新陈代谢 酶1学习课件

第二章酶Enzyme第一节酶的概念一、酶的概念

酶是活细胞产生的,能在体内或体外起同样催化作用的生物分子,又称生物催化剂(biocatalyst)。绝大多数的酶是蛋白质，称这类酶为enzyme;具有催化功能的RNA被称为核酶(ribozyme)；具有催化功能的DNA被称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。二、酶催化作用的特点（一）酶具有一般催化剂的特征

1.只能催化热力学上允许进行的反应；

2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；

3.用量少，反应中本身不被消耗；

4.通过降低活化能加快化学反应速度。（图）一般催化剂反应活化能反应总能量变化酶促反应活化能非催化反应活化能初态终态能量改变活化过程酶促反应活化能的改变过渡态化学反应自由能方程式ΔG=ΔH–TΔS（ΔG是总自由能的变化，ΔH

是总热能的变化，ΔS是熵的变化）当ΔG＞0，反应不能自发进行。当ΔG＜0，反应能自发进行。活化能（ΔGӨ）：分子由常态转变为活化状态(过渡态)所需的能量。是指在一定温度下，1mol反应物全部进入活化状态所需的自由能。（二）反应速率理论与活化能

♦化学反应的实质:旧键断裂和新键形成过程。

♦2种反应速率理论：碰撞理论、过渡态理论

碰撞理论——分子必须经过有效碰撞才能发生反应。只有具有足够平动能的活化态分子才能发生有效碰撞。

过渡态理论——化学反应不仅需要碰撞而且须经一个短暂的过渡态或活化复合体（）才能形成产物。中间产物学说(Henri和Wurtz,1903)E+SESE+P（三）酶通过降低活化能提高反应速率促使化学反应进行的途径：用加热或光照给反应体系提供能量;使用催化剂降低反应活化能。

由于形成不稳定的ES,可有效降低发生反应的活化能,从而解释酶催化的高效性中间产物存在的证据：1.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）2.同位素32P标记底物法(磷酸化酶与葡萄糖结合)

3.电镜观察法(核酸与其聚合酶结合)H2O2

＋AH2

A

＋2H2O

过氧化物酶

过氧化物酶＋H2O2[过氧化物酶

·H2O2]

[过氧化物酶

·H2O2]+AH2

过氧化物酶＋A＋2H2O

（POD在645、583、548、498nm处有4条吸收带）（POD与H2O2混合液只在561、530.5nm处有2条新吸收带）（POD、H2O2与氢供体混合液反应后重现原来的4条吸收带）♦形成酶-底物复合体（ES和EX

等）

过渡态是一个不稳定的化学状态，不应同反应中间物ES、EP混淆，它仅仅是反应分子经历的一个短暂瞬间，旧键断裂、新键形成和电荷变化等事件都发生在这一刻。

♦邻近效应和定向效应

♦底物形变和诱导契合酶通过与底物结合，能有效降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。（四）酶既作催化剂，又充当偶联反应的介体

酶不能催化单独的非自发反应，只能选择适当的途径把吸能反应和放能反应在能量上联系起来，使每一步都成为热力学上可能发生的反应，并催化它们。（五）酶的催化特性

1.高效性：通常比非生物催化剂的催化效率高106~1013倍。2H2O22H2O+O21mol过氧化氢酶5×106molH2O2/s1mol离子铁6×10-4molH2O2/s75.34848.9768.372无催化剂胶态钯过氧化氢酶活化能（kJ/mol）催化剂

不同催化剂存在下过氧化氢分解反应的活化能

据计算，在25℃时活化能每减少4.184kJ/mol（1kCal/mol），反应速度可增高5.4倍。酶与一般催化剂催化效率的比较底物催化剂反应温度(℃)反应速度常数尿素

H+627.4

10-7

脲酶

215.0

106过氧化氢

Fe2+2256

过氧化氢酶

223.5

107

2.高度专一性：酶对底物具有严格的选择性。

即：一种酶只能催化一种或一类结构相似的化合物发生一定的反应。

3.酶活性可被调节控制：（1）酶量调节；（2）激素调节；（3）反馈抑制调节；

为P所抑制

A―‖→B→C→D→P（终产物）

↑……↑图通过终产物可逆的结合对途径中的第1个酶反馈抑制

酶胞外酶胞内酶（4）抑制剂和激活剂的调节；（5）其他调节方式(别构调节、酶原的激活、酶的可逆共价修饰、同工酶)

