市，周边城市因平台缺乏导致了送检率低2010AZ

JapanSurveyresult(N=587physicians)检测标本类型的选择有待改进日本检测标本的选择中国检测标本的选择

众多晚期NSCLC病人无法获取组织标本，细胞学标本是一个很好的补充，但是细胞学标本可以用于检测的观念尚未被大范围的认可。致使许多病人失去检测的机会。DataformAstraZenecaChinainternal肿瘤组织标本

细胞学标本血液标本尿液、唾液标本

NSCLC驱动基因检测标本类型高肿瘤含量胸水携带丰富的肿瘤信息胸水进行肺腺癌组织学类型诊断在胸水中进行ALK融合状态检测根据胸水检测ALK蛋白表达与临床治疗关系No.aAgeSexIHC-ALKFISH-ALKResponseECOGPSTherapyMonths DiscontinuationofcrizotinibP547M++PD1First-line2YesP882M++CR1First-line10NoP966F+

SD1First-line3YesP1360F++PR1First-line13NoP1652M++PR0Second-line13NoP2045M+

SD1First-line16NoP2150M++SD1Third-line6NoP2251F++SD3First-line4NoP2421F++PR3First-line2NoP2648F++CR1First-line6NoP2731F++PR1First-line1No客观缓解率（ORR）：54.5%(6/11)

疾病控制率（DCR）：90.9%(10/11)在病理诊断方面，细胞学标本制作细胞学蜡块后，通过免疫组化染色，能够实现准确的病理诊断，可以成为组织学标本良好的替代品；在病理质控及采用正确前期处理方法的前提下，所有基因、且一种基因蛋白水平、DNA、RNA改变的分子检测均可在细胞学标本上进行，突变率与组织学检查突变率相当；疗效随访结果证实，与根据组织学标本所获的疗效一致。细胞学标本替代组织学标本总结如何加快分子病理检查报告速度？与临床医师沟通，及时进行EGFR突变检测；常规HE切片时，预留标本石蜡卷备用。一旦HE观察确认为肺腺癌，同步进行免疫组化和突变检测；RealtiemPCR检测速度快于DNA测序。各种商业化的生物公司、独立实验室检验科病理科谁来进行肿瘤分子靶点检测？肺癌分子靶向指标检测由于肺癌异质性，取材方法不同，区域不同，标本处理方法不同导致不同的结果肺癌病理分类：异质性50%肺癌含二种或几种组织类型！不同切片、不同视野癌的类型有所不同常见类型：腺癌/鳞癌；梭形细胞/多形性癌腺癌/鳞癌/小细胞癌病理质量控制的流程组织处理、蜡块和H&E染色切片制作病理质量控制质量达标

基因突变检测质量不达标终止基因突变检测组织标本接收

蜡块未染色切片H&E染色切片去除标记以外的区域MagerSR,etal.EurJCancer2007;43(5):828-834.病理科建立分子检测平台的三种模式：病理科分子病理实验室进行检测并与病理形态结合审核、签发报告部分检测项目外包大型的病理科实验室、规范的独立实验室或商业实验室病理标本处理后分子检测外包获得检测数据后分析并与病理形态结合审核、签发报告二、肺癌分子病理检测技术：

二代测序高通量二代测序技术（NGS）相对于传统的Sanger测序而言高通量测序以其高数据输出量与高解析度的特性，同时检测多个基因的突变，融合和拷贝数变化情况，而且使得检测的费用和时间大大缩短。二代测序的优势小细胞癌（%）腺癌（%）鳞癌（%）突变BRAF0<50EGFR高加索人群

