药品微生物检验技术 课件 模块三 项目二 抗生素效价测定

《药品微生物检验技术》模块三药品有效性检查项目二抗生素效价测定

任务一庆大霉素溶液的制备

任务二双碟的制备与加药培养

任务三数据处理与结果判断

目录项目二抗生素效价测定任务一庆大霉素溶液的制备

任务引入请思考抗生素标准品的效价单位是明确标明的。配制标准品溶液时称量的标准品数量无法预先确定，如何根据标准品的称量数量计算出缓冲液的用量，配制出准确浓度的抗生素标准品溶液？某制药企业生产了一批硫酸庆大霉素片，为了知道这批硫酸庆大霉素片的抗菌效力，需要进行效价测定。用什么方法测定硫酸庆大霉素片的效价？效价测定对环境、操作员有什么要求？

任务分析本任务以庆大霉素标准品与供试品母液的配制为例，介绍抗生素效价测定缓冲液、供试品溶液和标准品溶液的配制，工作内容及要求见下表。工作内容工作要求关键点缓冲液的配制选择正确缓冲液、配制正确计算、称量、调剂pH、分装、灭菌供试品溶液的配制称量准确、稀释操作准确称量、溶解、定容、稀释标准品溶液的制备方法正确、完成制备称量、溶解、定容、稀释相关知识-缓冲液的配制庆大霉素标准品所需缓冲液为pH值为7.8的无菌磷酸盐缓冲液，其成分与配制方法如下：

取磷酸氢二钾5.59ｇ与磷酸二氢钾0.41ｇ，加水使成1000ｍＬ，滤过，在115℃灭菌30min。缓冲液的配制流程计算用量称量溶解分装灭菌磷酸氢二钾磷酸二氢钾任务实施一、制订工作计划序号工作内容完成时间成员负责人1缓冲液的配制

2供试品溶液的配制

3标准品溶液的制备

根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。任务实施二、试验前准备设备、器材、试剂规格数量用途高压蒸汽灭菌器

灭菌溶液电子天平、无菌药匙

称量试剂无菌烧杯、无菌玻璃棒、无菌研钵、无菌容量瓶、无菌移液管

溶解、稀释溶液无菌具塞容量瓶

分装溶液磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、蒸馏水

配制缓冲液庆大霉素片、庆大霉素标准品、无菌水

配制供试品、标准品无菌室、超净工作台、酒精灯、75%酒精

操作场所冰箱

保藏溶液补充1：

补充2：

任务实施三、试验操作序号步骤操作内容1选器具高压蒸汽灭菌器、电子天平、1000mL烧杯、100mL无菌烧杯、无菌玻璃棒、无菌药匙、容量瓶2取试剂取磷酸氢二钾一瓶、磷酸二氢钾一瓶、蒸馏水3称量电子天平称量磷酸氢二钾___g与磷酸二氢钾____g于小烧杯中4溶解加水溶解，转移至大烧杯中，润洗___遍，加水使至____mL5分装将上述配制好的缓冲液分装至____只___mL容量瓶中，加塞，包扎6灭菌将包扎好的缓冲液放入高压蒸汽灭菌器中，___℃,灭菌___min7保藏取出灭菌好的缓冲液，放至于_____保藏待用无菌磷酸盐缓冲液的制备任务实施三、试验操作记录供试品与标准品溶液的配制过程序号步骤操作内容1选器具电子天平、100mL无菌烧杯、无菌玻棒、无菌研钵、100mL无菌容量瓶、无菌移液管、无菌药匙2选药品庆大霉素片、庆大霉素标准品、无菌水3称量庆大霉素取___片庆大霉素片，称量每片的重量，计算平均片重为______将_____片药片放入无菌研钵中进行研磨，研细称取_____g药粉于____mL无菌烧杯中4缓冲液用量的计算庆大霉素片每mg的单位为________U，根据称取的庆大霉素粉末的量，缓冲液应为______mL5初溶导入容量瓶加入移液管取____mL无菌水至烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌使药粉溶解，引流转移至____mL容量瓶中6洗烧杯合并洗液用定量的无菌水润洗烧杯____次，将润洗液转移至容量瓶中与初溶液合并7定容用上述计算的缓冲液的量，减去初溶与润洗烧杯的量，得出应加入的缓冲液的余量，将余量加入容量瓶即得8保藏将配置好的母液放于______中备用任务测评序号考核内容考核标准配分得分1无菌磷酸盐缓冲液的制备正确计算并称量试剂10