4.酶易失活：对环境条件极为敏感。高效性酶在活性中心与底物结合专一性反应条件温和对反应条件敏感，容易失活受到调控许多酶的活性还需要辅助因子的存在，作为辅助因子的多为维生素或其衍生物。酶特有的催化性质P.125-129第二节酶的化学本质一、大多数酶是蛋白质

1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。酶是蛋白质的证据。二、酶的化学组成酶单纯酶结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子辅因子辅酶:与酶蛋白结合比较松驰的小分子有机物辅基:与酶蛋白结合比较紧密的小分子有机物金属离子★金属离子：(1)作为酶活性部位的组成部分，(2)帮助形成酶活性所必需的构象★辅酶或辅基：通常作为电子、原子或某些化学基团的传递载体★酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分三、单体酶、寡聚酶和多酶复合体1.单体酶（monomericenzyme)：仅有一条多肽链的酶，或由几条多肽链以链间二硫键连接成的共价整体。－－一般都是参与水解反应的酶。2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成的酶。－－亚基之间以非共价键结合，单个亚基没有催化活性。3.多酶复合体(multienzymecomplex)：几个酶靠非共价键镶嵌而成的复合体。－－酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应,有利于提高酶的催化效率并便于对酶的调控。丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱羧酶（EⅠ）二氢硫辛酸乙酰移换酶（EⅡ）二氢硫辛酸脱氢酶（EⅢ）EⅠEⅡEⅢ碱性EⅠEⅡEⅢ+EⅡEⅢ+脲

1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质,还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。四、核酶（ribozyme）

核酶催化的基本反应：磷酸基团转移（转酯）、磷酸二酯键水解。1.Ribozymes的发现

1981～1982年，Colorado大学的Cech等人

研究Tetrahymena

thermophiea（嗜热四膜虫）rRNA前体加工成熟时，发现具有催化活性（自我剪切功能）的天然RNA。

1983年，Altman等人

在研究E.coli

RNAseP时发现M1RNA377nucleotides(nt)具有切割rRNA前体的功能

1986年，T.Cech又发现L19RNA在一定的条件下能以高度专一性方式催化寡核苷酸底物的切割与连接。

基于Cech和Altman的创造性工作，将这类具有酶一样的催化功能，本质上不是蛋白质而是RNA的生物大分子定义为Ribozymes。该发现曾被认为是生化领域内最令人鼓舞的发现之一，为此Cech和Altman共同荣获1989年度诺贝尔化学奖。2.rRNA前体的自我剪接与L19RNA的催化作用

Cech小组研究四膜虫26srRNA基因转录时发现:

在鸟苷（或5΄-GMP）和Mg2+存在下，几分钟内切去413nt的内含子片断

成熟的rRNA

＋内含子（413nt

）上述整个过程在没有任何蛋白质和酶的情况下进行rRNA前体（不稳定）四膜虫rRNA前体自我剪接机制－L19RNA的形成5΄-GMP(或G)的3΄-OH充当亲核基团攻击5΄断裂点5΄外显子的3΄-OH成为亲核基团，完成剪接反应L19RNA或L19IVS，即减19线状间插序列L19RNA的形成－19nt

L19RNA：具有高度的专一性服从Michaelis-Menten动力学规律

Km＝42×10-6M(以C5为底物，催化其水解)

kcat＝33×10-3s-1

kcat/Km=10-3M-1·L·s-1与RNaseA极其相似脱氧C5是其竞争性抑制剂

Ki=260×10-6M

这些都是经典酶催化作用特征L19RNA核苷转移酶磷酸二酯酶磷酸基转移酶磷酸酯酶L19RNA具有多种酶的功能转核苷酸作用

2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC＋CpCpCpC

（C5）（C6）（C4）水解作用

CpCpCpCpC

CpCpCpC＋pC

（C5）（C4）转磷酸作用CpCpCpCpCp＋UpCpU

CpCpCpCpC＋UpCpUp

（C5）

（C5）去磷酸作用

CpCpCpCpCp

CpCpCpCpC＋Pi

（C5）

RNA限制性内切酶作用

5'~~~~~~~CpUpCpUpN~~~~~~~3'+G

5'~~~~~~~CpUpCpU

＋GpN~~~~3‘

(与DNA限制性内切酶相似)与DNA限制性内切酶相似3.RNaseP

1972年，在E.coli中首先发现RNaseP；

1978年，S.Altman发现：RNA（RNaseP-RNA)蛋白质（RNaseP-Protein)