亚洲人群<1<510-2035-45<1<5ERBB2/HER20<50KRAS高加索人群

亚洲人群<1<115-355-10<5<5PIK3CA<5<55-15RB>905-155-15TP53>9030-4050-80扩增EGFR<15-1010ERBB2/HER2<1<5<1MET<1<5<5MYC20-305-105-10FGFR1<1<515-25基因重排ALK05<1RET01-20ROS101-20NTRK10<10NRG10<10肺癌中的主要基因改变（2015WHO分类）60Newmanetal.,NatMed(2014)覆盖96%NSCLC病人平均4个突变/病人敏感性特异性StageI(n=4)50%96%StageII-IV(n=9)100%96%Allstage(n=13)85%96%(Formutantallelefractions>0.02%)血液EGFR基因突变检测发展与展望：二代测序方法优点：拓展了基因突变检测的深度和广度局限性：其临床转化应用需要更多的数据积累。非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测的中国专家共识NCCNVersion3.2014:moleculardiagnosis首次革命性推荐多重测序/二代测序用于诊断精准诊断的陷阱精准诊断的陷阱Driver基因突变

VSPassenger？体细胞突变≠驱动基因突变驱动基因突变≠药物靶点基因同样基因不同突变类型≠相同的药物疗效测序深度VS测序方法新测序技术将DNA切成更短的片段，短片断重新组装在技术上更具挑战性，检测基因组中拥有大块重复序列的区域更加困难；海量数据的解读？质控标准？如何验证？目前无获批的产品，鱼目混珠！同一基因改变在不同肿瘤中的价值：不同的诊断、预后、治疗价值NGS临床检测的现状关于NGS检测样本的质控还没有明确的规范，数据的解析等一些列问题还没有明确的规范国内也没有一款获批的基于NGS的肿瘤生物标志物检测试剂盒NGS的收费还比较高二、肺癌分子病理检测技术：

液体活检作为金标准的组织靶基因检测亦存局限

肿瘤内异质性

EGFRMu/WildEGFRMu/T790MEGFRMu/C-METEGFRMu/KRAS

重复活检和

动态检测困难

部分患者无组织标本

或无足够的组织标本

进行基因分型Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2013分子标志物血液检测两大研究方向血浆/血清游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）循环血肿瘤细胞（circulatingtumourcell，CTC）血液检测在肿瘤治疗中的应用NatureReviews472-484Vol.10August2013Nature524Vol.511July2014外周血循环肿瘤DNA可用于血液基因突变检测肿瘤患者血液中的游离DNA的含量比正常人高其遗传学特性与肿瘤基因组DNA相似ctDNA已从不同癌种的ctDNA中检测到多种基因变异血液EGFR检测与组织一致性的荟萃研究XiaoZhaoetal.Respiration2013.血液EGFR检测与组织显示较好的一致性比较血清和组织标本EGFR突变状况（86例，ITT）IFUMctDNA研究与IPASS研究日本亚组(血清DNA)分析结论一致试剂盒：DxSEGFRMutationTestKitforResearchUseOnly(DxS,Manchester,UK),whichcombinesARMSwiththeScorpionsreal-timePCRtechnology.b:2种标本EGFR突变状况已知GotoK.etal.JThoracOncol2012;7(1):115-121

中国样本量最大的研究Bai,etal.JClinOncol.2009Jun1;27(16):2653-9.敏感性为82%;特异性为92%，血浆、组织检测的一致性87%

TumorCasenumberEGFR+EGFR-plasmaEGFR+631679EGFR-14137151Casenumber77153230VariableNo.ofpatients

(N=230)%Age,yearsmean60.7standarddeviation4.5Sexmale12353.5female10746.5Smokinghistorysmoker10344.8neversmoker12755.2HistologictypeADC17174.3SCC5523.9LCC418DiseasestageIIIB8034.8IV15065.2Therapychemotherapy230100gefitinib10244.3检测方法：

High-PerformanceLiquidChromatography多项研究证明携带血液EGFR突变患者临床获益显著KunNieetal.TumorBiol2014.VSVSPFSOSEGFR-TKI治疗后获得性耐药在临床PD前中位2个月时即可在血浆ctDNA中检测到T790M(范围：1.5-3.5个月）血液EGFR的耐药突变可被提前发现

ZhengDetal.ASCO2014.Author|00MonthYearSetareadescriptor|Sublevel1Plasma(ARMS)Tumortissue

(ARMS)Total+-+24024-125062Total365086

ddPCR敏感性: 83.3%特异性: 94%一致率: 89.5%Plasma(ddPCR)Tumortissue

(ARMS)Total+-+30333-64753Total365086

AR