正确配制缓冲液10

能完成缓冲液的灭菌操作5

正确保藏无菌缓冲液5

2供试品溶液的配制正确计算并称量药品10

正确操作药品的溶解与定容10

正确保藏供试品母液5

3标准品溶液的制备正确计算并称量标准品10

正确操作标准品的溶解与定容10

正确保藏标准品母液5

4清场能正确完成实训室的清场10

能正确完成无菌室的清洁10

合计100项目二抗生素效价测定任务二双碟的制备与加药培养

任务引入请思考根据试验设计的不同，抗生素微生物检定法中的管碟法分为二剂量法和三剂量法。其中，二剂量法测定抗生素效价的流程包括哪几步呢？制备双碟时，不同的抗生素使用的试验菌及其培养基又是如何确定的呢？管碟法二剂量法三剂量法测定抗生素效价的流程？任务分析

根据庆大霉素质量标准项下规定的检测方法，本任务参照《中国药典》2020年版四部通则中抗生素微生物检定试验设计表，选择庆大霉素对应的试验菌与培养基配方，进行双碟与不锈钢小管的检测与清洗、培养基的制备与保藏、试验菌的培养及菌悬液的配制、双碟的制备、不锈钢小管的放置等试验。具体见下表：相关知识-双碟、不锈钢小管的检测与清洗1.双碟水平的检测可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面是否平整。2.不锈钢小管的检测用游标卡尺测量不锈钢小管的高度、内径和外径，要求其内径为6.0mm+0.1mm，高度10.0mm+0.1mm，外径为7.8mm+0.1mm3.双碟与不锈钢小管的清洗在清洗时要注意多用流水冲洗，160℃干热灭菌2h后备用。相关知识-无菌培养基的配制无菌培养基的配制流程计算用量称量溶解调节pH值分装灭菌庆大霉素微生物检定所用培养基为pH值为7.8-8.0的Ⅰ号培养基，其配制方法如下：混合胨(5g)、牛肉浸出粉(3g)、磷酸氢二钾(3g)、水(1000mL)，调节pH值使比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂(15-20g),加热溶化后过滤，调节pH值使灭菌后为7.8-8.0，在115℃‘灭菌30min。相关知识含菌培养基的制备可庆大霉素微生物检定对应的试验菌为短小芽孢杆菌，其菌悬液制备方法如下：取短小芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在３５†３７‘培养７天，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢８５Û以上。用灭菌水将芽孢洗下，在６５‘加热３０ｍĖｎ，摇匀，备用双碟的制备加底层加菌层加不锈钢小管相关知识抗生素溶液滴加及双碟培养稀释抗生素标准品与供试品溶液滴加抗生素溶液培

养任务实施一、制订工作计划序号工作内容完成时间成员负责人1双碟、不锈钢小管的检测与清洗

2无菌培养基的制备与保藏

3含菌培养基的制备

4双碟的制备5抗生素溶液滴加及双碟培养根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。任务实施二、试验前准备任务实施三、试验操作按照表3-2-10记录双碟、不锈钢小管的检测与清洗过程。任务实施三、试验操作按照表3-2-11记录无菌培养基的制备与保藏过程。任务实施三、试验操作按照表3-2-12记录含菌培养基的制备过程。任务实施三、试验操作按照表3-2-13记录双碟的制备过程。任务实施三、试验操作按照表3-2-14记录抗生素溶液滴加及双碟培养过程。任务测评项目二抗生素效价测定任务三数据处理与结果判断