RNaseP

1983年，Altman和Pace发现：

RNaseP可催化tRNA的加工单独的RNA部分就可催化tRNA加工

tRNA前体5'端成熟的tRNARNasePRNaseP-RNA

RNaseP（active）

Protein（inactive）

RNA

RNaseP（active）

10mMMg2+720mMMg2+

（inactive）（active）

分离出来的RNA分子体外转录的RNA分子均具有催化活性4、锤头核酶5、Ribozyme发现的意义改变了人们长期对生物催化剂的概念

EnzymesProteins生物催化剂Enzymes（Proteins）

Ribozymes（RNAs）对生命系统起源的争论有重要启示蛋白质核酸？？Ribozymes可作为RNA限制性内切酶

(RNA限制性内切酶具有催化功能的特异性)接近DNA限制性内切酶高于RNA限制性内切酶利用Ribozymes这种特性发展一套RNA限制性内切酶，应用于RNA分子生物学研究。关于DNA限制性内切酶：指在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶，简称限制酶，可用于特异切割DNA，是很有用的工具酶。Ribozymes作为抗病因子

根据不同生物来源的靶RNA序列（只有含有GUX，其中X可以为

A、U和C中的任一个），作为底物设计不同的Ribozyme。

利用基因工程技术进行克隆，或作为目的基因转入到植物、动物和微生物中使其在体内表达，有效地抑制相应的靶RNA，从而达到抗病毒和基因治疗的目的。人工合成它们的序列。

Sarver等人以HIV-1的gagRNA为靶分子设计了定点切割特异性的Ribozyme。在无细胞体系中发现转录的Ribozyme能有效、精确地切割HIV-1RNA。构建Ribozyme基因在5’端为人肌动蛋白启动子和3’端为SV40PolyA的哺乳动物表达载体中导入HeleCD4细胞中。当HIV-1病毒侵入转化的HeleCD4细胞，表现出明显的抗HIV-1的侵染能力－－9个月无细胞毒性。

1995年，JackW.Szostak

研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称之为脱氧核酶(deoxyribozyme)，为生物催化剂的发展作出了新的贡献。一、酶的命名两种命名方法：系统名称、惯用名称。系统名称：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸:NAD+氧化还原酶惯用名称：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。丙氨酸:

-酮戊二酸氨基转移酶谷丙转氨酶第三节酶的命名与分类二、酶的分类与编号1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：1.氧化还原酶类（oxido-reductases）：催化氧化还原反应的酶。－－主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应AH2+BA+BH2（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。AH2

+BA+BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）（2）氧化酶类①催化底物脱氢，并氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）过氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）RH+O2+还原型辅助因子ROH+H2O+氧化型辅助因子（又称羟化酶）2.转移酶类(transferases)：催化分子间基团转移的酶。A·X+BA+B·X根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶类(hydrolases)：催化水解反应的酶。AB+H2OAOH+BH水解酶类大都属于胞外酶，在生物体内分布最广，数量也多4.裂合酶类（lyases）：催化非水解性地除去分子中的基团及其逆反应的酶。CH3C=OCOOHC—C键CH3C=OH+CO2C—O键CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OC—N键COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+

NH35.异构酶（isomerases）：催化分子异构反应的酶。AB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。6.合成酶类（或连接酶类,synthetases或ligases）：催化有ATP参加的合成反应(即两个分子合成一个分子)的酶。A+B+ATPA·B+ADP+Pi想一想：如何区分合酶与合成酶？

合酶催化的反应是缩合反应（属于第四类酶），并没有与ATP的水解相偶联；合成酶属于第六类酶，所催化的反应一定与ATP或者它的等价物的降解相偶联。乳酸脱氢酶

EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团为CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的顺序号关于酶表——酶的编号：

+NAD+

+NADH+H+举例：乳酸脱氢酶（EC1.1.1.27）CH3C=OCOOHCH3CHOHCOOH

第四节酶的专一性酶的专一性(specificity)就是指酶对它所作用的底物的严格的选择性。即:酶只能催化一种或一类底物,发生一定的化学变化,生成一定的产物。结构专一性相对专一性绝对专一性键专一性基团专一性立体异构专一性旋光异构专一性（D-、L-）几何异构专一性(顺、反异构)酶的专一性一、结构专一性

1.相对专一性：作用于一类化合物或一种化学键。如脂肪酶、磷酸酯酶和蛋白水解酶等。（1）键专一性：只对其底物分子中所作用的键

要求严格，而对键两端的基团没有选择性。酯酶：R—C—O—R′+

H2OORCOO-+ROH+H+

′（2）

基团（族）专一性：酶对底物分子的要求较高,不仅要求底物具有一定的化学键，而且对键一端的基团有特殊要求。OCH2OHOHOHOH15α-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH基团专一性2.绝对专一性：只能作用于某一底物脲酶：H2N—C—NH2+H2OO2NH3+CO2凝血酶作为一种特殊的蛋白酶只作用于蛋白分子中精氨酸残基的羧基与甘氨酸残基形成的肽键。---Arg-Gly----过氧化氢酶

