线粒体功能课件

线粒体功能及其检测

线粒体结构外膜(outmembrane)膜孔蛋白（porin）、离子通道蛋白以及Bcl-2家族蛋白。由膜孔蛋白构成的亲水通道，允许分子量为5KD以下的分子通过，1KD以下的分子可自由通过。膜间隙(intermembranespace)

细胞色素C电压依赖性阴离子通道(VDAC)、ADP/ATP转换蛋白。线粒体膜转运孔道(mitochondrialpermeabletransitionpore，MPTP)存在于内外膜接触点。凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor，AIF)和Procaspase2、3、9及其他酶蛋白。基质（matrix）三羧酸循环：除糖酵解在细胞质中进行外，其他的生物氧化过程都在线粒体中进行。催化三羧酸循环，脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中。线粒体基因组：基质具有一套完整的转录和翻译体系。包括线粒体DNA（mtDNA），70S型核糖体，tRNAs、rRNA、DNA聚合酶等。存储钙离子的致密颗粒。线粒体DNA线粒体基因组哺乳动物的线粒体基因DNA没有内含子，几乎每一对核苷酸都参与一个基因的组成。线粒体基因组能够单独进行复制、转录及合成蛋白质。仅有少数线粒体蛋白质是由mtDNA编码，大多数线粒体蛋白质（90%）还是由核DNA编码。线粒体功能能量供应氧化应激凋亡钙储池细胞周期、信号转导肿瘤发育等线粒体与能量供应细胞有氧呼吸和供能的场所，供应细胞生命活动95%的能量。线粒体的主要功能是把氧化各种底物产生的自由能转化为可被细胞直接利用的形式－ATP。线粒体具有能量代谢与自由基代谢两条途径。①燃料分解（胞质中）②乙酰CoA生成③三羧酸循环(线粒体基质)④电子传递和氧化磷酸化(内膜上)生成ATP葡萄糖脂肪酸氨基酸线粒体是细胞中产生活性氧的一个重要部位，消耗氧用于合成ATP的同时不可避免地产生活性氧。氧化应激作用下，膜转运孔道开放造成线粒体基质内的高渗透压，使线粒体内外H+梯度消失，呼吸链脱偶联，能量产生中断。还会由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜破裂，通透性增高，释放出包括细胞色素C在内的各种活性蛋白。过多自由基的产生可导致mtDNA的损伤，氧化损伤是mtDNA突变的主要原因。线粒体本身也极易受氧化应激的攻击。活性氧在启动和调节细胞凋亡的过程中扮演着重要的角色。活性氧的积累可以导致：线粒体膨大，线粒体内膜非特异性孔道产生；细胞色素C从内膜脱落并进入到胞质中；BAX表达，caspase活化等。这些都是启动细胞凋亡的因素。线粒体与凋亡从线粒体释放的细胞色素C与凋亡诱导因子、Procaspase9结合在一起形成“凋亡体”（Apoptosome），导致Caspase9和Caspase3的激活。内膜Bcl-2家族蛋白调控紊乱。Caspases激活、胞浆Ca++水平升高、产生神经酰胺，直接或间接地引发膜转运孔道持续开放。ROS－膜转运孔道持续开放－凋亡钙储池线粒体功能紊乱线粒体病（primarygeneticdefects）线粒体病理性损伤mtDNA突变(点突变、缺失、插入）导致线粒体功能缺陷。如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病、老年性痴呆、帕金森病、糖尿病等。mtDNA突变随着年龄累积。mtDNA突变呼吸链复合体I～IV活性下降ATP合成减少氧自由基产生增多钙稳态失衡脂质氧化增强线粒体功能变化II型糖尿病胰岛β细胞线粒体参与胰岛素分泌、胰岛素抵抗的形成。线粒体是高血糖时细胞ROS的重要来源。线粒体氧自由基增多与糖尿病微血管并发症的发病机制相关。线粒体本身受氧化应激攻击，导致mtDNA合成减少、发生突变。Nitrotyrosinelevel(硝基酪氨酸,markerofoxidativestress)complexIandcomplexVATP/ADPratioUncouplingprotein-2(UCP-2)expressionmembranepotentialM.Anelloetal.Functionalandmorphologicalalterationsofmitochondriainpancreaticbetacellsfromtype2diabeticpatients.Diabetologia,(2005)48:282–2897cases,clinicaldiabeteswas5.6±0.6years胰岛组织:8-羟基脱氧鸟嘌呤

(8-OHdG，kidneyandurine)MitochondrialDNADeletionCOXI/COXIV(mtDNA/nDNA)MaikoKakimoto,ToyoshiInoguchi,ToshiyoSonta.Accumulationof8-Hydroxy-2’-DeoxyguanosineandMitochondrialDNADeletioninKidneyofDiabeticRats.Diabetes51:1588–1595,2002STZrats,观察时间：4，8周肾组织:NADHdehydrogenase(complexI)cytochrome-coxidase(complexIV)COXImtDNAlevelsmtDNAdeletionDirkLebrecht1,BernhardSetzer1,RolfRohrbach,etal.MitochondrialDNAanditsrespiratorychainproductsaredefectiveindoxorubicinnephrosis.NephrolDialTransplant,2004,19:329–336doxorubicinnephrosisrats肾组织：ATP膜转运通道开放程度cytochromeccaspase3Ca++PerazaMA,etal.Morphologicalandfunctionalalterationsinhumanproximaltubularcelllineinducedbylowlevelinorganicarsenic:evidencefortargetingofmitochondriaandinitiatedapoptosis.JApplToxicol.2006,26(4):356-67体外培养肾小管上皮细胞线粒体功能检测enzymeactivityassays(分光光度法)

NADH(complexI),succinatedehydrogenase(complexII)细胞色素c还原酶(complexIII)

COX(complexIV)ATP（luciferin/luciferase发光法，核磁共振法）呼吸控制率(ATP合成功能，氧电极法)能量供应氧化应激8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG，ELISA法)ROS(分光光度法)glutathioneandcoenzymeQ(分光光度法,HPLC)细胞色素C含量（westernblot)caspase-9andcaspase-3(分光光度法)BCL-2(免疫组化，w