任务引入抗生素微生物检定法中，由于各种原因，可能出现某个数据缺失或个别数据特别大、特别小的现象，在一定数量范围内，可以根据其他数据，通过计算补齐或者用计算出的数据替代特别大或特别小的数据。如果由于操作不规范或其他原因，测出数据的可信限率超过规定标准，说明误差过大，这种情况下测出的数据能使用吗？是否需要重新试验呢？误差过大？重新试验？请思考任务分析本任务的工作内容及要求见下表：相关知识1.将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，换上玻璃盖，用游标卡尺测量抑菌圈直径。2.或者将换好玻璃盖的双碟４个放入扫描仪相应的位置，推入抽屉扫描测得抑菌圈直径，见右图。将测出的数据记录于下表中。一、抑菌圈直径的测量与记录使用扫描仪进行抑菌圈的测量相关知识

将测量完抑菌圈的双碟在高压蒸汽灭菌器中灭菌后，除去培养物，将培养皿清洗、干燥后归位。二、培养物的处理三、数据处理特大、特小值的剔除：在同一剂量组内的各个反应值中，如果出现个别特大或特小的反应值，应进行异常值检验，以确定其是否应被剔除。检验异常值的方法很多，本任务中建议使用狄克森（Dixon)检验法。样本量（ｍ）当可疑反应值是最小值（ｙ１）当可疑反应值是最大值（ｙｍ）3-78-1011-13狄克森检验法异常值的J１、J2和J3计算公式相关知识三、数据处理特大、特小值的剔除：如果计算得到的J１、J2或J3值超出表3-2-21中给出的标准值，则判断为异常值，可考虑剔除。当同一组中的观察反应值数目大于13个时，本方法不适用。相关知识三、数据处理缺项补足：反应值被剔除或因故反应值缺失造成缺项，致各剂量组的反应个数ｍ不相等时，应根据试验设计类型补足缺项ｙ，使各剂量组ｍ相等。

ｙ＝(ＫＣ＋ｍＲ－Ｇ)／［(Ｋ－１)(ｍ－１)］

式中:Ｃ为缺项所在剂量组内的反应值总和

Ｒ为缺项所在行的反应值总和

Ｇ为全部反应值总和（均不包括剔除值）

Ｋ为标准品与供试品的剂量组之和

当剂量组内安排的区组数较多时，也可将缺项所在的整个区组除去。【例2】在例题１中的特大值剔除前，其所在剂量组的反应值总和为104.77，所在行的反应值总和为135.17，该次检测所得到的全部反应值总和为793.42。标准品与供试品各有4个剂量组。请补足剔除异常值之后的缺项ｙ。相关知识三、数据处理方差分析：根据表3-2-22的结果，计算差方和Ｑ、自由度f、误差项方差s2等。相关知识三、数据处理可靠性测验-剂间变异分析：通过对剂间变异的分析，测验标准品和供试品的剂量和反应的关系是否显著偏离平行直线。（2.2）法剂间变异分析包括试品间、回归、偏离平行３项，见表3-2-23。注：表中S1、S2、T1、T2分别为标准品和供试品每一剂量组内反应值的总和，相当于表3-2-22中∑y(k)各项；下角标1、2分别代表低剂量与高剂量。相关知识三、数据处理可靠性测验-剂间变异分析：将方差分析结果进行可靠性测验，见表3-2-24。相关知识三、数据处理可靠性测验-可靠性测验结果判断：回归项应非常显著（Ｐ＜0.01），偏离平行应不显著（Ｐ＞0.05）。试品间项不作为可靠性测验的判断标准，试品间变异非常显著者，重复试验时，应参考所得结果重新估计供试品的效价或重新调整剂量试验。效价（PT）及可信限（FL）计算：可信限（FL）标志检定结果的精密度，Ｒ与PT的可信限率(FL%)是其可信限的高限与低限之差除以２倍效价均值后的百分率。按表3-2-25计算各数值，代入公式计算Ｒ、P