二、立体异构专一性

当底物具有立体异构体时，酶只能催化一种异构体发生某种化学反应，而对另一种异构体无作用。旋光异构专一性如：乳酸脱氢酶只能催化L-乳酸脱氢变成丙酮酸；

D-氨基酸氧化酶只能作用于各种D-氨基酸，催化其氧化脱氨；

胰蛋白酶只作用于L-氨基酸残基构成的肽键或其衍生物。乳酸脱氢酶2.几何异构专一性(顺反异构专一性)如琥珀酸脱氢酶只能催化丁二酸脱氢生成反-丁烯二酸的可逆反应。FADH2FAD丁二酸(琥珀酸)延胡索酸(反-丁烯二酸)延胡索酸酶——顺反异构专一性再如延胡索酸酶只能催化延胡索酸即反-丁烯二酸水合成苹果酸。研究酶的专一性的意义

理论上，专一性－－弱键和结构互补成为理解生物大分子之间相互作用的基石。

实践上也有重要意义。例如，某些药物具有某一种构型才有生理效用，而有机合成的是消旋混合物,若用酶可以进行不对称合成或不对称拆分，即得到单一构型的药物。锁钥学说（Fisher，1890）：酶的活性中心结构与底物的结构须非常吻合,如同锁和钥匙一样,紧密结合成中间络合物。三、关于酶专一性的假说底物S酶E酶-底物复合物(ES)锁钥学说“三点附着”学说：底物在酶活性中心的结合有3个结合点，只有当在这3个结合点都匹配时，酶才会催化相应的反应。3.诱导契合学说（Koshland，1958）：酶分子是高柔性的动态构象分子,当酶分子与底物接近时,酶分子的构象因受底物诱导而发生有利于与底物结合的变化；酶分子也使底物构象发生改变，促使形成酶–过渡态复合体（EX≠）。诱导契合学说底物S酶E酶-底物复合物（

ES）SEE-S复合物abcabcES诱导契合学说第五节酶活力的测定和分离纯化一、酶活力的测定酶的活力是酶加速其所催化的化学反应速度的能力

测定酶的活力本质上就是测定酶促反应进行的速度，其大小用在一定条件下所催化某一反应的反应速率来表示。

酶促反应速度越大，酶的活力就越强；反之，反应速度越小，酶的活力就越弱

1、酶活力（酶活性）（一）酶活力、活力单位和比活力２、酶活力单位——表示酶量多少的单位为了统一酶的国际单位，国际生化协会酶学委员会于1961年建议：

1个酶的国际单位，简称酶单位（Ｕ），是在规定的条件（温度一般为25℃，其他条件为最适条件）下，每分钟催化1µmol底物转化为产物的酶量（IU的量纲为µmol·min-1）。

1972年，国际生化协会酶学委员会推荐了一个新单位“katal”（简称kat,以便和国际单位制SI取得一致）。

一个“Katal”是指在最适条件下，1秒钟催化1mol产物形成所需要的酶量。

Kat和U的换算关系如下：

1kat

＝60×106U＝6×107U

1U＝16.67nkat３、酶的比活力比活力（比活性）是指每单位质量样品（酶蛋白）中的酶活力单位数，即每mg蛋白质中所含的U数或每kg蛋白质中含的kat

数；有时用单位体积中的酶活力单位表示比活力。酶的比活力即表示酶的含量（纯度），是表示酶制剂纯度的一个指标。如在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。（二）酶反应速率、初速率和酶活力测定

用一定时间内底物减少或产物生成的量表示酶促反应速度，单位为mol/min等。时间产物生成量初速度酶促反应速度逐渐降低

测定酶活力时必须要注意：

（1）测定的反应速度必须是反应初速度v0。否则，不可能得到准确结果。（2）酶反应速度受环境条件的影响。在测定酶活力时，要维持在一套固定条件下进行。

测定反应的初速度：在酶促反应开始无任何干扰因素出现时,短时间内酶的反应速度为反应初速度。一般指反应底物消耗5%以内时的反应速率。

102030405060（min）产物生成量酶反应进程曲线反应速度逐渐降低的原因：①底物浓度的降低；②产物的生成逐渐增大了逆反应；③酶在反应中失活；④产物对酶